專利名稱：：鼠傷寒沙門氏菌pcr檢測方法及其中的核酸和引物對的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種食品安全檢驗
技術(shù)領(lǐng)域：
的PCR檢測方法及其中的核酸和引物對，具體是一種鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法及其中的核酸和引物對。
背景技術(shù)：
：鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium)是在1892年由Loffler從鼠身上分離出的，是最常見的沙門氏菌感染血清型之一。鼠傷寒沙門氏菌屬于沙門氏菌屬的B群，其生物學特征與傷寒桿菌相似，為革蘭氏陰性菌，不形成芽胞，無莢膜，但有鞭毛。該菌在進化過程中形成了三個變種，即哥本哈根變種、賓斯變種及0型變種。鼠傷寒沙門氏菌對外界環(huán)境的抵抗力較強，常溫下可迅速繁殖，在低溫、干燥的環(huán)境中可存活，但不耐熱，高溫可滅活，對酸、紫外線和各種化學消毒劑敏感。鼠傷寒沙門氏菌在自然界分布較廣，許多家禽、家畜、鼠類和野生鳥類的腸道中儲有這種細菌。這些動物和帶菌人群成為主要的傳染源，蒼蠅、跳蚤是其傳播媒介。在臨床，鼠傷寒沙門氏菌感染多發(fā)生于嬰幼兒，主要病癥為發(fā)熱、惡心、嘔吐和腹瀉。鼠傷寒沙門氏菌的檢測主要是依靠傳統(tǒng)的培養(yǎng)的方法(可參見國標GB/T4789.4-2008)，正如劉振湘在《特產(chǎn)研究》2007年第1期第5657頁發(fā)表的題為"白鷺鼠傷寒沙門氏菌的分離與鑒"文中提及，該方法需經(jīng)選擇性增菌培養(yǎng)，并通過生化反應及血清學測試來鑒定，雖然結(jié)果可靠，但是操作復雜，費時費力，通常要35天才能得出檢測結(jié)果，不利于及時診斷病因，查找病源，控制病情的蔓延。為了能夠快速、準確、簡便的檢驗鼠傷寒沙門氏菌，以分子生物學為基礎(chǔ)的檢測方法在實踐檢驗中不斷取得新進展，成為取代傳統(tǒng)檢測方法最具潛力的檢測方法之一。PCR技術(shù)以其操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強等特點，逐步應用于沙門氏菌的檢疫之后，對沙門氏菌病的診斷和防治工作起到了積極作用。但是只針對鼠傷寒沙門氏菌血清型檢測的PCR方法極少，檢測靶點的特異性不強，如LimYH，HiroseK，IzumiyaH等在《JapaneseJournalofInfectiousDiseases》(日本傳染病雜志)2003年第56巻第4期第151155頁發(fā)表的題為《MultiplexpolymerasechainreactionassayforselectivedetectionofSalmonellaentericaserovartyphimurium》(多重PCR方法對鼠傷寒沙門氏菌的選擇性檢測)一文中所述，根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌的血清型04:Hi:l，2而采用相應編碼H抗原的鞭毛基因？iC和？JB以及0抗原基因rfbj組成多重PCR來檢測鼠傷寒沙門氏菌，增加了檢測復雜性，引物之間的干擾容易影響檢測靈敏度的提高，血清型相近的菌株會對最終結(jié)果的判定帶來困難。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，尚未發(fā)明與本發(fā)明的鼠傷寒沙門氏菌血清型PCR檢測方法、核酸及引物有關(guān)的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法及其中的核酸和引物對。采用本發(fā)明的檢測方法檢測鼠傷寒沙門氏菌，檢測時間短，成本低，更加具有實用性，檢測結(jié)果特異，結(jié)果判定簡單。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明涉及一種鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法，包括如下步驟步驟一，根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌的基因組DNA序列中的保守序列SEQIDNO:1設(shè)計擴增引物；步驟二，提取樣品DNA，PCR法擴增；步驟三，凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，判斷樣品是否含有鼠傷寒沙門氏菌；所述判斷具體為如果電泳結(jié)果出現(xiàn)相應的單一擴增條帶，則說明樣品中含有鼠傷寒沙門氏菌；如果沒有出現(xiàn)相應的單一擴增條帶，則樣品中不含有鼠傷寒沙門氏菌。步驟一中，所述引物具體為正向引物的序列如SEQIDN0:2所示，反向引物的序列如SEQIDNO:3所示。步驟二中，所述PCR法中，PCR檢測體系具體為25iiL反應體系具體為，10XPCR反應緩沖液2.5iiL，25,1/L的Mg2+2.0iiL，2.5,1/L的dNTP1.0iiL，5iiM引物對1iiL，Taq酶1U，模板溶液取25iiL，最后補水至25yL。步驟二中，所述PCR法中，PCR檢測體系擴增參數(shù)具體為先94t:預變性5min，之后開始擴增循環(huán)，每個循環(huán)的程序為94t:變性30s，65t:退火30s，72t:延伸30s;循環(huán)共35個；循環(huán)結(jié)束后，72t:延伸10min，降溫至12"，結(jié)束。步驟三中，所述判斷具體為檢測凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物在915bp位置是否存在單一擴增條帶，如果存在，則說明樣品中含有鼠傷寒沙門氏菌；如果沒有，則樣品中不含有鼠傷寒沙門氏菌。本發(fā)明還涉及一種所述PCR檢測方法中涉及的核酸，該核酸的的堿基序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明還涉及一種所述PCR檢測方法中涉及的引物對，該引物對具體為堿基序列分別如SEQIDNO:2所示和如SEQIDNO:3所示的核酸。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果采用本發(fā)明的檢測方法檢測鼠傷寒沙門氏菌，檢測時間短，由于不用采用傳統(tǒng)檢測方法中必須使用的抗血清，降低了檢測成本；同時，本發(fā)明的檢測方法也可以用于檢測某些抗血清不能檢測出的菌株，如抗原不表達的菌株，彌補免疫檢測的缺陷，更加具有實用性；本發(fā)明的檢測靶點具有單一特異性，檢測結(jié)果特異，結(jié)果判定簡單。圖1為實施例1中PCR檢測方法特異性評價實驗凝膠電泳結(jié)果圖；圖2為實施例1中PCR檢測方法靈敏度評價實驗凝膠電泳結(jié)果圖。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。鼠傷寒沙門氏菌血清型PCR檢測方法的建立步驟一，根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌的基因組DNA序列中的保守序列設(shè)計引物從鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA序列中找到特異的STM4495基因，將之作為鼠傷寒沙門氏菌的檢測靶基因，基因序列如SEQIDNO:1所示；將限制性核酸內(nèi)切酶基因的DNA序列輸入到引物設(shè)計軟件PrimerPremier5.0中設(shè)計引物，設(shè)置GCX范圍為4060X，產(chǎn)物大小范圍為100lOOObp，從備選引物對中選擇出引物，引物序列如下(引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成)STM4-L:5'-GGTGGCAAGGGAATGAA-3，(SEQIDNO:2);STM4-R:5'-CGCAGCGTAAAGCAACT-3，(SEQIDNO:3);步驟二，DNA模板制備將鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌及豬霍亂沙門氏菌等各種血清型的沙門氏菌菌株(如表1所示)分別接菌至50mL的LB液體培養(yǎng)基中，在37。C增菌8h后，取ImL菌液，放入1.5mL離心管中；之后在3，000r/min離心10min，取上清液，再在12，OOOr/min離心5min，收集菌體。用無菌雙蒸水重新懸浮菌體，離心洗滌后加入100L無菌超純水，在沸水浴中煮15min，立即取出，在-20。C放置30min。在37。C解凍后，12，OOOr/min離心5min，取上清液放置-2(TC備用。步驟三，PCR檢測方法特異性評價實驗PCR檢測方法如下先加入16.liiL無菌水到反應管中，再依次加入IOXPCR反應緩沖液2.5iiL，25,l/L的Mg2+2.0iiL，2.5mmol/L的dNTP1.0iiL，5iiM弓|物1.0iiL，2.5U/yLTaq酶O.4iiL，最后加模板溶液2iiL，并以無菌水為模板作為反應的陰性對照。然后將反應管離心后，放入PCR反應儀中，按照以下PCR循環(huán)參數(shù)進行在94t:預變性5min，接著作35個循環(huán)，每個循環(huán)的程序包括94。C變性30s，退火溫度65。C，退火時間為30s，然后在72t:延伸30s，循環(huán)結(jié)束后在72t:延伸10min，最后降溫至12。C，結(jié)束所有操作程序。取16株鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌及豬霍亂沙門氏菌等沙門氏菌標準菌株及39株分離菌株(如表1所示，表中所示菌株均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過公開的渠道獲得的)，按照DNA模板提取方法，分別提取基因組DNA。每株菌株的DNA溶液均取2yL作為PCR反應模板添加到PCR反應體系中進行擴增反應。圖1所示為標準菌株的檢測結(jié)果，其血清型及菌株編號請參見附圖及附表說明。圖中泳道116:ASl.1174，ATCC14028，ATCC13311，ATCC51812，CMCC50335，CMCC50770，AS1.1190，ATCC9150，CMCC50004，ATCC13076，ATCC15611，ATCC9270，NCTC4840，ATCC12002，CMCC50017，NCTC6017;泳道17:ddH20;泳道M:200bp分子量標準。從圖1中可知，除了鼠傷寒沙門氏菌標準菌株AS1.1174，ATCC14028，ATCC13311，ATCC51812夕卜，其余血清型均沒有915bp特異擴增條帶。表1為16株標準菌株及39株分離菌株的PCR鑒定結(jié)果，從表1中可知，除了鼠傷寒沙門氏菌的標準菌株ASl.1174，ATCC14028，ATCC13311，ATCC51812和分離株外，其余沙門氏菌均沒有特異擴增條帶。表1中，_:PCR結(jié)果為陰性；+:PCR結(jié)果為陽性。表1特異性評價所用菌株及試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>SalmonellaParatyphiBCMCC500041—SalmonellaEnteritidisATCC130761—SalmonellaVelloreATCC156111—SalmonellaAnat咖ATCC927011—SalmonellaPoonaNCTC4840—SalmonellaTallahasseeATCC120021—SalmonellaHirschfeldiiCMCC500171—SalmonellaAbonyNCTC60171—SalmonellaTyphimurium4+SalmonellaTyphi1—SalmonellaParatyphiA1—SalmonellaInfantis2—SalmonellaChester1—SalmonellaGallinarum-Pullorum3—SalmonellaEnteritidis2—SalmonellaAgona2—SalmonellaMontevideo1—SalmonellaSenftenberg1—SalmonellaAbortus-gui1—SalmonellaRissen1—SalmonellaBraenderup2—SalmonellaKentucky3—SalmonellaOranieiiburg4—SalmonellaAnat咖3—步驟五，靈敏度評價試驗經(jīng)測定，鼠傷寒沙門氏菌總DNA溶液的濃度為65.7yg/mL，用無菌水作10倍梯度稀釋，共稀釋10個梯度，每個梯度分別取5L加入PCR反應體系，凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，在凝膠成像儀中觀察凝膠電泳結(jié)果，如圖2所示，圖中泳道110:DNA模板濃度分別為32.85ng，3.285ng，328.5pg，32.85pg，3.285pg，328.5fg，32.85fg，3.285fg，0.3285fg，0.033fg/PCR;泳道M:200bp分子量標準。由圖2可知，在第7條泳道可以看到清晰的條帶，所對應DNA濃度為32.85fg/PCR，而第8條泳道之后看不到擴增條帶。因此，判定PCR檢測靈敏度為32.85fg/PCR，具有較高的靈敏度。實施例2鼠傷寒沙門氏菌疑似菌株的檢測7利用實施例1建立的鼠傷寒沙門氏菌的PCR檢測方法，檢測了61株從食品樣品中分離的沙門氏菌疑似菌株，食品樣品采集于上海的城郊超市及集貿(mào)市場，樣品處理及疑似菌株的分離參見國標GB/T4789.4-2008。從中檢測出9株疑似菌株呈陽性結(jié)果，這9株疑似菌株經(jīng)沙門氏菌屬診斷血清(蘭州生物制品研究所)鑒定是04:Hi:5，判定其為鼠傷寒沙門氏菌(血清鑒定步驟請參見產(chǎn)品說明書及國標GB/T4789.4-2008)，其他疑似菌株經(jīng)鑒定都不是鼠傷寒沙門氏菌。通過本實施例證明，鼠傷寒沙門氏菌的PCR檢測方法具有非常高的可靠性。序列表〈110〉上海交通大學〈120〉鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法及其中的核酸和引物對〈160>3〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>3678〈212>DNA〈213〉鼠傷寒沙門氏菌〈400〉1atg皿tecc3ccacaggcccgteaccagttccgcgatgcg60gtgatcc皿3agcteaccacgctggggatttccgctgatetctgcaaatt120gcggatgccgagctcgtcggCg皿3CC3tgcgctetggtcagttcgacteCCCC3皿tCC1803CCCtC3CCCgccgcgatcgtctggtea皿cgcgcccgcgagc郷gctttgacgtgctg240gttgagcactgtgcctecacctggttcaaccgcctgtgcgccattcgttetetgga皿tc300cacggttetcttgaccacggcttccacatgctctcgcacccggateacccgacaggcttt360g皿gtgctggaccacgteccgg皿gtcgcgg皿gcattectecc3gag皿皿3ggCgC3g420ctggtcg卿tgaagctttcCggC皿CC3gg3Cg皿gCC3tcteccgtgaactgctgctg■gcccagtgccacgccctgcaccgcgcgatgccgttcctgtttgaagctgtggacgatg皿540gctgaactectgctgccggateacctgacccgcaccgactccattctecgcggtctggtg600gacggtettcCgg皿g皿g3ctggc皿g皿gttg郷ttetcggctggctgtetcagttc660tetetctctgtgcggttetcggte郷tggtg皿gagcgaagatettcct720gccgccacccagctgttteccccaaactggattgtgcagtatctggtecagaactccgtc780ggccgccagtggttgc卿cctecccggattcgccgctgaggactectec840CCg皿C3g3Cgccag皿gtgC3ggCgC3gCtggccgccattecacctgcc■agtettg皿cCgg皿3gC3tcaaagtectcgacccggcctgcggctccgggcatettctg960attgaagtctateatgtgcttetg朋gagcgcggctetcgcgcccgcgat1020attccacagctaattctggatttggtctcgacattgacgaccgtgctgcc1080cagctttccggctttgccttatteatgatggcccgtcaggatgaccgccggatettcacc1140cgcgacgtgcgtctgaatettgtctccctgcaggagagcctgcatctggatettgcteag1200ctgtggcagcagctgaacttccacc3gc3g皿cc3gactggtegcatgggggatetgttt1260gccg皿朋tecagcattegcccateccgacagcgcagaatatcagctgctgatgcgracg1320ctgaagcgctttgtgaacgcc皿皿cgctgggctcgctgatccaggtgcc1380g郷cgg雄tg皿ggcgtttctcgaagcgctetetcgcaaggcgatttc1440C3gC3g朋ggcagcggcg皿agcgtttettccgtetettc3gC郷Cgtggatcctggcg1500cagcggtetgatgcggtegtggcg皿tccgccgtetetgggtgg咖ggg1560gagctg朋agagtttgccaaccggategteaagctgatttgtttgcaatg1620tttetgcagaatgcattttctttgctteaaga腿tgggttteatgctcaagtc皿tetg1680caatcatggatgtttttgtcgcactacgteactggttettggac皿te朋1740acatttetteCg3tggC3C3tttgggagctcgggcttttgggcaaatttctgg卿ggtt1800gtecagac朋ctgcctgggtcaacactccgaacgtteccaacctgtettt1860tttagacttat卿tggteggg皿g朋gte皿g皿皿gcgatctacttct1920atatttgategcatgattttC3gg皿tgCC皿tegcatet1980tggategacttaccgagtctattetcttttcgccaccate2040gcatte朋agcaggcatgtccaccggtgacttc朋agatettggtecg賜2100gtttcaateaaaaaaaccctcgacattcat2160ggtttccttgtegtegtggaggtg朋tetcg腿gtggtetggteat朋c2220g朋ategttgte皿ttggga朋ateatggttecg朋atec2280ggc朋朋ctcgctctgccgtgagtettect2340gcc皿ggteatttttgcgtgagatetcgtcc皿朋gggtttgtttttgat2400gatecaggccgttgcggctttgctttecgctgcgggatte2460atgtgcactcccattetttetcaatactegCCCCC3C3Cttegctttect25203gtggtg朋ttagcctcagtaccatetccacgaattegtc2580accaatgctettga皿tegctgggactctc皿gagc皿tc2640gtttgttcaccattgcttgaactcaattgctecgg皿tet2700gttegtcg皿acacttctcc2760aatettttteacaacttgactteaagctgt2820g朋3teactctactetgteatccaaactetcgatetea皿tcataccgat2880agtettacactgatetcactategatetctteagctecatcatcggctgc29403tg3tgggCCgctectccctcgatcgcg皿ggactggtctatgcccatgaaggc皿te朋3000ggctttgccgaactggtcgctg皿gacgcgtcccggctgaC皿tg3Cggt3060atcctgccgctgatggatgacgagtggtttgacgatgacgttecctctcgCgtC皿3g3g3120tttgttcgcaccgtttggggcg皿g朋cacatctcgaatttetcgccgaa3180agcctctgtttatecgcgata皿ggcg皿tctgcgctggateccatccgc3240cgctetctttccactcagttctgga朋gatcatetg皿g3gcgtccgata3300tectggctgttcagctccggte^gag^agcgtttgagtgcctggtctetctgcatcgc3360tec皿cgatgcgacgctggcg卿atgcgtaccg朋tetgtegtgccgctgctggcgcgc3420tetcaggccaatetcgatcgcctg皿cg皿c郷tcgatggagcctcaggcggcg皿gcc3480acccgcctga朋cgtgagcgtgategcctgtcaacgaactgcgcagcttc3540gacgatcgcctgcgccactetgctgatetg3g皿tcagtettgatctcgacgacggcgtt3600acggt朋gtttggcgatctgctggcggatgtga朋gccatteccggcaat3660〈210〉2〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉2ggtggc卿gg￡uatg￡ua〈210>3〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3cgcagcgtaaagcaact說明書8/8頁3678171權(quán)利要求一種鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌的基因組DNA序列中的保守序列SEQIDNO1設(shè)計擴增引物；步驟二，提取樣品DNA，PCR法擴增；步驟三，凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，判斷樣品是否含有鼠傷寒沙門氏菌；所述判斷具體為如果電泳結(jié)果出現(xiàn)相應的單一擴增條帶，則說明樣品中含有鼠傷寒沙門氏菌；如果沒有出現(xiàn)相應的單一擴增條帶，則樣品中不含有鼠傷寒沙門氏菌。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法，其特征是，步驟一中，所述引物具體為正向引物的序列如SEQIDNO:2所示，反向引物的序列如SEQIDNO:3所示。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法，其特征是，步驟二中，所述PCR法中，PCR檢測體系具體為25iiL反應體系具體為，10XPCR反應緩沖液2.5yL，25,1/L的Mg2+2.0iiL，2.5,1/L的dNTP1.0iiL，5iiM引物對1iiL，Taq酶1U，模板溶液取25iiL，最后補水至25iiL。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法，其特征是，步驟二中，所述PCR法中，PCR檢測體系擴增參數(shù)具體為先94t:預變性5min，之后開始擴增循環(huán)，每個循環(huán)的程序為94。C變性30s，65。C退火30s，72。C延伸30s;循環(huán)共35個；循環(huán)結(jié)束后，72。C延伸10min，降溫至12"，結(jié)束。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠傷寒沙門氏菌的PCR檢測方法，其特征是，步驟三中，所述判斷具體為檢測凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物在915bp位置是否存在單一擴增條帶，如果存在，則說明樣品中含有鼠傷寒沙門氏菌；如果沒有，則樣品中不含有鼠傷寒沙門氏菌。6.—種根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法中的核酸，其特征在于，該核酸的堿基序列如SEQIDNO:1所示。7.—種根據(jù)權(quán)利要求1所述的的鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法中的引物對，其特征在于，該引物對具體為堿基序列分別如SEQIDN0:2所示和如SEQIDNO:3所示的核酸。全文摘要一種食品安全檢驗
技術(shù)領(lǐng)域：
的鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測方法及其中的核酸和引物對；該檢測方法包括如下步驟根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌的基因組DNA序列中的保守序列SEQIDNO1設(shè)計擴增引物；提取樣品DNA，PCR法擴增；凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，判斷樣品是否含有鼠傷寒沙門氏菌；所述判斷具體為如果電泳結(jié)果出現(xiàn)相應的單一擴增條帶，則說明樣品中含有鼠傷寒沙門氏菌；如果沒有出現(xiàn)相應的擴增條帶，則樣品中不含有鼠傷寒沙門氏菌；本發(fā)明還涉及一種核酸，其堿基序列如SEQIDNO1所示；本發(fā)明還涉及一種引物對，具體為堿基序列如SEQIDNO2和SEQIDNO3所示的核酸。采用本發(fā)明的檢測方法檢測鼠傷寒沙門氏菌，檢測時間短，成本低，檢測結(jié)果特異，結(jié)果判定簡單。文檔編號C12R1/42GK101705307SQ200910311228公開日2010年5月12日申請日期2009年12月11日優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日發(fā)明者何曉華,劉斌,史賢明,施春雷,陳婧申請人:上海交通大學