專利名稱：使用轉(zhuǎn)座子的用于轉(zhuǎn)化的載體、通過該載體轉(zhuǎn)化的微生物及用其生產(chǎn)l-賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用轉(zhuǎn)座子基因以用于轉(zhuǎn)化的載體、用所述載體轉(zhuǎn)化的微生物 以及用所述微生物制備賴氨酸的方法。
背景技術(shù)：
棒狀桿菌，尤其是谷氨酸棒桿菌是一種用于生產(chǎn)L-氨基酸的革蘭氏陽性微生 物。L-氨基酸，特別是L-賴氨酸廣泛用于生產(chǎn)動物飼料，人用藥物及化妝品。該氨基 酸是通過棒狀桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的。L-賴氨酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法一般是使用這樣的棒狀桿菌，其具有增強的L-賴氨 酸生物合成相關(guān)基因。例如，美國專利US6,746,855記載了一種通過培養(yǎng)棒狀桿菌屬 (Corynebacterium sp.)生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，所述的棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)中 的賴氨酸釋放載體基因IysE得到了增強，同時還導(dǎo)入了選自下組中的另一基因，該組基 因由編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的dapA、編碼天冬氨酸激酶的lysC、編碼丙酮酸羧化酶 的pyc和編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的dapB組成。并且，美國專利6,221,636記載了一 種用重組DNA轉(zhuǎn)化的棒狀桿菌，其對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制基本不敏感，所 述重組DNA包含編碼二氨基庚二酸鹽脫羧酶和天冬氨酸激酶的DNA序列。在缺乏抗生素抗性序列的情況下增強所述的L-賴氨酸生物合成相關(guān)基因，可以 提高基因的拷貝數(shù)也可以通過突變提高酶活。迄今為止有兩種提高基因拷貝數(shù)的方法。提高基因拷貝數(shù)的兩種方法之一是在其內(nèi)部原有基因的旁邊再插入額外的基因 形成串聯(lián)重復(fù)序列。另一種方法是在棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)染色體區(qū)的一個 或多個地方插入額外的基因(US7,160,711)。然而，這些方法均受限于基因插入位點，在 插入多個基因時非常困難。為克服該問題，人們試圖在基因組rDNA的多拷貝區(qū)插入靶 基因。據(jù)報道，該方法比之前的方法更成功。盡管如此，由于破壞兩個或更多個rDNA 拷貝會影響微生物的生長，因此該方法仍有不足。轉(zhuǎn)座子也稱為插入序列元件，是一種能在染色體或質(zhì)粒上移動的序列。轉(zhuǎn)座子 包括轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座酶具有識別特定的插入序列的活性。迄今為止，各種細(xì)菌中已有數(shù)百 種轉(zhuǎn)座子被報道(TRANSPOSON-BASEDSTRATEGIES FOR MICROBIAL FUNCTIONAL GENOMICS ANDPROTEOMICS (2003) Annual Review of Genetics 37 3_29Finbarr Hayes)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明人試圖利用轉(zhuǎn)化載體生產(chǎn)一種能生產(chǎn)高濃度賴氨酸的菌株，所述載體可 與位點無關(guān)地插入兩個或更多靶基因的拷貝而不抑制該微生物的生長。本發(fā)明人證實使 用轉(zhuǎn)座子基因的用于轉(zhuǎn)化的載體對插入外源基因非常有用，并最終完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種使用轉(zhuǎn)座子基因的用于轉(zhuǎn)化的載體。本發(fā)明的另一目的是提供一種棒狀桿菌屬微生物，其通過由所述轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化 而具有增強的賴氨酸生產(chǎn)能力。本發(fā)明的另一目的是提供一種由所述棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)培養(yǎng)液生 產(chǎn)賴氨酸的方法。技術(shù)方案為完成上述目標(biāo)，本發(fā)明提供一種包含轉(zhuǎn)座子基因和多克隆位點的用于轉(zhuǎn)化的 載體。本發(fā)明還提供一種棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)微生物，其通過由所述用于
轉(zhuǎn)化的載體轉(zhuǎn)化而具有增強的賴氨酸生產(chǎn)能力。 本發(fā)明還提供一種由所述棒狀桿菌屬微生物的培養(yǎng)液生產(chǎn)賴氨酸的方法。有益效果本發(fā)明提供一種能夠生產(chǎn)高濃度賴氨酸的棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)微生
物。其通過將天冬氨酸激酶基因(IysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(asd)、二氫吡啶二羧 酸合酶基因(dapA)和二氫吡啶二羧酸還原酶基因(dapB)連續(xù)的插入到棒狀桿菌屬基因 組上將轉(zhuǎn)座子基因作為多拷貝存在的區(qū)域，從而提高了內(nèi)源生活性，同時還將棒狀桿菌 原本沒有的果糖激酶基因(srk)額外地插入到轉(zhuǎn)座子基因區(qū)域從而被賦予了新的活性。


根據(jù)隨后描述的優(yōu)選實施方式和附圖，本發(fā)明所述物品、特點和優(yōu)點將更加顯 而易見。附圖中圖1是棒狀桿菌染色體插入載體pDZTn的示意圖。圖2是棒狀桿菌染色體插入載體pDZTn-lysC/asd的示意圖。
圖3是棒狀桿菌染色體插入載體pDZTn-dapA/dapB的示意圖。圖4是載體pDZTn-srk的示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種包含轉(zhuǎn)座子基因和多克隆位點的用于轉(zhuǎn)化的載體。所述轉(zhuǎn)座子基因可源自棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)。棒狀桿菌屬有多 個類型的轉(zhuǎn)座子。例如，谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032包括9個群的24種轉(zhuǎn)座子(The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032genome sequence and its impact on the production of-aspartate-derivedamino acids and vitamins (2003) Journal of Biotechnology 104, 5-25JornKalinowski et al)。其中ISCgl和ISGg2分別包括4個和5個拷貝，各拷貝之間 具有至少99%的同源性。本發(fā)明轉(zhuǎn)座子基因優(yōu)選源自谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032(基因庫登錄號 NC_003450, NCgll021)的ISCgl (序列號22)家族的成員，特別是具有序列號1和2所 示序列的轉(zhuǎn)座子。所述多克隆位點是為了通過多個限制性內(nèi)切酶容易被識別而人工插入的核苷酸 序列，從而方便靶基因的插入。
能夠插入到所述多克隆位點的基因是aspB(編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因)， IysC (編碼天冬氨酸激酶的基因)，asd(編碼天冬氨酸半醛脫氫酶的基因)，dapA(編碼二 氫吡啶二羧酸合酶的基因)，dapB(編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的基因)和IysA(編碼二 氨基庚二酸脫羧酶的基因)，這些基因是涉及生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀桿菌屬內(nèi)源基因。另 夕卜，還可插入外源性基因srk(編碼果糖激酶的基因)。優(yōu)選選自aspB，IysC, asd, dapA，dapB和IysA的一種或多種基因插入到所述
多克隆位點。也可以將選自上組的內(nèi)源性基因和外源性基因一起插入多克隆位點。更優(yōu) 選將lysC/asd和dapA/dapB連續(xù)插入多克隆位點，或同時插入棒狀桿菌屬缺乏的外源srk基因。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述lysC，asd, dapA和dapB分別具有源自 谷氨酸棒狀桿菌KCCM 10770Pb(基因庫登錄號NC_003450，NCgl0247 0248和 NCgl 1896 1898)的如序列號17，18，19和20所示的核苷酸序列。外源基因srk可 以是具有源自厭氧性梭孢桿菌Clostridiumacetylbutyricum ATCC 824 (基因庫登錄號NP 347064)的如序列號21所示的核苷酸序列。本發(fā)明轉(zhuǎn)化載體中插入的基因可以通過二次交換整合到棒狀桿菌屬 (Corynebacterium sp.)微生物的染色體中。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)座子基因的用于轉(zhuǎn)化的載體不僅能擴(kuò)增至少2拷貝的內(nèi)源性基 因，并且由于含有復(fù)合轉(zhuǎn)座子，還能通過高效交換的方式插入基因。該載體還可以用于 生產(chǎn)使用同一載體擴(kuò)增一系列不同的基因的菌株。轉(zhuǎn)座子基因是不影響微生物的生長并 有助于提高減少基因的不穩(wěn)定。此外，即使缺乏特異性靶位點外源基因能夠被插入，并 能一系列地制備。本發(fā)明還提供一種棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)，其通過由所述轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)
化從而具有增強的賴氨酸生產(chǎn)力。本發(fā)明中，可用所述載體轉(zhuǎn)化的具有賴氨酸生產(chǎn)力的微生物可以是下面任意 一種棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)。例如，本發(fā)明可利用的棒狀桿菌屬是，谷氨 酸棒狀桿菌 ATCC 13032 或熱產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)FERM BP-1539。另外還包括，由這兩種菌株獲得的產(chǎn)L-氨基酸株或突變株，例如谷氨酸棒狀 桿菌KFCC10881，谷氨酸棒狀桿菌KFCC 11001和谷氨酸棒狀桿菌KCCM10770。最優(yōu) 選地該微生物是谷氨酸棒狀桿菌KCCM 10770P。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明所述棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)可以由轉(zhuǎn)化載體 pDZTn-lscC/asd，pDZTndapA/dapB 或 pDZTn-crk 轉(zhuǎn)化，這三 種載體的酶切圖分別如圖2，3或4所示。所述轉(zhuǎn)化載體可以順次轉(zhuǎn)入棒狀桿菌屬 (Corynebacteriumsp.) 中，也可同時轉(zhuǎn)入棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)中?？赏ㄟ^同
源重組等本領(lǐng)域公知的方法將載體插入染色體中。本發(fā)明還提供一種用所述棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)培養(yǎng)液生產(chǎn)賴氨酸的方法。 培養(yǎng)棒狀桿菌屬生產(chǎn)賴氨酸，可以使用本領(lǐng)域公知的傳統(tǒng)方法。例如，補料分 批培養(yǎng)或重復(fù)補料分批培養(yǎng)。此處使用的培養(yǎng)基應(yīng)滿足特定菌株的特定培養(yǎng)條件。棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)的培養(yǎng)基在現(xiàn)有技術(shù)中已有教導(dǎo)(例如，Manualof Methods for General Bacteriology.American Society for Bacteriology.Washington D.C., USA, 1981)。可用的糖原質(zhì)例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉、 纖維素；油和脂如豆油、葵花籽油、蓖麻子油和椰子油；脂肪酸如軟脂酸、硬脂酸和亞 麻酸；醇類如甘油和乙醇；以及有機酸如醋酸。上述物質(zhì)之一或其組合物都可以使用?？捎玫牡蠢缬袡C氮源蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米漿和 豆粉，以及無機氮源尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。上述物質(zhì)之一 或其組合物都可以。這里的培養(yǎng)基還可進(jìn)一步包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀及其含鈉鹽作為磷源。 培養(yǎng)基還可包括金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。另外，氨基酸、維生素及其適當(dāng)?shù)那绑w也可 加入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基或其母液可以分批或連續(xù)地加入培養(yǎng)液中。在培養(yǎng)過程中，可通 過加入氨水、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸等來調(diào)整培養(yǎng)液的pH值。培養(yǎng)過程中，可通 過加入如聚甘油脂肪酸酯的消泡劑來抑制氣泡的產(chǎn)生。為維持需氧的條件，可向培養(yǎng)液 中注入氧氣或含氧氣體(如空氣)。優(yōu)選的培養(yǎng)溫度為20-45°C，更優(yōu)選25-40°C?？?以進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，直到L-氨基酸的濃度達(dá)到理想濃度，優(yōu)選的培養(yǎng)時間是10-160小時。 L-賴氨酸釋放到培養(yǎng)液中或位于細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明提供的在實際應(yīng)用中優(yōu)選的實施方式，通過隨后的實施例進(jìn)行了說明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，對于本發(fā)明的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的精神和 范圍內(nèi)進(jìn)行改進(jìn)和提高。實施例實施例1:構(gòu)建引入轉(zhuǎn)座子基因的載體(pDZTn)以及用該載體插入基因的方法。在這個實施例中，用于棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)染色體插入的pDZ載體
作為為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建引入棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)轉(zhuǎn)座子基因的pDZTn載體。
構(gòu)建方法如下。為獲得轉(zhuǎn)座子基因，從NIH基因庫獲得了源自谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的全 核酸序列轉(zhuǎn)座子基因的核苷酸序列信息(NCBI登錄號NC_003450，NCgI1021)，并合成 了兩對引物(表1，序列號3-6)。以谷氨酸棒桿菌ATCC13032染色體DNA為模板，以序列號3_6所示的寡核苷酸 為引物，用PfuUltra 高保真DNA聚合酶(Stratagene)作為聚合酶進(jìn)行PCR。PCR條件 如下96°C下變性30秒，58°C下退火30秒，72°C下聚合1分鐘，從變性到聚合重復(fù)30 個循環(huán)。表 權(quán)利要求
1.一種用于轉(zhuǎn)化的載體，其包含源自棒狀桿菌菌株屬微生物的轉(zhuǎn)座子基因和多克隆 位點。
2.權(quán)利要求1所述的用于轉(zhuǎn)化的載體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)座子基因具有分別為序列 號1和序列號2的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的用于轉(zhuǎn)化的載體，其特征在于，在所述多克隆位點處插入了一個 或多個選自下組的基因，所述的組由源自棒狀桿菌菌株屬微生物的編碼天冬氨酸激酶的 IysC基因、編碼天冬氨酸半醛脫氫酶的asd基因、編碼二氫吡啶二羧酸合酶的dapA基因 和編碼二氫吡啶二羧酸的dapB基因構(gòu)成。
4.權(quán)利要求1所述的用于轉(zhuǎn)化的載體，其特征在于，在所述多克隆位點額外地插入了 編碼外源性果糖激酶的srk基因。
5.權(quán)利要求4所述的用于轉(zhuǎn)化的載體，其特征在于，所述的srk基因源自丙酮丁醇梭 菌 ATCC 824。
6.—種具有L-賴氨酸生產(chǎn)力的谷氨酸棒狀桿菌，特征在于，其由權(quán)利要求1-5中任 一項所述的載體轉(zhuǎn)化。
7.權(quán)利要求6所述的具有L-賴氨酸生產(chǎn)力的谷氨酸棒狀桿菌，其特征在于，所述轉(zhuǎn) 化微生物是谷氨酸棒狀桿菌KCCM10770P。
8.權(quán)利要求6所述的具有L-賴氨酸生產(chǎn)力的谷氨酸棒狀桿菌，其特征在于，所述的 谷氨酸棒狀桿菌是谷氨酸棒狀桿菌KCCM10770P-CJ2 (保藏號KCCM10939P)。
9.權(quán)利要求6所述的具有產(chǎn)L-賴氨酸生產(chǎn)力的谷氨酸棒狀桿菌，其特征在于，所述 插入到轉(zhuǎn)化載體多克隆位點的基因通過二次交換整合到染色體上。
10.—種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括以下步驟將權(quán)利要求6-9中任一項所述的微生 物進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞中或培養(yǎng)液中產(chǎn)生L-賴氨酸；并從細(xì)胞中或培養(yǎng)液中回收賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用轉(zhuǎn)座子基因的用于轉(zhuǎn)化的載體，用所述載體轉(zhuǎn)化的微生物，以及用所述微生物生產(chǎn)賴氨酸的方法。
文檔編號C12N15/64GK102027119SQ200980107004
公開日2011年4月20日 申請日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月10日
發(fā)明者崔宗秀, 張在佑, 林相曹, 金喆河 申請人:Cj第一制糖株式會社