三種擬青霉對何首烏的微生物轉(zhuǎn)化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用三種擬青霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化何首烏的方法。該方法主要包括：（1）三種擬青霉的制備；（2）三種擬青霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備；（3）三種擬青霉固體發(fā)酵培養(yǎng)；（4）三種擬青霉固體發(fā)酵培養(yǎng)物后處理。本發(fā)明所提出的利用三種擬青霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化何首烏的方法，培養(yǎng)物同時(shí)含有藥用多糖、甘露醇、3ˊ-脫氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚，其中何首烏中主要成分二苯乙烯苷含量提高了20%。本發(fā)明操作簡便，效果良好，可進(jìn)行大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【專利說明】三種擬青霉對何首烏的微生物轉(zhuǎn)化

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是利用三種擬青霉對中藥何首烏進(jìn)行微生物轉(zhuǎn) 化的方法。
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【背景技術(shù)】
[0003] 蝶擬青霉 cicat/ae(Mique1 ? )Samson、蛹草擬青霉 Liang、蝙幅蛾擬青霉Chen&Dai是三種重要的藥用真 菌，其主要發(fā)酵產(chǎn)物是多糖、甘露醇、3 < -脫氧腺苷和腺苷等，具有免疫調(diào)節(jié)、治療腎衰、抗 腫瘤、抗炎癥、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗心律失常、延緩衰老、耐缺氧等方面的作用。
[0004] 何首烏是一味傳統(tǒng)的中藥，為寥科植物何首烏Thunb.的 塊根，性味苦、甘、澀、微溫，為補(bǔ)益類中藥，入肝、心和腎經(jīng)。《本草綱目》記載何首烏"養(yǎng)血 益肝，固精益腎，健筋骨，烏須發(fā)，為滋補(bǔ)良藥，不寒不燥，功在地黃、天門冬諸藥之上"。何首 烏含有二苯乙烯苷類、蒽醌類、磷脂類、糖類、多種氨基酸、多種維生素及微量元素等，具有 抗衰老、增強(qiáng)免疫、降血脂、抗心肌缺血、改善腦缺血、神經(jīng)保護(hù)、抗骨質(zhì)疏松等作用。
[0005] 臨床應(yīng)用有生首烏和制首烏之別。生首烏因含有結(jié)合型蒽醌而具有輕度瀉下作 用，制首烏是生首烏炮制而成，在此過程中，結(jié)合型蒽醌可轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x型(彭曉波，中國現(xiàn)代 藥物應(yīng)用，2008,2 (19) :117)。所以，生首烏有小毒，而制首烏毒性甚微。杜晨暉等人利用 毛霉和米根霉對何首烏進(jìn)行微生物發(fā)酵，其目的主要是降低何首烏的毒性(杜晨暉等，天然 產(chǎn)物研發(fā)與開發(fā)，2008, 20 :540-544)。本發(fā)明選用的材料是制首烏，應(yīng)用三種藥用真菌進(jìn)行 發(fā)酵，使培養(yǎng)物兼具微生物和中藥的功效成分，提高治療和保健的功效，是頗具發(fā)展?jié)摿Φ?研發(fā)領(lǐng)域。該發(fā)明主要是利用蝙蝠蛾擬青霉Chen&Dai、蛹草擬青 ^PaecilomycesmilitarisLiang和[ll單擬青霉cicat/ae(Miquel. )Samson 對何首烏進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，一次發(fā)酵可同時(shí)獲得藥用多糖、甘露醇、3 < -脫氧腺苷、腺苷、二苯 乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚，其中何首烏中主要成分二苯乙烯苷含量提高20%。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種利用三種擬青霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化何首烏，同時(shí)獲得擬青霉和何首烏活性 成分，且提高何首烏主要成分二苯乙烯苷含量的方法。
[0008] 該方法的操作步驟如下： (1)生產(chǎn)菌株為蝶擬青霉cicat/ae(Mique1 ? )Samson;蛹草擬青霉PaecilomycesmilitarisLiangPaecilomyceshepialiChen&Dai〇
[0009] (2)菌種制備：將步驟（1)所述菌株蝶擬青霉cicat/ae(Miquel.) Samson;蛹草擬青霉 Liang;蝙幅蛾擬青霉 Aepia/iChen&Dai分別接種到PPDA斜面培養(yǎng)基，于20?25°C恒溫培養(yǎng)疒10d，用無菌水洗 下孢子，稀釋調(diào)整使孢子終濃度達(dá)到5X107個(gè)/毫升。
[0010](3)固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備：固體培養(yǎng)基配方為何首烏粉3(T40g(制首烏粉碎獲 得）；蔗糖2g;蛋白胨1g;洋芋粉5g;粗麩皮1(T20g，混勻，裝入1000ml三角瓶中，力口 入去離子水，使最終培養(yǎng)基的水料比為1.2 :1，121°C高壓滅菌30min。
[0011](4)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（2)中制備好的菌種分別按2. 5ml/瓶的量接入步驟 (3)三角瓶固體培養(yǎng)基中，于1(T25 °C，靜置培養(yǎng)2(T30天。
[0012] (5)固體發(fā)酵物后處理：將步驟（4)中培養(yǎng)好的固體發(fā)酵物取出，55 °C恒溫干 燥至恒重，然后粉碎至80目粉末，采用紫外檢測法測定多糖、甘露醇含量；HPLC法測定 3?脫氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚的含量。
[0013] 本發(fā)明關(guān)鍵點(diǎn)在于：使用三種擬青霉對植物藥材何首烏進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，一次發(fā) 酵過程同時(shí)獲得藥用真菌藥效成分和何首烏藥效成分，且明顯提高何首烏中二苯乙烯苷含 量。
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【具體實(shí)施方式】
[0015] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不是對本發(fā)明的限制。
[0016] 實(shí)施例1 :不同培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)物有效成分種類和含量的影響 (1)菌種制備：將蝶擬青霉cicat/ae(Miquel.)Samson;蛹草擬青霉PaecilomycesmilitarisLiang;蝙幅蛾擬青霉Chen&Dai接種 到PDA斜面培養(yǎng)基，于23°C恒溫培養(yǎng)10d，用無菌水洗下孢子，稀釋調(diào)整使孢子終濃度達(dá)到 5X107個(gè)/毫升。
[0017] (2)固體共發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：固體培養(yǎng)基的配方為何首烏40g;蔗糖2g;蛋白 胨1g;洋芋粉5g;粗麩皮10g，裝入1000ml三角瓶中，水料比為1.2 :1，121°C滅菌30min。
[0018] (3)固體共發(fā)酵培養(yǎng)：將制備好的菌種分別按2ml/瓶的量接入三角瓶固體培養(yǎng)基 中，于10°C和30 °C，靜置培養(yǎng)25天，（注：空白對照未接菌，其余條件相同）。
[0019] (4)固體發(fā)酵物后處理：將步驟（3)中培養(yǎng)好的固體發(fā)酵物取出，55 °C恒溫干燥 至恒重，然后粉碎至80目粉末，采用紫外檢測法測定多糖、甘露醇含量；采用紫外檢測法測 定多糖、甘露醇含量；HPLC法測定：r-脫氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚 的含量，其結(jié)果見表1。
[0020] 表1不同培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)物有效成分種類和含量的影響

【權(quán)利要求】
1. 一種利用三種擬青霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化何首烏的方法，其特征在于該方法包括： (1) 菌種制備：將蝶擬青霉cicat/ae (Miquel.) Samson;蛹草擬青霉 Paecilomyces mi li tar is Liang Paeci lomyces hepiali Chen & Dai 三種 菌株，分別接種到PDA斜面培養(yǎng)基，于2(T25°C恒溫培養(yǎng)7~10d，用無菌水洗下孢子，稀釋調(diào) 整使孢子終濃度達(dá)到5 X 107個(gè)/毫升； (2) 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：固體培養(yǎng)基的配方為：何首烏3(T40 g ;蔗糖2 g ;蛋白胨 1 g;洋芋粉5 g;粗麩皮1(T20 g，裝入1000 ml三角瓶中，水料質(zhì)量比為1.2:1，121 °C滅 菌 60 min ; (3) 固體發(fā)酵培養(yǎng)：將制備好的三種擬青霉分別按2 ml/瓶的量接入三角瓶固體培養(yǎng) 基中，于1(T30 °C，靜置培養(yǎng)1(T30 d。
【文檔編號】C12P19/44GK104342465SQ201310344589
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】虞泓, 賈學(xué)淵, 葛鋒, 陳自宏, 曾文波 申請人:云南云百草實(shí)驗(yàn)室有限公司