專利名稱：具有改進(jìn)的穩(wěn)定性的脂肪分解酶變體及編碼該變體的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有改善的洗滌劑中穩(wěn)定性的脂肪分解酶變體及制備它們的方法。本 發(fā)明特別涉及細(xì)毛嗜熱霉(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶的脂肪分解酶變體。
背景技術(shù)：
已知使用真菌脂肪分解酶，例如，來自細(xì)毛嗜熱霉(Thermomyceslanuginosus) (同物異名疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶，用于多種產(chǎn)業(yè)上的目的， 例如，改善洗滌劑的功效。因此，來源于細(xì)毛嗜熱霉(同物異名疏棉狀腐質(zhì)霉，EP258068 和EP305216)的脂肪酶以商品名Lipolase (Novozyme A/S的產(chǎn)品)出售用作洗滌劑用 途。W0 0060063描述了在洗滌劑溶液中具有特別好的初次洗滌(first-wash)性能的細(xì) 毛嗜熱霉脂肪酶的變體。除了將脂肪酶用作洗滌劑酶從衣物或其它紡織品去除脂質(zhì)或脂 肪污跡之外，它們亦用作供面包和其它烘焙產(chǎn)品用的生面團的添加劑，并用于消除在紙漿 和紙生產(chǎn)中的樹脂(pitch)問題。在一些應(yīng)用中，期望具有改善的熱穩(wěn)定性的脂肪分解酶 (EP 374700, W0 9213130)，而在其他應(yīng)用中期望其在洗滌劑中的穩(wěn)定性。W0 92/05249, W0 92/19726和W0 97/07202公開了細(xì)毛嗜熱霉(疏棉狀腐質(zhì)霉)脂肪酶的變體。

發(fā)明內(nèi)容
在第一個方面，本發(fā)明涉及親本脂肪分解酶的變體，其中所述變體(a)具有與親 本脂肪分解酶比較包含對如下氨基酸殘基的取代的氨基酸序列，所述氨基酸殘基對應(yīng)于 SEQ ID而2的氨基酸27、216、227、231、233和256中的任一；和(b)與親本脂肪分解酶比 較在洗滌劑中更加穩(wěn)定。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及編碼所述變體的分離的多核苷酸，包含該多核苷酸 的核酸構(gòu)建體，包含該核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體，以及包含該核酸構(gòu)建體或該重組表達(dá) 載體的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及制備權(quán)利要求1-9任一所述的脂肪分解酶的方法， 包括下述步驟(a)將包含所述核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或包含所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn) 化宿主細(xì)胞在有益于產(chǎn)生所述變體的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其中所述核酸構(gòu)建體或重組表達(dá)載 體包含所述多肽；和(b)回收所得變體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及所述脂肪分解酶變體在羧酸酯的水解，或酯的水解、合成或酯交換中的用途。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含所述脂肪分解酶變體的配制物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及所述脂肪分解酶變體用于生產(chǎn)在洗滌劑中穩(wěn)定的配 制物的用途。附圖簡述

圖1顯示脂肪酶的比對。
序列列表
SEQIDNO1顯示編碼來自細(xì)毛嗜熱霉的脂肪酶的DNA序列。
SEQIDNO2顯示來自細(xì)毛嗜熱霉的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:3顯示來自反射犁頭霉(Absidia reflexa)的脂肪酶的氨基酸序列。
石ilSEQIDNO:4顯示來自傘枝犁頭霉(Absidia corymb if era)的脂肪酶的氨基酸序夕U °
SEQIDNO:5顯示來自曼赫根毛霉(Rhizmucor miehei)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:6顯示來自米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:7顯示來自黑曲霉(Aspergillus niger)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:8顯示來自塔賓曲霉(Aspergillus tubigensis)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:9顯示來自尖鐮孢(Fusarium oxysporum)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:10顯示來自異孢鐮孢(Fusarium heterosporum)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO:11顯示來自米曲霉(Aspergillus oryzea)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO12顯示來自沙門柏干酪青霉(Penicilium camembertii)的脂肪酶的氨基畫g序列。
SEQIDNO13顯示來自臭曲霉(Aspergillus foetidus)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO14顯示來自黑曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO15顯示來自米曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQIDNO16顯示來自Landerinapenisapora的脂肪酶的氨基酸序列。
發(fā)明詳述
氨基酸修飾的命名法
為了易于參考，在描述本發(fā)明的脂肪酶變體時，采用以下命名法
原始氨基酸位置取代氨基酸
根據(jù)這種命名法，例如，在位置195中用谷氨酸取代甘氨酸表示為G195E。在相同
的位置缺失甘氨酸表示為G195*，而插入額外的氨基酸殘基例如賴氨酸表示為G195GK。與 其它脂肪酶相比，當(dāng)特定脂肪酶含有“缺失”并且在該位置進(jìn)行插入的情況，就在位置36插 入天冬氨酸而言，將這種情況表示為*36D。用加號分隔多個突變，即R170Y+G195E，分別表示在位置170用酪氨酸取代精氨 酸，和在位置195用谷氨酸取代甘氨酸。當(dāng)應(yīng)用所述排列方法時，X231表示在親本脂肪分解酶中對應(yīng)于位置231的氨基 酸。X231R表示用R置換所述氨基酸。就SEQ ID NO :2而言，X是T，因此X231R表示用R 取代位置231的T。當(dāng)某個位置(例如231)中的氨基酸可以由選自一組氨基酸的另一個氨 基酸取代的情況，例如由R和P和Y組成的組，將這種情況表示為X231R/P/Y。在所有的情況下，采用公認(rèn)的IUPAC單字母或三字母的氨基酸縮寫。同一性如本文所使用的的術(shù)語“同一性”指兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序 列之間的相關(guān)性，由參數(shù)“同一性”來描述。就本發(fā)明而言，通過使用來自EMBOSS軟件包(http//emboss, org)版本2. 8. 0的Needle程序來測定兩個氨基酸序列之間的比對。Needle程序執(zhí)行總體比對算法，其在 Needleman，S. B. and ffunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453 中描述。使用的取 代矩陣是BL0SUM62，缺口開啟罰分(gap openingpenalty)是10，并且缺口延伸罰分(gap extension penalty)是0.5。本發(fā)明的氨基酸序列(“發(fā)明序列”；例如SEQ ID NO 2的氨基酸1至269)和不 同氨基酸序列(“外源序列”)之間的同一性程度如下計算用兩個序列比對中精確匹配的 數(shù)目除以“發(fā)明序列”的長度或“外源序列”的長度中最短的一個。將結(jié)果表示為百分比同一性。當(dāng)“發(fā)明序列”和“外源序列”在重疊的相同位置中具有同一氨基酸殘基時，發(fā)生 精確匹配。序列的長度是序列中氨基酸殘基的數(shù)目(例如SEQ ID NO :2的長度是269)?？梢允褂蒙鲜龇椒ㄓ嬎阃恍院屯葱?，并用于比對。在本發(fā)明的上下文中，同源 性和比對如下所述計算。同源性和比對就本發(fā)明而言，可以通過本領(lǐng)域已知的計算機程序的方法適當(dāng)?shù)販y定同源性的程 度，所述程序例如GCG程序包中提供的GAP (Program Manual for theffisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group,575Science Drive, Madison, Wisconsin,USA 53711) (Needleman,S. B. and ffunsch,C. D. , (1970),Journal ofMolecular Biology，48，443-45)，按照以下用于多肽序列比較的設(shè)定來使用GAP :GAP產(chǎn)生罰分(GAP creation penalty)為 3.0，和 GAP 延伸罰分(GAP extension penalty)為 0. 1。在本發(fā)明中，通過圖1中所示的比對來限定反射犁頭酶、傘枝犁頭酶、曼赫根毛 霉、德氏根霉、黑曲霉、塔賓曲霉、尖鐮孢、異孢鐮孢、米曲霉、沙門柏干酪青霉、臭曲霉、黑曲 霉、細(xì)毛嗜熱霉(同物異名疏棉狀腐質(zhì)霉)和Landerinapenisapora的脂肪酶序列中對應(yīng) 的(或同源的)位置。為了查找比對中沒有顯示的脂肪酶序列中的同源位置，將目標(biāo)序列與圖1中所述 序列進(jìn)行比對。通過使用GAP比對將新序列與GAP程序發(fā)現(xiàn)的最同源的序列進(jìn)行比對，將所 述新序列排入圖1中的現(xiàn)有比對。GAP在GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group,575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S. B. and ffunsch, C. D. , (1970), Journal of Molecular Biology, 48,443-45)中提供。對于多肽序列比較使用以下設(shè)定GAP產(chǎn)生罰分 為3.0且GAP延伸罰分為0. 1。親本脂肪酶任何合適的脂肪分解酶可用作親本脂肪分解酶，又稱親本脂肪酶。在一些實施方 案中，所述脂肪分解酶可以是真菌脂肪分解酶。所述脂肪分解酶可以是起源于下述屬的酵母脂肪分解酶，例如念珠菌 屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬 (Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)；或 更優(yōu)選是起源于下述屬的絲狀真菌脂肪分解酶，例如枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬 (Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filobasidium、 鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梨孢菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霄屬(Myceliophthora)、新考瑪月旨霄屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora) > 擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、裂褶菌 屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢 殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、嗜熱霉屬(Thermomyces)或木霉屬 (Trichoderma)。所述脂肪分解酶還可以是卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏
(Saccharomyces douglasii)、胃 弗 _ fij (Saccharomyces kluyveri)、i若 jftf^ fij (Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)的月旨肪分角軍醇。或者，所述脂肪分解酶是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲 霉(Aspergillus awamori)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉、曰本曲霉 (Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉、塔賓 曲霉、桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、禾谷鐮孢(Fusarium cerealis)、庫威鐮 抱(Fusarium crookwellense)、大刀鍵抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗鍵抱(Fusarium graminearum)、禾赤鍵抱(Fusarium graminum)、異抱鍵抱、合歡木鍵抱(Fusarium negundi)、尖鍵抱、多枝鍵抱(Fusarium reticulatum)、粉紅鍵抱(Fusarium roseum)、 接骨木鍵抱(Fusarium sambucinum)、膚色鍵抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱鍵 抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色鍵抱(Fusariumsulphureum)、圓鍵抱(Fusarium torulosum)、擬絲抱鍵抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片鍵抱(Fusarium venenatum)、 特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、細(xì)毛嗜熱霉(同物異名疏棉狀腐質(zhì)霉)、米赫毛霉 (Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、嚴(yán)紫胄 (Penicillium purpurogenum)、哈H (Trichoderma harzianum) > 寧(Trichoderma koningii)、長枝(Trichoderma longibrachiatum) >M15 (Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichoderma viride)月旨肪分角軍酶。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及是嗜熱霉屬脂肪酶或細(xì)毛嗜熱霉脂肪酶的脂肪分 解酶變體。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及脂肪分解酶變體，其中所述變體與SEQID N0 2至 少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少91%，至少92 %，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%相同。具有改善的洗滌劑中穩(wěn)定性的脂肪分解酶變體中的改變下面提及的位置是SEQ ID NO :2中氨基酸殘基的位置。在段落“同源性和比對” 中，描述了如何在不同脂肪酶中尋找對應(yīng)或同源位置的氨基酸殘基的步驟。所述脂肪分解酶變體，分解脂肪的變體或簡稱變體，根據(jù)本發(fā)明，令人驚訝的發(fā)現(xiàn) 其與親本脂肪分解酶相比在洗滌劑中更加穩(wěn)定。洗滌劑中的穩(wěn)定性定義為在洗滌劑存在下 保留脂肪分解/脂肪酶活性的品質(zhì)(quality)。所述脂肪酶活性可以全部或部分保留。因 此本發(fā)明的變體在洗滌劑存在下，與其來源的親本脂肪酶相比，顯示了改善的或者全部或 者部分保留其脂肪酶活性的能力。本文所使用的術(shù)語“脂肪酶活性”指催化三?；视退庑纬啥；视秃汪人?的羧酸酯水解酶活性。就本發(fā)明而言，脂肪酶活性根據(jù)下述步驟確定脂肪酶的底物通過使用阿拉伯膠作為乳化劑對三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)進(jìn)行乳化來制備。隨后在30°C下 在pH7或9在pH恒定的滴定實驗中水解三丁酸甘油酯。一個單位的脂肪酶活性(1LU)定 義為能夠在30°C，pH7下每分鐘釋出1微摩爾的丁酸的酶量。在一些實施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的變體與參照酶相比。除非另行指出，本文所使 用的術(shù)語“參照酶”或“參照脂肪酶”指具有T231R+N233R的取代的SEQ ID NO :2的成熟部 分。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及親本脂肪分解酶的變體，其中所述變體(a)具有 與親本脂肪分解酶相比包含對如下氨基酸殘基的取代的氨基酸序列，所述氨基酸殘基對應(yīng) 于SEQ ID NO :2的氨基酸27、216、227、231、233和256中的任一；并(b)與所述親本脂肪分 解酶相比在洗滌劑中更加穩(wěn)定。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及親本脂肪分解酶的變體，其中所述變體(a)包含 氨基酸殘基231和233，并具有與親本脂肪分解酶相比包含對至少一個對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸27、216、227和256中任一的氨基酸殘基的取代的氨基酸序列；并(b)與所述親 本脂肪分解酶相比在洗滌劑中更加穩(wěn)定。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及親本脂肪分解酶的變體，其中所述變體具有在位 置231+233和下述之一處的氨基酸改變(a) 27 ； (b) 216 ；或(c) 256 ；任選地所述變體進(jìn)一 步包含227 ；其位置對應(yīng)于SEQ ID NO :2。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及下述變體，其中氨基酸殘基的取代是SEQID N0:2 的 27R，216P, 227G, 231R, 233R 或 256K 之一。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及下述變體，其中氨基酸殘基的取代是SEQID N0:2 的 D27R, S216P, L227G, T231R, N233R 或 P256K 之一。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及下述變體，該變體包含選自下組的取代a) T231R+N233R+P256K ；(b)L227G+T231R+N233R ； (c)L227G+T231R+N233R+P256K ； (d) D27R+T231R+N233R ； (e) D27R+L227G+T231R+N233R ；和(f) S216P+T231R+N233R。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及下述變體，其中親本脂肪分解酶與SEQID NO 2至 少50 %，至少60 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少91%，至少 92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100% 相同。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及下述變體，其中親本脂肪分解酶是由細(xì)毛嗜熱霉 DSM4109產(chǎn)生，并具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的脂肪酶。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及下述變體，其中所述洗滌劑是液體洗滌劑。表1 可能包含于脂肪分解酶變體中的變化
權(quán)利要求
一種親本脂肪分解酶的變體，其中所述變體a)具有與親本脂肪分解酶相比包含對如下氨基酸殘基的取代的氨基酸序列，所述氨基酸殘基對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸27、216、227、231、233和256中的任一；和b)與所述親本脂肪分解酶相比在洗滌劑中更加穩(wěn)定。
2.一種親本脂肪分解酶的變體，其中所述變體a)包含氨基酸殘基231和233，并具有與親本脂肪分解酶相比包含對至少一個如下氨 基酸殘基的取代的氨基酸序列，所述氨基酸殘基對應(yīng)于SEQ IDNO 2的氨基酸27、216、227 和256中的任一；和b)與所述親本脂肪分解酶相比在洗滌劑中更加穩(wěn)定。
3.一種親本脂肪分解酶的變體，其中所述變體在位置231+233和下述之一處具有氨基 酸改變a)27 ；b)216；或c)256；任選地所述變體進(jìn)一步包含227 ；這些位置對應(yīng)于SEQ ID NO :2。
4 權(quán)利要求1-4所述的變體，其中所述氨基酸殘基的取代是SEQID N0:2&27R，216P， 227G, 231R, 233R 或 256K 之一。
5.權(quán)利要求1-5所述的變體，其中所述氨基酸殘基的取代是SEQID NO 2的D27R， S216P, L227G, T231R, N233R 或 P256K 之一。
6.權(quán)利要求1-6所述的變體，其中所述變體包含選自下組的取代a)T231R+N233R+P256K；b)L227G+T231R+N233R；c)L227G+T231R+N233R+P256K；d)D27R+T231R+N233R；e)D27R+L227G+T231R+N233R；和f)S216P+T231R+N233R0
7.權(quán)利要求1-6所述的變體，其中所述親本脂肪分解酶與SEQID NO :2至少50%，至 少60%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少 97%，至少98%，至少99%或100%相同。
8.權(quán)利要求1-6所述的變體，其中其親本脂肪分解酶是由細(xì)毛嗜熱霉(Thermomyces lanuginosus)DSM4109產(chǎn)生并具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的脂肪酶。
9.權(quán)利要求1-8所述的變體，其中所述洗滌劑是液體洗滌劑。
10.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-9任一所述的變體。
11.一種包含權(quán)利要求10的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸可操作地連 接于至少一個指導(dǎo)該變體在表達(dá)宿主中產(chǎn)生的調(diào)控序列。
12.—種重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求11的核酸構(gòu)建體。
13.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求11的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求12的重組表達(dá) 載體。
14.一種制備權(quán)利要求1-9任一所述的脂肪分解酶變體的方法，包括下述步驟a)在有益于所述變體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含含有所述多肽的重組表達(dá)載體或核酸構(gòu)建體；和b)回收所述變體。
15.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1-9任一所述的脂肪分解酶變體的方法，包括下述步驟a)選擇親本脂肪分解酶，b)在所述親本脂肪分解酶中取代至少一個對應(yīng)于SEQID N0:2的27、216、227、231、 233和256中任一的氨基酸殘基，c)任選地改變除了(b)中提及的之外的一個或多個氨基酸，d)制備由步驟(a)-(c)所得的變體，e)測試洗滌劑中所述變體的穩(wěn)定性，f)選擇具有增加的洗滌劑中穩(wěn)定性的變體，和g)產(chǎn)生選擇的變體。
16.權(quán)利要求1-9任一所述的脂肪分解酶變體在羧酸酯水解中的用途。
17.權(quán)利要求1-9任一所述的脂肪分解酶變體在酯的水解、合成或酯交換中的用途。
18.—種配制物，其包含權(quán)利要求1-9任一所述的脂肪分解酶變體。
19.權(quán)利要求18的配制物，其中所述配制物可為液體配制物。
20.權(quán)利要求1-9任一所述的脂肪分解酶變體用于制備在洗滌劑中穩(wěn)定的配制物的用
全文摘要
本發(fā)明提供了具有改進(jìn)的洗滌劑中穩(wěn)定性的脂肪分解酶變體和對其進(jìn)行編碼的多核苷酸。具有改進(jìn)的洗滌劑中穩(wěn)定性的脂肪分解酶變體通過在親本脂肪分解酶中取代某些指定氨基酸殘基來獲取。
文檔編號C12N9/20GK101990573SQ200980107002
公開日2011年3月23日 申請日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日
發(fā)明者克里斯琴·I·喬爾根森, 利斯·M·米克爾森, 杰斯珀·文德, 沙姆坎特·A·帕特卡, 羅伯特·范德蘭斯, 金·博施, 阿倫·斯文德森 申請人:諾維信公司