專利名稱：一種微生物轉(zhuǎn)化制備(s)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法，特別涉及一種以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266為生物催化劑，以乙酰乙酸叔丁酯為底物制備(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法。
背景技術(shù)：
(S) - (+) -3-羥基丁酸叔丁酯((S) - (+) -t-Butyl-3-Hydroxybutyrate)，CAS 登錄號(hào)82578-45-8，分子式C8H16O3，分子量160.21。(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯可以用于合成厚殼桂二乙酯(cryptocarya diacetate)。厚殼桂二乙酯是從南美植物Cryptocarya Iatifolia的葉和皮中分離提取的小分子化合物。Cryptocarya Iatifolia具有神奇的藥用功效，可以用于治療頭痛、孕婦晨吐，抗腫瘤，抗肺炎、抗真菌和細(xì)菌等功效。拆分外消旋體3-羥基丁酸叔丁酯，可以獲得(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯，但是拆分效率最大只有50%，生產(chǎn)效率不高。以乙酰乙酸叔丁酯為底物采用化學(xué)法和微生物法不對(duì)稱還原底物中的羰基均可以得到(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯?；瘜W(xué)法不對(duì)稱還原需要制備手性化學(xué)催化劑，價(jià)格昂貴，制備過程繁瑣。采用微生物法不對(duì)稱還原乙酰乙酸叔丁酯可以獲得對(duì)映體過剩值較高的光學(xué)純( - (+) -3-羥基丁酸叔丁酯，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好，成本低廉，易于實(shí)現(xiàn)輔酶的原位再生，微生物易于大規(guī)模培養(yǎng)，易于工業(yè)化生產(chǎn)，是 (S) - (+) -3-羥基丁酸叔丁酯的綠色合成工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)_3-羥基丁酸叔丁酯的方法，該方法反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，環(huán)境友好，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高，易于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)_3-羥基丁酸叔丁酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸叔丁酯為底物，以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCCNo. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制得所述( - (+) -3-羥基丁酸叔丁酯。進(jìn)一步，本發(fā)明所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)_3-羥基丁酸叔丁酯的方法為 反應(yīng)體系以PH 5. O 8. O的磷酸鹽緩沖液為反應(yīng)溶劑，以乙酰乙酸叔丁酯為底物、以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，于25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述 (S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯。所述的乙酰乙酸叔丁酯在磷酸鹽緩沖液中的初始終濃度為1 lOOmmol/L。進(jìn)一步，本發(fā)明所述的反應(yīng)體系中還添加有終濃度為5 20%的乙醇作為輔助底物，有利于提高底物的摩爾轉(zhuǎn)化率。所述的含酶菌體細(xì)胞用量以細(xì)胞干重計(jì)為1 20g/g乙酰乙酸叔丁酯，這里所述的底物的量即乙酰乙酸叔丁酯的質(zhì)量；所述含酶菌體細(xì)胞干重的測(cè)定是將發(fā)酵液離心分離后，棄去上清液，將濕細(xì)胞在120°C烘干48小時(shí)至恒重，測(cè)定干細(xì)胞的重量；取部分發(fā)酵液中離心所得濕細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞干重，計(jì)算出發(fā)酵液中單位含酶菌體細(xì)胞中干細(xì)胞比率，再以這個(gè)比率計(jì)算定量細(xì)胞干重所需含有含酶菌體細(xì)胞發(fā)酵液用量。所述的含酶菌體細(xì)胞按照以下方法制備將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/minJ6 35°C下培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心，制得含酶菌體細(xì)胞。所述的反應(yīng)結(jié)束后，獲得(S)-(+)_3-羥基丁酸叔丁酯純品的方法如下反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取 3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，取濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯。進(jìn)一步，本發(fā)明所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)_3-羥基丁酸叔丁酯的方法按照以下步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種到斜面培養(yǎng)基，26 35°C培養(yǎng)4 6天得菌體斜面；( 種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/minJ6 35°C培養(yǎng)18 2 得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液， 以體積分?jǐn)?shù)10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，26 35°C培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心分離得到所述含酶菌體細(xì)胞；(4)生物轉(zhuǎn)化在pH 5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，添加終濃度為5 20%的乙醇作為輔助底物，加入終濃度為1 lOOmmol/L的乙酰乙酸叔丁酯為底物，以及相當(dāng)于細(xì)胞干重質(zhì)量為乙酰乙酸叔丁酯1 20 倍的含酶菌體細(xì)胞，25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束制得轉(zhuǎn)化液；(5)分離純化轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯。更進(jìn)一步，本發(fā)明所述的(S)-(+)_3-羥基丁酸叔丁酯制備方法推薦按照以下步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種到斜面培養(yǎng)基，沈 35°C培養(yǎng)4 6天得菌體斜面；所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成為麥芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，瓊脂15 25g/L，自然pH值，溶劑為水；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min,26 35°C培養(yǎng)18 2 得種子液；所述的種子培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖 26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 0· 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以體積分?jǐn)?shù)10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中， 搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/minJ6 35°C培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心分離得到所述含酶菌體細(xì)胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖26 32g/L，酵母粉2 4g/L，硫酸銨3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L, K2HPO4 · 3Η20 0· 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用 NaOH 或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為水；(4)生物轉(zhuǎn)化在pH 5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，加入終濃度為1 20mmol/L 的乙酰乙酸叔丁酯為底物，添加終濃度為5 15%的乙醇作為輔助底物，以及相當(dāng)于細(xì)胞干重質(zhì)量為乙酰乙酸叔丁酯1 20倍的含酶菌體細(xì)胞，25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時(shí)， 得轉(zhuǎn)化液；(5)反應(yīng)結(jié)束后獲得(S)-(+)_3-羥基丁酸叔丁酯純品的方法如下反應(yīng)結(jié)束后， 將轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取 3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，取濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯。本發(fā)明所述的(S)-(+)_3-羥基丁酸叔丁酯的對(duì)映體過剩值(ee% )及底物轉(zhuǎn)化率的確定反應(yīng)進(jìn)行過程中，每間隔1 Ilh取樣5mL，樣品4000r/min離心20分鐘，棄去沉淀，將上清液用5mL乙酸乙酯萃取，吸取乙酸乙酯萃取液IyL打入氣相色譜進(jìn)行分析。 氣相色譜型號(hào)為安捷倫7820A，色譜柱為Varian CP Chirasil-DEX手性柱，進(jìn)樣口溫度為 250°C，柱溫為80°C，檢測(cè)口溫度為250°C，載氣為氮?dú)?，載氣流量為lmL/min，在該分析條件下能夠?qū)⒌孜镆阴Ｒ宜崾宥□ァ?S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯和(R)-(-)-3-羥基丁酸叔丁酯完全分開，從而進(jìn)一步計(jì)算出底物的摩爾轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物(S)-(+)_3-羥基丁酸叔丁酯的對(duì)映體過剩值。釀酒酵母CGMCC No. 2266，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心，位于北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)，保藏號(hào)CGMCC No. 2266，保藏日期2007年11月沈日，已在先前授權(quán)專利200810059686中作為新菌株予以保護(hù)。菌株來源本發(fā)明中所述的微生物菌株釀酒酵母CGMCC No. 2266是從杭州西湖啤酒廠附近的土壤中篩選得到。將土壤中分離得到的菌株用于轉(zhuǎn)化乙酰乙酸叔丁酯，得到釀酒酵母CGMCC No. 2266具有良好的轉(zhuǎn)化乙酰乙酸叔丁酯生產(chǎn)(S) - (+)-3-羥基丁酸叔丁酯的能力。所述釀酒酵母CGMCC No. 2266的菌落特征在瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出乳白色、有光澤、平坦、邊緣整齊、濕潤(rùn)、表面光滑，質(zhì)地均勻的菌落形態(tài)。所述的( - (+) -3-羥基丁酸叔丁酯純品可用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，確定產(chǎn)物的純度和分子量。本發(fā)明中采用微生物細(xì)胞不對(duì)稱還原乙酰乙酸叔丁酯制備( - (+) -3-羥基丁酸叔丁酯，可以獲得高對(duì)映體過剩值的產(chǎn)品，添加5 20%的乙醇作為輔助底物有利于提高底物的摩爾轉(zhuǎn)化率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明采用的微生物轉(zhuǎn)化法制備 (S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯與化學(xué)合成法、酶催化法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)生產(chǎn)菌株安全無毒，微生物菌體易于大規(guī)模培養(yǎng)，可以獲得大量的生物催化劑，比化學(xué)催化劑成本低廉；(2)反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好；(3)操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)過程中不需要添加價(jià)格昂貴的輔酶; (4)易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，摩爾轉(zhuǎn)化率高，是(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的綠色合成工藝。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此斜面培養(yǎng)基配制麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L,自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20min，滅菌后冷卻制成斜面。種子和發(fā)酵培養(yǎng)基配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸銨5g/L，無水 MgSO4O. 25g/L，K2HPO4 · 3H201g/L, KH2PO4lg/L，溶劑為水，用 NaOH 或 HCl 溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的PH值為7. 0，121°C滅菌20min。實(shí)施例1將釀酒酵母CGMCC No. 2266菌種接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)6天制得菌體斜面。 用接種針從菌體斜面取一接種環(huán)菌體接種在含有IOOmL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于 30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得種子液。將IOmL種子液(接種量為液體培養(yǎng)基體積用量10% )接種于含有IOOmL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液離心，得含酶菌體細(xì)胞。菌體干重的測(cè)定是將發(fā)酵液離心后從濕細(xì)胞中取小部份在120°C烘干48小時(shí)至恒重，測(cè)定干細(xì)胞的重量，計(jì)算出發(fā)酵液中單位含酶菌體細(xì)胞中干細(xì)胞比率，再以這個(gè)比率計(jì)算定量細(xì)胞干重所需含有含酶菌體細(xì)胞發(fā)酵液用量。本實(shí)施例的每升發(fā)酵液中含有含酶菌體細(xì)胞的干重為50克。在七份含有IOOmL pH7. 0磷酸鹽緩沖液的三角瓶中加入上述所得200mL發(fā)酵液離心后獲得的濕細(xì)胞，其中含有含酶菌體細(xì)胞的干重為10g，分別加入乙酰乙酸叔丁酯，使乙酰乙酸叔丁酯的終濃度分別為 lmmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/ L、1 OOmmo 1/L,均置于30°C，180r/min的搖床中反應(yīng)36h。反應(yīng)結(jié)束后將轉(zhuǎn)化液于4000r/min 離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去少量水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯，底物初始濃度對(duì)摩爾轉(zhuǎn)化率及(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的對(duì)應(yīng)體過剩值(ee% )的影響見表1。表1底物初始濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率及( - (+) -3-羥基丁酸叔丁酯對(duì)映體過剩值的影響
底物濃度(mmol/L )轉(zhuǎn)化率(％)(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的對(duì)映體過剩值(ee % )1100100101001002086.21004075.61006062.11008050.510010038.2100表1可以看出隨著底物濃度的提高轉(zhuǎn)化率逐漸降低。當(dāng)?shù)孜餄舛葹閘Ommol/L 時(shí)轉(zhuǎn)化率為100%。底物濃度對(duì)產(chǎn)物(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的對(duì)映體過剩值沒有影響，在實(shí)驗(yàn)的底物濃度范圍內(nèi)產(chǎn)物(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的對(duì)映體過剩值始終保持 100%。實(shí)施例2將釀酒酵母CGMCC No. 2266菌種接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)6天得菌體斜面。用接種針從菌體斜面取一接種環(huán)菌體接種在含有IOOmL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于 30°CU80r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得種子液。將IOmL種子液(以10%的接種量)接種于含有IOOmL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液離心，得含酶菌體細(xì)胞，每升發(fā)酵液中含有含酶菌體細(xì)胞的干重為50克。在七份含有IOOmL pH7. 0磷酸鹽緩沖液的三角瓶中加入上述所得200mL發(fā)酵液離心后獲得的濕細(xì)胞，其中含有含酶菌體細(xì)胞的干重為10g，分別加入乙酰乙酸叔丁酯使乙酰乙酸叔丁酯終濃度為20mmol/L，各自加入輔助底物乙醇使乙醇體積用量占反應(yīng)體系的體積百分比(ν/ν)分別為 0%、5%、10%、15%、20%、25%和 30%，置于 30°C，180r/min 的搖床中反應(yīng)36h，反應(yīng)結(jié)束后將轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去少量水分，抽濾，將濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(S) - (+) -3-羥基丁酸叔丁酯，輔助底物乙醇濃度對(duì)摩爾轉(zhuǎn)化率及(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的對(duì)應(yīng)體過剩值(ee%)的影響見表2。表2 添加乙醇對(duì)轉(zhuǎn)化率及(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯對(duì)映體過剩值的影響
權(quán)利要求
1.一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述方法是以乙酰乙酸叔丁酯為底物，以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制得所述(S)-(+)_3-羥基丁酸叔丁酯。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的方法為反應(yīng)體系以PH 5. O 8. O的磷酸鹽緩沖液為反應(yīng)溶劑，以乙酰乙酸叔丁酯為底物、以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，于25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯。
3.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的乙酰乙酸叔丁酯在反應(yīng)體系中的初始終濃度為1 lOOmmol/L。
4.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的反應(yīng)體系中還添加有終濃度為5 20%的乙醇作為輔助底物。
5.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的含酶菌體細(xì)胞用量以細(xì)胞干重計(jì)為1 20g/g乙酰乙酸叔丁酯。
6.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的含酶菌體細(xì)胞按照以下方法制備將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/minJ6 35°C下培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心，制得含酶菌體細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯分離純化方法如下反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液4000r/ min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，取濾液蒸餾除去乙酸乙酯， 即得所述(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯。
8.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的方法按照以下步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCCNo. 2266接種到斜面培養(yǎng)基，26 35°C培養(yǎng)4 6天得菌體斜面；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，26 35°C培養(yǎng)18 2 得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以體積分?jǐn)?shù)10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min,26 35°C培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心分離得到所述含酶菌體細(xì)胞；(4)生物轉(zhuǎn)化在pH 5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，添加終濃度為5 20%的乙醇作為輔助底物， 加入終濃度為1 lOOmmol/L的乙酰乙酸叔丁酯為底物，以及相當(dāng)于細(xì)胞干重質(zhì)量為乙酰乙酸叔丁酯1 20倍的含酶菌體細(xì)胞，25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束制得轉(zhuǎn)化液；(5)分離純化轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯。
9.如權(quán)利要求1所述微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述方法按如下步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種到斜面培養(yǎng)基，26 35°C培養(yǎng)4 6天得菌體斜面；所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成為麥芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨 4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，瓊脂15 25g/L，自然pH值，溶劑為水；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，^5 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為 150 200r/min，培養(yǎng)18 2 得種子液；所述的種子培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖沈 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 0. 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以體積分?jǐn)?shù)為10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為26 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，培養(yǎng)18 30h得到含有含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液，離心分離得到所述含酶菌體細(xì)胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖26 32g/ L,酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3Η20 0· 5 1. 5g/ L，KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為水；(4)生物轉(zhuǎn)化在pH5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，加入終濃度為1 20mmol/L的乙酰乙酸叔丁酯為底物，添加終濃度為5 15%的乙醇作為輔助底物，以及相當(dāng)于細(xì)胞干重質(zhì)量為乙酰乙酸叔丁酯1 10倍的含酶菌體細(xì)胞，于25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時(shí)得轉(zhuǎn)化液；(5)分離純化反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，取濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(幻-(+)_3-羥基丁酸叔丁
全文摘要
本發(fā)明提供了一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯的方法在pH 5.0～8.0的磷酸鹽緩沖液中，以乙酰乙酸叔丁酯為底物、以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，于25～45℃下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8～40h，反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述(S)-(+)-3-羥基丁酸叔丁酯；本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)生產(chǎn)菌株安全無毒，易于大規(guī)模培養(yǎng)；(2)可以獲得大量的生物催化劑，成本低廉；(3)反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好；(4)操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)過程中不需要添加價(jià)格昂貴的輔酶，底物摩爾轉(zhuǎn)化率高。
文檔編號(hào)C12P7/62GK102199633SQ201110075348
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者劉擁, 南穎康, 李仁瑋, 歐志敏, 陳慶美, 隋志紅 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)