Crm1在胃癌診斷與治療中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Crm1基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，用于制備胃癌診斷及治療的產(chǎn)品。本發(fā)明的Crm1基因及其表達(dá)產(chǎn)物，可作為診斷胃癌的特異性標(biāo)志基因，使胃癌診斷更加準(zhǔn)確、快速；本發(fā)明的Crm1基因及其表達(dá)產(chǎn)物，還可作為制備治療胃癌藥物的靶基因，提供新的胃癌治療途徑。
【專利說明】Crml在胃癌診斷與治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及Crml基因及其蛋白在胃癌檢測方面的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及Crml抑制劑在胃癌治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是胃癌高發(fā)國家，其發(fā)病率和死亡率分別高居全部惡性腫瘤的第3位和第2位。由于胃癌起病隱匿，早期多無明顯癥狀，不易覺察，使得胃癌的早期發(fā)現(xiàn)非常困難。特別是在我國，超過80%的胃癌在確診時就已處于進(jìn)展期，預(yù)后很差，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康(Leung WK,et al.Lancet Oncol.2008,Yang L.et al.World J Gastroenterol 2006)。
[0003]目前，除了影像學(xué)檢查和內(nèi)鏡檢查之外，生物大分子腫瘤標(biāo)志物的檢測也可用于胃癌的診斷。臨床上常用的生物大分子腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原(CEA)、糖蛋白類抗原(CA19-9、CA125)能提高體內(nèi)惡性腫瘤特別是胃腸道惡性腫瘤的檢出率，但這些標(biāo)志物并不能做到早期高靈敏度、高特異性地診斷胃癌。由于體內(nèi)各器官分化來源、腫瘤的成瘤原因以及腫瘤分泌的腫瘤因子均不相同，因此要特異性地、高靈敏地早期檢測出某一種特定腫瘤，仍是一項很龐大的課題。
[0004]此外，胃癌的治療在過去20年里取得了很大的進(jìn)展，目前以化療方面研究進(jìn)展最快?；熕幬锇ǚ蜞奏ゎ?、絲裂霉素類、蒽環(huán)類、鉬類、阿糖胞苷及亞硝脲類等。盡管此類藥物對胃癌的治療有一定效 果，但其嚴(yán)重的副作用也同時對癌癥病人帶來很多傷害，t匕如胃腸道副作用如惡心、嘔吐、腹灣，或白細(xì)胞減少等，均使化療藥的應(yīng)用受到了限制。
[0005]由此可見，目前迫切需要尋找具有高特異性和有效性的胃癌早期診斷標(biāo)志物，并開發(fā)能夠靶向作用于胃癌，減少對正常組織與人體的傷害的新藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了特異性診斷胃癌的試劑以及治療胃癌的藥物和方法。
[0007]本發(fā)明的第一方面，提供了一種Crml基因或蛋白的用途，用于制備檢測胃癌的試劑或試劑盒。
[0008]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒包括:對Crml進(jìn)行定量檢測的試劑以及相應(yīng)的標(biāo)簽或說明書。
[0009]在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽或說明書中記載了以下使用說明:對Crml進(jìn)行定量檢測，并將檢測結(jié)果用于表征胃癌幾率高低。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括Crml的特異性引物、探針以及芯片。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述的Crml基因來源于哺乳動物，優(yōu)選地來源于人、小鼠、大鼠。更佳地，來源于人。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述的特異性引物包括上游引物和下游引物:所述上游引物序列具有如SEQ ID NO:1所示的序列或其互補序列，所述的下游引物序列具有如SEQ ID NO:2所示的序列或其互補序列。[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的芯片包括核酸芯片和蛋白質(zhì)芯片。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的核酸芯片包括基片和點樣在基片上的癌癥相關(guān)基因的特異性寡核苷酸探針，所述的癌癥相關(guān)基因的特異性寡核苷酸探針包括與Crml的特異性結(jié)合的探針。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白質(zhì)芯片包括基片和點樣在基片上的胃癌相關(guān)蛋白的特異性抗體，所述的胃癌相關(guān)蛋白的特異性抗體包括抗Crml的特異性抗體。
[0016]本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測胃癌的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有檢測Crml的檢測試劑；以及標(biāo)簽或說明書，所述標(biāo)簽或說明書注明所述試劑盒用于檢測胃癌。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的檢測試劑包括:特異性抗體和/或特異性引物。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽或說明書中注明以下內(nèi)容:
[0019]當(dāng)檢測對象的Crml相對β -肌動蛋白的mRNA表達(dá)量與癌旁組織的Crml相對β -肌動蛋白的mRNA表達(dá)量之比>1，則提示該檢測對象患癌癥的幾率高于普通人群。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒用于檢測人胃組織樣品或血液樣品。
[0021]本發(fā)明的第三方面，提供了一種Crml抑制劑的用途，所述的抑制劑被用于制備抑制胃癌細(xì)胞生長或增殖的藥物，或用于制備治療胃癌的藥物。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑包括:Crml的抗體、Crml核酸的反義RNA、siRNA、shRNA以及Crml的活性抑制劑。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑是siRNA或shRNA。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的siRNA正義鏈具有如SEQ ID N0:7所示的序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO:8所示的序列；和/或
[0025]所述的shRNA包括sh-NC和sh-Crml_l ;其中，所述的sh_NC的正義鏈具有如SEQID NO: 11所示的序列，反義鏈具有如SEQ ID NO: 12所示的序列；所述的sh-Crml-1的正義鏈具有如SEQ ID NO: 13所示的序列，反義鏈具有如SEQ ID NO: 14所示的序列。
[0026]本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物，包括Crml抑制劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的Crml抑制劑包括Crml的抗體、Crml核酸的反義RNA、siRNA、shRNA以及Crml的活性抑制劑。
[0028]本發(fā)明的第五方面，提供了一種體外非治療性的抑制胃癌細(xì)胞生長或增殖的方法，包括步驟:在Crml抑制劑存在下，培養(yǎng)癌細(xì)胞，從而抑制癌細(xì)胞生長或增殖。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括向癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加Crml抑制劑，從而抑制抑制癌細(xì)胞生長或增殖。
[0030]本發(fā)明的第六方面，提供了一種篩選治療胃癌的候選化合物的方法，所述方法包括步驟:
[0031](a)測試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測試化合物，并觀察所述測試組的細(xì)胞中Crml的表達(dá)量和/或活性；在對照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測試化合物，并觀察對照組的所述細(xì)胞中Crml的表達(dá)量和/或活性；
[0032]其中，如果測試組中細(xì)胞的Crml的表達(dá)量和/或活性小于對照組，就表明該測試化合物是對Crml的表達(dá)和/或活性有抑制作用的治療胃癌的候選化合物。[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的Crml的表達(dá)量是通過RT-PCR檢測而得出的。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟:
[0035](b)對于步驟(a)中獲得的候選化合物，進(jìn)一步測試其對胃癌細(xì)胞生長或增殖的抑制作用；和/或進(jìn)一步測試其對Crml基因是否有下調(diào)的作用。
[0036]在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中包括步驟:測試組中，胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測試化合物，并觀察胃癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長情況；在對照組中，在胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測試化合物，并觀察胃癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長情況；其中，如果測試組中胃癌細(xì)胞的數(shù)量或生長速度小于對照組，就表明該測試化合物是對胃癌細(xì)胞的生長或增殖有抑制作用的治療胃癌的候選化合物。
[0037]本發(fā)明的第七方面，提供了一種抑制或治療胃癌的方法，包括步驟:給需要治療的對象(哺乳動物)施用安全有效量的Crml抑制劑。
[0038]在另一優(yōu) 選例中,所述的抑制劑包括:Crml蛋白的抗體、Crml的反義RNA、siRNA、shRNA以及Crml的活性抑制劑。
[0039]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1顯示了實施例1中RT-PCR驗證Crml基因在21例胃癌病人癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況示意圖。其中，“N”指癌旁組織，“C”指胃癌組織。結(jié)果顯示13例(61.9%)病人的癌組織中Crml基因表達(dá)量高于相應(yīng)的癌旁組織。
[0041]圖2顯示了實施例2中實時定量PCR檢測Crml基因在人胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況示意圖。結(jié)果顯示10例(66.7%)病人的癌組織中Crml基因表達(dá)量高于相應(yīng)的癌旁組織，與實施例1中RT-PCR的結(jié)果相似。
[0042]圖3顯示了實施例3中在胃癌細(xì)胞BCG823和AGS中干擾Crml基因表達(dá)及分析細(xì)胞增殖情況示意圖。其中，圖3A表示W(wǎng)estern Blot檢測siRNA對Crml基因沉默效果；圖3B是細(xì)胞增殖的數(shù)據(jù)分析。Crml的siRNA分別用si_l和si_2表示，NC表示對照。結(jié)果顯示:特異性干擾Crml基因表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞BCG823和AGS的增殖能力，表明人Crml基因表達(dá)的下調(diào)能在一定程度上抑制胃癌細(xì)胞的生長增殖。
[0043]圖4為實施例4中在胃癌細(xì)胞BCG823和AGS中干擾Crml基因表達(dá)，檢測細(xì)胞軟瓊脂克隆形成能力示意圖。其中,Crml兩種不同干擾位點的siRNA分別用si_l和si_2表示，NC表示對照。結(jié)果顯示受到siRNA干擾而Crml表達(dá)下調(diào)的胃癌細(xì)胞在軟瓊脂克隆形成實驗中受到明顯地抑制。
[0044]圖5為實施例5中在胃癌細(xì)胞BCG823和MKN-28中干擾Crml基因表達(dá)，檢測細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤能力示意圖。其中s1-Crml序列同si_l。結(jié)果顯示受到siRNA干擾而Crml表達(dá)下調(diào)的胃癌細(xì)胞在裸鼠皮下形成腫瘤的能力降低。
[0045]圖6為實施例7中用慢病毒介導(dǎo)的Crml shRNA (用LvshCrml表示)治療裸鼠皮下所成瘤體的情況。結(jié)果顯示慢病毒介導(dǎo)的Lv-shCrml可以明顯抑制瘤體的生長，提示Crml的這種shRNA可以作為治療胃癌的靶點?！揪唧w實施方式】
[0046]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，Crml在胃癌細(xì)胞系中表達(dá)高于癌旁組織或正常組織，可作為胃癌檢測的標(biāo)志物用于檢測或輔助性檢測胃癌。此外，Crml的抑制劑可抑制癌細(xì)胞的生長。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0047]實驗還證明，應(yīng)用Crml的特異抑制劑如干擾RNA(siRNA)、shRNA可以在體外明顯抑制胃癌細(xì)胞的生長和克隆形成能力，且可以影響體內(nèi)腫瘤的成瘤性。因此，使用Crml抑制劑來抑制Crml的功能，可以抑制體外和體內(nèi)的胃癌細(xì)胞的生長，從而為胃癌的治療提供了新的途徑。
[0048]Crml蛋白和多核苷酸
[0049]Crml 的全稱是 chromosome region maintenance I protein (染色體區(qū)域維持蛋白I)，又稱Exportin-1 (Xpol)，其編碼產(chǎn)物介導(dǎo)具有富含亮氨酸的核輸出信號蛋白從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運，它也能夠抑制Rev和U snRNAs的核輸出(Maarten F，etal.Cell.1997)。Crml參與多種細(xì)胞生物學(xué)活動，其作用方式主要與RAN GTPase和運載蛋白形成三元復(fù)合物一起從核孔轉(zhuǎn)運出核。此外，Crml還能行使成熟microRNAs核質(zhì)穿梭的功能，這一功能對microRNAs發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的功能起著作用(Daniela C.etal.PNAS.2009)。已有報道顯示Crml在骨肉瘤和卵巢癌中表達(dá)上調(diào)(Yao Y, et al.0ncolRep.2009, Noske A.et al.Cancer.2008)。
[0050]在本發(fā)明中，“本發(fā)明蛋白”、“本發(fā)明多肽”、“Crml蛋白”可互換使用，指Crml蛋白。應(yīng)理解，所述術(shù)語還包括Crml的活性片段和衍生物。 [0051]在本發(fā)明中，“本發(fā)明基因”、“本發(fā)明多核苷酸”、“Crml基因”指編碼Crml蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正義和反義核酸。
[0052]在本發(fā)明中，術(shù)語“Crml蛋白”、“Crml多肽”或“胃癌標(biāo)志物crml’可互換使用，都指具有Crml氨基酸序列的蛋白或多肽。
[0053]Crml 的核苷酸序列如 SEQ ID N0.: 15 所示，其 GenBank Accession:NM_003400.3，Entrez Gene ID:7514,該核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.: 16所示。
[0054]如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
[0055]如本文所用，“分離的Crml蛋白或多肽”是指Crml蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化Crml蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
[0056]本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
[0057]本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0058]編碼Crml的成熟多肽的多核苷酸包括:只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。[0059]本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。
[0060]本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼Crml蛋白的多核苷酸。
[0061]本發(fā)明的人Crml核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。[0062]一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0063]此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
[0064]應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
[0065]本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或Crml蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
[0066]通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的Crml蛋白。一般來說有以下步驟:
[0067](I)用本發(fā)明的編碼人Crml蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0068](2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
[0069](3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0070]本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人Crml編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0071]此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0072]包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0073]宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有:大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、或293細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
[0074]用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0075]獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
[0076]在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。[0077]抗體
[0078]本發(fā)明還包括對人Crml蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人Crml基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人Crml基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，將提純的人Crml基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人Crml蛋白或它的抗原的細(xì)胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。
[0079]本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
[0080]本發(fā)明的抗體包括可以抑制Crml功能的抗體，也可以是不影響人Crml功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人Crml基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人Crml基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的Crml基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞(如E.coli)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化Crml蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。
[0081]可用于本發(fā)明的Crml抗體可以是抗人Crml蛋白抗體。本發(fā)明的抗人Crml蛋白抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人Crml蛋白。
[0082]抑制劑和藥物組合物
[0083]利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與Crml蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，尤其是抑制劑等。
[0084]本發(fā)明Crml蛋白的抑制劑(包括抗體、反義核酸以及其他抑制劑)，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可抑制Crml蛋白的表達(dá)和/或活性，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的生長或增殖。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于):瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
[0085]可用于本發(fā)明的抑制劑包括:Crml的抗體、Crml核酸的反義RNA、siRNA、shRNA以及Crml的活性抑制劑。其中，典型的Crml抑制劑為siRNA和shRNA。
[0086]可用于本發(fā)明的siRNA包括具有不同干擾位點的s1-Ι和si_2，其中，si_l的正義鏈具有如SEQ ID NO: 7所示的序列，反義鏈具有如SEQ ID NO:8所示的序列；si_2的正義鏈具有如SEQ ID NO: 17所示的序列，反義鏈具有如SEQ ID NO: 18所示的序列。
[0087]可用于本發(fā)明的shRNA，包括sh-NC和sh-Crml_l，所述sh_NC的正義鏈具有如SEQID NO: 11所示的序列，反義鏈具有如SEQ ID NO: 12所示的序列；所述sh-Crml-1的正義鏈具有如SEQ ID NO: 13所示的序列，反義鏈具有如SEQ ID NO: 14所示的序列。
[0088]典型地，將Crml基因作為制備胃癌治療藥物的靶點的技術(shù)方案包括以下方案:
[0089]1.化學(xué)合成雙鏈核糖核酸分子，其序列特異性針對Crml基因序列，利用脂質(zhì)體包裹遞送至胃癌細(xì)胞內(nèi)干擾Crml基因的表達(dá)，觀察軟瓊脂克隆形成能力、細(xì)胞增殖等細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。可利用本領(lǐng)域常規(guī)的方法來設(shè)計和合成特異性針對Crml的核酸序列(如siRNA)。 [0090]2.利用各種載體，包括DNA載體、慢病毒載體來干擾Crml基因的表達(dá)，達(dá)到體內(nèi)干擾Crml基因的效果，檢測它們對裸鼠皮下所成瘤體的治療效果，從而實現(xiàn)抑制胃癌增殖的目的。
[0091]3.獲得能夠特異性抑制Crml基因轉(zhuǎn)運活性的多肽、單克隆抗體，達(dá)到抑制Crml活性的目的，從而現(xiàn)實抑制胃癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的目的。
[0092]本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明Crml抑制劑(如抗體、反義序列(如siRNA)、或抑制劑)以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約I微克-10毫克/千克體重。
[0093]檢測方法和試劑盒
[0094]本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人Crml蛋白水平或mRNA水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的。試驗中所檢測的人Crml蛋白水平，可以用于診斷胃癌。
[0095]一種檢測樣品中是否存在Crml蛋白的方法是利用Crml蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括:將樣品與Crml蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表不樣品中存在Crml蛋白。
[0096]Crml蛋白或其多核苷酸可用于Crml蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列或DNA芯片上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷?？笴rml的抗體可以固定在蛋白質(zhì)芯片上，用于檢測樣品中的Crml蛋白。
[0097]本發(fā)明還提供了一種檢測胃癌的試劑盒，它含有特異性擴增Crml的引物對和/或Crml特異性抗體以及標(biāo)簽或說明書。
[0098]其中，所述的標(biāo)簽或說明書注明以下內(nèi)容:當(dāng)檢測對象的Crml相對β-肌動蛋白的mRNA表達(dá)量與癌旁組織的Crml相對β -肌動蛋白的mRNA表達(dá)量之比>1,則提示該檢測對象患癌癥的幾率高于普通人群。
[0099]所述的試劑盒可用于檢測人胃組織樣品或血液樣品。
[0100]篩選方法
[0101]本發(fā)明還提供了基于Crml進(jìn)行藥物篩選的方法。一種方法是先篩選影響(抑制)Crml表達(dá)或活性的化合物，然后對篩選出的化合物進(jìn)一步測試其對癌細(xì)胞的抑制作用。
[0102]其中，代表性的癌細(xì)胞包括為胃癌細(xì)胞。
[0103]一種優(yōu)選的篩選方法可基于Crml的mRNA的表達(dá)水平。具體步驟如下:
[0104](a)測試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測試化合物，并觀察所述測試組的細(xì)胞中Crml的表達(dá)量和/或活性；在對照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測試化合物，并觀察對照組的所述細(xì)胞中Crml的表達(dá)量和/或活性；
[0105]如果測試組中細(xì)胞的Crml的表達(dá)量和/或活性小于對照組，就表明該測試化合物是對Crml的表達(dá)和/或活性有抑制作用的治療胃癌的候選化合物。
[0106]其中，所述的Crml的表達(dá)量是通過RT-PCR檢測而得出的。
[0107]本篩選方法還可包括步驟:
[0108](b)對于步驟(a)中獲得的候選化合物，進(jìn)一步測試其對胃癌細(xì)胞生長或增殖的抑制作用；和/或進(jìn)一步測試其對Crml基因是否有下調(diào)的作用。
[0109]測試組中，胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測試化合物，并觀察胃癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長情況；在對照組中，在胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測試化合物，并觀察胃癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長情況；其中，如果測試組中胃癌細(xì)胞的數(shù)量或生長速度小于對照組，就表明該測試化合物是對胃癌細(xì)胞的生長或增殖有抑制作用的治療胃癌的候選化合物。
[0110]篩選治療胃癌藥物的方法還可以通過活性氧檢測?；钚匝?ROS)檢測是一種常規(guī)的檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的方法，可通過檢測ROS可以確定Crml的活性。Crml的活性越高，則ROS越低。
[0111]活性氧(ROS)檢測可用市售的檢測試劑盒進(jìn)行。一種活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是利用突光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒。DCFHDA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。
[0112]本發(fā)明中實驗結(jié)果證明特異性針對Crml基因的小核糖核酸分子能夠抑制胃癌細(xì)胞體外的增殖和惡性以及抑制胃癌細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤性能，說明Crml基因可用作制備胃癌治療藥物的靶基因。
[0113]本發(fā)明的有益效果
[0114]1.Crml的表達(dá)水平和活性水平可用作胃癌檢測的標(biāo)志物:Crml在胃癌組織或血清內(nèi)的高表達(dá)可以作為診斷胃癌的標(biāo)志物，其特異性、靈敏度高，操作簡便。
[0115]2.Crml抑制劑可以有效抑制胃癌細(xì)胞增殖，或作為治療胃癌的藥物。
[0116]以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆:實驗室手冊(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0117]通用方法:
[0118]1.組織分離及總RNA抽提
[0119]1.1組織分離
[0120]實驗用組織來源于胃癌的手術(shù)病人。手術(shù)切除的腫塊一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中(-80°C)保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。
[0121]1.2 總 RNA 抽提
[0122]采用Invitrogen公司的Trizol試劑，按照常規(guī)的抽提步驟，抽提總核糖核酸(RNA)0該Trizol試劑是基于酸性酚一步抽提法生產(chǎn)的。抽提所用器皿和水均進(jìn)行核糖核酸酶滅活處理，以保證實驗中無核糖核酸酶的環(huán)境。
[0123]核糖核酸(RNA)提取的一般步驟是:破碎組織一分離RNA—沉淀RNA—洗滌RNA —融解RNA —保存RNA。破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。分離RNA —半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA —般分布于上層，與蛋白層分開。沉淀RNA —般用乙醇、3Μ NaAc (ρΗ_5.2)或異丙醇。洗滌RNA使用70%乙醇洗滌。融解RNA一般使用TE。保存RNA應(yīng)該盡量低溫。
[0124]2.反轉(zhuǎn)錄
[0125]2.1冰浴離心管里面加入模板RNA 2μ g，引物(10ρπιο1)2μ L，去離子水補齊至15 μ L,混勻,離心3~5秒。
[0126]2.2 70 °C水浴5分鐘，冰浴30秒。
[0127]2.3 加入 5 XM-MLV 反應(yīng)緩沖液 5 μ L, RNase 抑制劑(25units/ μ L) I μ L、dNTP 混合物(各自濃度為IOmM) 1.25 μ I，混勻。
[0128]2.4 37°C水浴 5 分鐘，加入 I μ L AMV-RT 反轉(zhuǎn)錄酶(200units/μ L)，混勻。
[0129]2.5 37°C水浴I小時(此步是反轉(zhuǎn)錄過程)。
[0130]2.6 70°C，10分鐘結(jié)束反應(yīng)，產(chǎn)物置冰上進(jìn)行下一步PCR實驗，余下的_70°C保存。
[0131]3.RT-PCR 及實時定量 PCR
[0132]3.1 RT-PCR及其引物設(shè)計
[0133]RT-PCR (逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是指將逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription ；RT)反應(yīng)和PCR(Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)組合在一起的方法。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly (A)選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機引物、ο I i go (dT)或基因特異性的引物(GSP )起始。
[0134]PCR的反應(yīng)條件如下:94 °C，5分鐘預(yù)變性；94 °C，30秒變性；55 °C，30秒退火；72 °C，30秒延伸；35個循環(huán)，電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。
[0135]設(shè)計的引物具體如下:
[0136]Crml: (F)如 SEQ ID NO:1 所示；(R)如 SEQ ID NO: 2 所示；
[0137]β-actin:(F)如 SEQ ID NO:3 所示；β-actin (R)如 SEQ ID N0:4 所示。
[0138]以管家基因β-actin作為內(nèi)對照，PCR反應(yīng)體系為=IOXTaq Buffer 2 μ 1，dNTP混合物(各自濃度為10π?Μ)0.5μ 1，10μΜ正向引物0.5μ 1，10μΜ反向引物0.5μ 1，模板cDNA 2 μ 1，Taq 酶(5U/μ 1，TaKaRa) 0.5 μ 1，CldH2O 14 μ 1，總體系 20 μ I。
[0139]3.2實時定量PCR
[0140]采用相對定量法檢測Crml基因在胃癌樣本中的表達(dá)差異。使用日本Takara公司的 ΤΡ800 型實時突光定量 PCR 儀(Thermal Cycler Dice?Real Time System)和SYBR?Premix Ex Taq?試劑。儀器的使用按廠家的說明操作。
[0141]熒光定量PCR (real-time PCR)反應(yīng)體系如下:總體積 20 μ L, SYBR Premix ExTaq 10 μ L,上、下游引物(10 μ mol/L)各 0.4 μ L，cDNA I μ L, ddH20 8.2 μ L,混勻試劑，離心后放入PCR儀中進(jìn)行擴增反應(yīng)。
[0142]反應(yīng)條件:95°C，30秒預(yù)變性；95°C，5秒變性，60°C，30秒退火/延伸，共40個循環(huán)。引物具體如下:
[0143]Crml所用引物與半定量RT-PCR所用Crml引物一致，其上游引物如SEQ ID NO:1所示；下游引物如SEQ ID N0:2所示。
[0144]管家基因β-actin作為內(nèi)參，其上游引物如SEQ ID NO:5所示；下游引物如SEQID NO:6 所示。
[0145]4.抗原抗體制備
[0146]4.1抗原蛋白的獲得
[0147]從Genebank數(shù)據(jù)庫中獲得人Crml基因的cDNA序列，通過PCR擴增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達(dá)載體中，表達(dá)Crml蛋白，并按基因工程表達(dá)產(chǎn)物的純化體系純化蛋白。
[0148]4.2抗體的制備
[0149]可采用以下幾種方法制備抗體:
[0150]4.2.1細(xì)胞融合法:用上述制備的Crml蛋白免疫動物(包括兔子、山羊等)，獲得脾臟細(xì)胞，再與骨髓瘤細(xì)胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)制備單克隆抗體。
[0151]4.2.2利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動物的脾臟IgG可變區(qū)并表達(dá)成基因工程單克隆抗體。
[0152]4.2.3利用純化的蛋白免疫動物，制備多抗血清。
[0153]5.RNA干擾實驗
[0154]5.1 siRNA干擾后細(xì)胞增殖能力實驗
[0155]采用Dojindo Laboratories 的 Cell Counting Kit_8 試劑，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行:
[0156]5.1.1轉(zhuǎn)染前一天，將一定量的細(xì)胞用無抗生素的培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)皿中(接種的數(shù)量取決于不同細(xì)胞的生長速度)，使其到轉(zhuǎn)染時能夠達(dá)到30 - 50%的密度。
[0157]5.1.2 配制 siRNA-Lipofectamine? 2000 轉(zhuǎn)染復(fù)合物，包括:A 管:Lipofectamine? 2000 與Opt1-MEM*混勻，室溫靜置 5min ；B 管:siRNA 與Opt1-MEM?混勻，室溫靜置5min。
[0158]5.1.3混合A管和B管，室溫孵育20min。
[0159]5.1.4細(xì)胞吸去培養(yǎng)液，換為Free (無血清、無抗生素)的培養(yǎng)液，加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物(siRNA的終濃度為33nM)，混勻。
[0160]5.1.5 37°C，5%C02培養(yǎng)4 - 6h后，更換培養(yǎng)液為完全培養(yǎng)液(含10%FBS)。
[0161]5.1.6轉(zhuǎn)染24 - 72h后消化細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入IOOul含3000個細(xì)胞的培養(yǎng)液，每個樣品3個復(fù)孔。
[0162]5.1.7每隔一天用CCK8試劑檢測，連續(xù)5 — 7天。具體方法為向每孔中分別加入IOul CCK8試劑，37°C培養(yǎng)2小時，用酶標(biāo)儀檢測A450。[0163]5.1.8細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時后，消化回收細(xì)胞。
[0164]5.2 siRNA干擾后軟瓊脂克隆形成能力檢測
[0165]5.2.1將37。C保溫的2%Agarose和2.5xDMEM等體積混合，加到24孔板中，每孔
0.5ml,置于4° C冰箱,待凝固后使用。
[0166]5.2.2以80%密度將BCG823和AGS接種于大盤中，用脂質(zhì)體包裹的方法轉(zhuǎn)染siRNA或陰性對照siRNA至細(xì)胞中，含10%FBS的DMED條件培養(yǎng)24-36小時后，消化，計數(shù)，稀釋成相同濃度。
[0167]5.2.3將細(xì)胞懸液與37° C保溫的1% Agarose等體積混合，加到已鋪好下層膠的24孔板中，每孔0.5ml，置于4。C冰箱10分鐘。
[0168]5.2.4在凝固的軟瓊脂上加入0.2ml的培養(yǎng)液，置于37° C，5%C02培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)2-3周。
[0169]5.3 siRNA干擾后裸鼠皮下成瘤能力檢測
[0170]5.3.1以80%密度將BCG823和Mkn_28接種于大盤中，用脂質(zhì)體包裹的方法轉(zhuǎn)染siRNA或陰性對照至細(xì)胞中，含10%FBS的DMED條件培養(yǎng)24-36小時后，消化，計數(shù)。
[0171]5.3.2分別注射2 X IO6個細(xì)胞至裸鼠腹部左側(cè)和右側(cè)皮下，SPF培養(yǎng)室，培養(yǎng)I 一2月。
[0172]5.3.3大約一周待長出瘤體后，每隔2天用游標(biāo)卡尺測量瘤子的長和寬，利用公式V =長X寬2/2計算瘤體體積。
[0173]5.3.4 —個月后，殺掉裸鼠取出瘤體，稱重并拍照。
[0174]5.4 shRNA干擾后裸鼠皮下成瘤能力檢測
[0175]5.4.1將正常培養(yǎng)的BCG823細(xì)胞IX IO6個細(xì)胞/只，注射入裸鼠腹部皮下，隨機分成2組；
[0176]5.4.2待成瘤后，瘤體大小約5mm直徑時開始向瘤體內(nèi)多點注射，兩組分布注射shRNA及陰性對照慢病毒，每次注射5 X IO7拷貝的慢病毒量，每3天注射一次，共5次。
[0177]5.4.3 —個半月后，殺掉裸鼠，取出瘤體，稱重。
[0178]實施例1 RT-PCR實驗檢測Crml基因在胃癌組織中的表達(dá)情況
[0179]對通用方法I中收集的胃癌樣本總RNA，采用通用方法2和3.1的RT-PCR進(jìn)行實驗檢測，測定Crml基因在胃癌組織中的表達(dá)情況。
[0180]實驗結(jié)果如圖1所示，Crml基因在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織中的表達(dá)水平:在21例胃癌病例中，13例癌組織中Crml基因的表達(dá)量高于癌旁組織，占61.9%的比例。其中，“N”指癌旁組織，“C”指胃癌組織。
[0181]本實施例結(jié)果說明，可通過RT-PCR診斷胃癌:即設(shè)計Crml基因的PCR引物，檢測腫瘤組織中Crml基因RNA的含量，RNA含量高則說明患胃癌的可能高，反之則低。
[0182]實施例2實時定量PCR檢測Crml基因在胃癌組織中的表達(dá)情況
[0183]樣本同實施例1，區(qū)別在于采用通用方法3.2實時定量PCR檢測。
[0184]實驗結(jié)果如圖2所示，Crml基因在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織中的表達(dá)水平:15對樣本中有10對Crml表達(dá)上調(diào)(見圖2)。
[0185]本實施例結(jié)果說明，可通過 實時定量PCR診斷胃癌:設(shè)計Crml基因的PCR引物，檢測腫瘤組織中Crml基因RNA的含量，RNA含量高則說明患胃癌的可能性高，反之則低。
[0186]實施例3Crml基因的小干擾核糖核酸(siRNA)及其干擾后細(xì)胞增殖能力測試
[0187]針對Crml基因mRNA序列，設(shè)計并體外化學(xué)合成了 siRNA (s1-l、si_2)，其對應(yīng)的靶序列如下:
[0188]s1-Ι:正義鏈如SEQ ID N0:7所示；反義鏈如SEQ ID N0:8所示；
[0189]s1-2:正義鏈如SEQ ID NO:1 7所示；反義鏈如SEQ ID NO: 18所示；
[0190]另外設(shè)置無關(guān)序列作為陰性對照siRNA，其序列如下:
[0191]正義鏈如SEQ ID NO:9所示；反義鏈如SEQ ID NO: 10所示。
[0192]采用通用方法5.1進(jìn)行siRNA干擾后細(xì)胞增殖能力檢測
[0193]實驗結(jié)果如圖3所示:特異性干擾Crml基因表達(dá)(si_l和si_2)能夠抑制胃癌細(xì)胞BCG823和AGS的增殖能力，表明人Crml基因表達(dá)的下調(diào)能在一定程度上抑制胃癌細(xì)胞的生長增殖。
[0194]實施例4siRNA干擾后軟瓊脂克隆形成能力檢測
[0195]采用實施例3中的siCrml序列以及通用方法5.2進(jìn)行siRNA干擾后軟瓊脂克隆形成能力檢測。
[0196]實驗結(jié)果如圖4所示:轉(zhuǎn)染siCrml (si_l、si_2)后，腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂上形成的細(xì)胞株明顯少于陰性對照組。
[0197]本實施例結(jié)果說明，siRNA表達(dá)特異性干擾Crml后，能夠有效限制胃癌細(xì)胞株在軟瓊脂上的克隆形成能力，間接表明Crml下調(diào)降低了胃癌細(xì)胞的惡性程度。
[0198]實施例5siRNA干擾后裸鼠皮下成瘤能力檢測
[0199]采用實施例4中的siCrml序列以及通用方法5.3進(jìn)行siRNA干擾后裸鼠皮下成瘤能力檢測。
[0200]實驗結(jié)果如圖5所示:轉(zhuǎn)染siCrml的胃癌細(xì)胞成瘤體積和重量都比轉(zhuǎn)染siNC對照組小。本實施例結(jié)果說明，Crml的下調(diào)有效抑制了胃癌細(xì)胞在裸鼠皮下的生長。
[0201 ] 實施例6針對Crml基因設(shè)計合成shRNA
[0202]由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA片段sh-NC和sh-Crml-Ι，序列如下:
[0203]sh-NC:正義鏈 SEQ ID NO: 11 所示；反義鏈如 SEQ ID NO: 12 所示；
[0204]Sh-Crml-1 正義鏈如 SEQ ID NO: 13 所示；反義鏈如 SEQ ID NO: 14 所示。
[0205]pSUPER 載體(Oligoengine, Seattle, WA, USA)全長 3176bp,選用限制性內(nèi)切酶位點BglII和HindIII作為DNA片段插入位點，載體構(gòu)建步驟如下:
[0206](I) ddH20溶解合成的DNA粉末為10 μ Μ，取正義鏈與反義鏈各I μ 1，加入48 μ I的退火緩沖液中，經(jīng)過95° C，4分鐘；70° C，10分鐘孵育后室溫自然放置冷卻，退火形成雙鏈 DNA ；
[0207](2)雙鏈DNA的末端磷酸化:反應(yīng)體系如下:2 μ I已退火的雙鏈DNA，I μ 1Τ4 PNK緩沖液，I μ I ATP (ImM), I μ I Τ4 ΡΝΚ, 5 μ I ddH20 ;37。C，30 分鐘孵育;70。C，10 分鐘熱失活T4 PNK ；
[0208](3)BglII 和 HindIII 雙酶切 pSUPER:20 μ I 體系如下:2 μ I IOxK buffer, I μ IBglILly I HindIII,2y g pSUPER 質(zhì)粒，ddH20 補至 20 μ 1，37。C 反應(yīng) I 小時；使用堿性磷酸酶處理線性化的PSUPER，去除末端的磷酸基團，防止質(zhì)粒的自連；
[0209](4)連接:2 μ I退火的磷酸化雙鏈DNA oligos, I μ I連接酶buffer, I μ I雙酶切后的pSUPER質(zhì)粒，1μ I連接酶，5 μ I ddH20，16° C反應(yīng)I小時；
[0210](5)轉(zhuǎn)化；
[0211](6)小抽質(zhì)粒并用EcoR1-Hindlll酶切鑒定，陽性克隆經(jīng)過酶切后大小約360bp的片段，最后陽性克隆經(jīng)測序驗證插入序列完全正確，-20° C保存，用于后續(xù)實驗。
[0212]實施例7瘤內(nèi)多點注射檢測shCrml-1慢病毒對瘤體的治療作用
[0213]采用實施例6中的sh-Crml-Ι序列，由上海吉碼生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)包裝慢病毒LV — shCrml — I及對照慢病毒LV — shNC。
[0214]實驗結(jié)果如圖6所示:注射LV — Crml — I (用Lv_shCrml表示)慢病毒的瘤體體積和重量明顯小于對照組，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0215]本實施例結(jié)果說明，Crml的慢病毒干擾載體對胃癌的治療具有積極意義。
[0216]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種Crml基因或蛋白的用途，其特征在于，用于制備檢測胃癌的試劑或試劑盒。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的試劑盒包括:對Crml進(jìn)行定量檢測的試劑以及相應(yīng)的標(biāo)簽或說明書。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的試劑包括Crml的特異性引物、探針以及芯片。
4.一種用于檢測胃癌的診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有檢測Crml的檢測試劑；以及標(biāo)簽或說明書，所述標(biāo)簽或說明書注明所述試劑盒用于檢測胃癌。
5.一種Crml抑制劑的用途，其特征在于，所述的抑制劑被用于制備抑制胃癌細(xì)胞生長或增殖的藥物，或用于制備治療胃癌的藥物。
6.如權(quán)利要求5所述的用途,其特征在于,所述的抑制劑包括:Crml的抗體、Crml核酸的反義RNA、siRNA, shRNA以及Crml的活性抑制劑。
7.—種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括Crml抑制劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
8.—種體外非治療性的抑制胃癌細(xì)胞生長或增殖的方法，其特征在于，包括步驟:在Crml抑制劑存在下，培養(yǎng)癌細(xì)胞，從而抑制癌細(xì)胞生長或增殖。
9.一種篩選治療胃癌的候選化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (a)測試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測試化合物，并觀察所述測試組的細(xì)胞中Crml的表達(dá)量和/或活性；在對照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測試化合物，并觀察對照組的所述細(xì)胞中Crml的表達(dá)量和/或活性； 其中，如果測試組中細(xì)胞的Crml的表達(dá)量和/或活性小于對照組，就表明該測試化合物是對Crml的表達(dá)和/或活性有抑制作用的治療胃癌的候選化合物。
10.如權(quán)利要求9所述 的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟: (b)對于步驟(a)中獲得的候選化合物，進(jìn)一步測試其對胃癌細(xì)胞生長或增殖的抑制作用；和/或進(jìn)一步測試其對Crml基因是否有下調(diào)的作用。
【文檔編號】A61P35/00GK103937872SQ201310025332
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月23日
【發(fā)明者】高勇, 李硯東 申請人:上海市東方醫(yī)院