專利名稱：利用核酸微陣列的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增加利用核酸微陣列的分析中的測(cè)量值可靠性的方法。
背景技術(shù)：
作為利用染色體作為目標(biāo)檢測(cè)過(guò)量、缺失、擴(kuò)增等基因組DNA異?？截悢?shù)的方法， 存在由Joe Gray, Dan Pinkel, O-P Kallioniemi等開(kāi)發(fā)的基因組CGH法。通常，這存在多 種問(wèn)題，因?yàn)槿旧w異常不能被檢測(cè)，除非該異常位于涵蓋5-10Mb以上的大區(qū)域內(nèi)，需要 進(jìn)行分析的技能等(J. Inazawa 禾口 M. Minaguchi, Rinsho Kensa(Clinical Inspection (臨 床檢驗(yàn)))，49，497-502 (2005))。存在這樣的陣列CGH法，其作為工具，可以檢測(cè)發(fā)生在幾十1Λ到若干Mb水平上 的基因組結(jié)構(gòu)異常，分辨率高于由染色體分析可以分析得到的分辨率(D. Pinkel等，Nat. Genet.(自然遺傳學(xué))，20，207-211 (1998)，以及 I. Lnoto 和 J. hazawa，Saibo Kogaku (Cell Engineering (細(xì)胞工程))，23，355-361 (2004))。陣列CGH方法使用這樣的陣列，其中 將基因組DNA的片段，諸如BAC(細(xì)菌人工染色體)克隆，YAC(酵母人工染色體)克隆， PAC (Pl-來(lái)源的人工染色體)或基于這些BAC，YAC, PAC等制備的DNAs或寡核苷酸排列在 固體基板上，這通過(guò)將它們點(diǎn)樣在該基板上完成。另外，存在通過(guò)從由患者等采集的作為待 測(cè)樣品使用的異常細(xì)胞和由健康人采集的作為標(biāo)準(zhǔn)樣品使用的正常細(xì)胞提取靶DNA樣品 來(lái)檢測(cè)相對(duì)基因拷貝數(shù)的方法，用各自不同的標(biāo)記物(熒光物質(zhì)等)對(duì)它們進(jìn)行標(biāo)記，容許 它們同時(shí)與核酸微陣列上的探針相接觸，由此容許它們通過(guò)雜交進(jìn)行相互作用，利用掃描 儀等讀取由相互作用的靶核酸產(chǎn)生的熒光信號(hào)，和比較正常細(xì)胞和異常細(xì)胞來(lái)源的靶核酸 的信號(hào)強(qiáng)度比。當(dāng)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品用各自不同的標(biāo)記化合物來(lái)標(biāo)記并容許其在進(jìn)行利用核酸微陣 列的分析中與核酸微陣列雜交時(shí)，由不同樣點(diǎn)(點(diǎn)樣量等)等或由雜交差異導(dǎo)致的、微陣列 批次之間產(chǎn)生的數(shù)據(jù)差異幾乎不存在。然而，由于標(biāo)記不同，所以標(biāo)記效率差異、關(guān)于個(gè)體 標(biāo)記的檢測(cè)系統(tǒng)的差異等傾向于對(duì)結(jié)果施加影響，并且其伴隨著總是需要為一種待測(cè)樣品 制備標(biāo)準(zhǔn)品的復(fù)雜性。為了排除標(biāo)記差異，當(dāng)使用這樣的方法時(shí)該問(wèn)題不存在，在所述方法 中，標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品用相同的標(biāo)記化合物來(lái)標(biāo)記并容許分別與兩種或多種核酸陣列進(jìn)行 雜交，并在它們之間進(jìn)行評(píng)估。然而，該方法產(chǎn)生一個(gè)問(wèn)題，即其中曾經(jīng)通過(guò)同時(shí)進(jìn)行雜交 解決的由于樣點(diǎn)差異引起的數(shù)據(jù)波動(dòng)在進(jìn)行分別的標(biāo)記中再次產(chǎn)生。作為用于解決這些問(wèn) 題的方法，存在這樣的方法，其中通過(guò)在微陣列上新裝配用于校正和內(nèi)標(biāo)使用的樣點(diǎn)來(lái)校 正陣列之間的差異，但是它不能校正分開(kāi)的樣點(diǎn)之間的差異(例如，JP-A-2004-028695)。發(fā)明概述本發(fā)明待解決的問(wèn)題是提供能夠在進(jìn)行利用核酸微陣列的測(cè)量法中同時(shí)解決以 下問(wèn)題的方法，所述問(wèn)題為利用兩種或多種標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的方法的問(wèn) 題，其中標(biāo)記物之間的差異對(duì)數(shù)據(jù)施加影響，和其中當(dāng)利用一種標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記待測(cè)樣品和 標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)個(gè)體樣點(diǎn)之間的差異對(duì)數(shù)據(jù)施加影響的問(wèn)題。
當(dāng)利用一種標(biāo)記物進(jìn)行核酸微陣列測(cè)量時(shí)，作為提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的測(cè)量之一，存 在這樣的策略，其中陣列之間的差異通過(guò)在陣列上合成寡核苷酸探針被降至盡可能低，如 在基因芯片(GeneChip)的情形中，陣列之間的雜交差異通過(guò)以這樣的方式設(shè)計(jì)序列被降 至盡可能低，所述方式使所謂的探針Tm值變得等價(jià)，且標(biāo)記步驟中的差異也通過(guò)安排校正 樣點(diǎn)來(lái)降低，但是該校正方法非常復(fù)雜且在一個(gè)樣點(diǎn)具有兩種或多種序列的核酸微陣列的 情形中特別難以通過(guò)該策略進(jìn)行比較(例如，JP-A-2004-028695)。因此，通過(guò)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)容許在陣列上全部樣點(diǎn)中和不同陣列之間的相似樣點(diǎn)上 具有基本相同結(jié)合能力的核酸，即具有能夠與全部樣點(diǎn)上探針核酸的至少一部分雜交的序 列的鑒定核酸，與待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品共存時(shí)，可以檢測(cè)探針核酸樣點(diǎn)之間的差異，且鑒定核 酸的結(jié)合量通過(guò)分別進(jìn)行雜交來(lái)檢測(cè)。另外，能夠利用結(jié)合量作為指標(biāo)校正樣點(diǎn)之間的差 異，由此導(dǎo)致本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)。例如，通過(guò)容許由Cy 3標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品和由Cy 5標(biāo)記的鑒定核酸共存，在第一陣列 板上進(jìn)行雜交。在另一方面，在第二陣列板上，由Cy 3標(biāo)記的待測(cè)樣品和由Cy 5標(biāo)記的鑒 定核酸的混合物與該陣列上的探針核酸雜交。當(dāng)通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品發(fā)現(xiàn)差異時(shí)， 可能通過(guò)利用鑒定核酸進(jìn)行其校正來(lái)消除樣點(diǎn)之間的差異。在該情形中，理想的是由Cy 5標(biāo)記的鑒定核酸是具有同一序列的核酸，且理想的 是它們的制備是同一的。另外，作為用于校正樣點(diǎn)之間差異的方法，可以是任何具有以下限 制條件的計(jì)算法，所述限制條件為校正可以理論上利用任何計(jì)算法進(jìn)行。優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)品和 待測(cè)樣品通過(guò)利用獲自鑒定核酸的熒光值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的熒光值比來(lái)比較。理想的是將標(biāo)記的鑒定核酸和標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入到同一溶液中并通過(guò)乙醇 沉淀法等濃縮該溶液的體積，并且即使在其不能進(jìn)行時(shí)，理想的是將核酸濃度濃縮到盡可 會(huì)邑1 。即，本發(fā)明由以下部分組成。(1) 一種借助于核酸微陣列的分析法，所述核酸微陣列具有在其上固定第一探針 核酸的樣點(diǎn)(X 1)，所述方法包括容許待測(cè)樣品的標(biāo)記的樣品核酸(A 1)與固定在所述樣點(diǎn)(X 1)上的第一探針核 酸雜交；對(duì)所述樣點(diǎn)(X 1)提供標(biāo)記的鑒定核酸(B)，所述鑒定核酸(B)具有能夠與第一探 針核酸的至少一部分雜交的序列并用與標(biāo)記的樣品核酸(A 1)不同的標(biāo)記物標(biāo)記，并容許 所述標(biāo)記的鑒定核酸(B)在所有樣點(diǎn)處與至少所述第一探針核酸雜交；測(cè)量在樣點(diǎn)(X 1)上雜交的標(biāo)記的樣品核酸(A 1)的標(biāo)記量值(F 1)；和測(cè)量在樣點(diǎn)(X 1)上雜交的標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值(Fe 1)。(2)如上(1)中所述的分析法，其中容許標(biāo)記的樣品核酸(A 1)進(jìn)行雜交和容許標(biāo)記的鑒定核酸(B)進(jìn)行雜交是 同時(shí)進(jìn)行的，且測(cè)量雜交的標(biāo)記的樣品核酸(A 1)的量和測(cè)量雜交的鑒定核酸(B)的量是同時(shí)進(jìn) 行的。(3)如上(1)或(2)中所述的分析法，其中固定在樣點(diǎn)(X 1)上的第一探針核酸的量基于標(biāo)記量值(Fe 1)檢測(cè)，且標(biāo)記量值(F 1)基于該檢測(cè)的量來(lái)校正。(4)如上(1)-(3)中任一項(xiàng)所述的分析法，還包括對(duì)樣點(diǎn)(Χ η)提供與標(biāo)記的樣品核酸(A 1)相同或不同的標(biāo)記的樣品核酸(Α η)， 在所述樣點(diǎn)(Χ η)上固定有具有固定在樣點(diǎn)(X 1)上的第一探針核酸的基本相同序列的第 η探針核酸，和容許所述標(biāo)記的樣品核酸(Α η)與固定在樣點(diǎn)(Χ η)上的第η探針核酸雜 交，所述樣點(diǎn)(Χ η)存在于樣點(diǎn)(X 1)的同一個(gè)核酸微陣列或另一個(gè)核酸微陣列上；對(duì)樣點(diǎn)(Χ η)提供標(biāo)記的鑒定核酸(B)，并容許所述標(biāo)記的鑒定核酸(B)與至少第 η探針核酸雜交；測(cè)量在樣點(diǎn)(Χ η)上雜交的標(biāo)記的樣品核酸(Α η)的標(biāo)記量值(F η)；和測(cè)量在樣點(diǎn)(Χ η)上雜交的標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值(Fe η)。(5)如上(4)中所述的分析法，還包括通過(guò)比較標(biāo)記量值(Fe 1)和(Fe η)，計(jì)算樣點(diǎn)(X 1)和樣點(diǎn)(Χ η)處的標(biāo)記量值 的系數(shù)。(6)如上(4)或(5)中所述的分析法，其中標(biāo)記的樣品核酸(A 1)和標(biāo)記的樣品核酸(Α η)通過(guò)標(biāo)記獲自不同樣品的核 酸來(lái)制備。(7)如上(1)-(6)中任一項(xiàng)所述的分析法，其中在與標(biāo)記化合物混合前，另外將與標(biāo)記的鑒定核酸(B)的同種相同的未標(biāo)記 的核酸加入至標(biāo)記的鑒定核酸(B)的雜交中。(8)如上(4)-(7)中任一項(xiàng)所述的分析法，其中與樣點(diǎn)(Χ η)上的標(biāo)記的樣品核酸(Α η)的雜交量相對(duì)應(yīng)的校正的標(biāo)記量值 通過(guò)利用下式(1)計(jì)算式(1)；標(biāo)記的樣品核酸(Α η)的校正的標(biāo)記量值=標(biāo)記量值(Fe 1)/標(biāo)記量值 (Fe η)χ第η標(biāo)記的樣品核酸(Α η)的標(biāo)記量值(F η) (η是2以上的整數(shù))。(9)如上(1)-(8)中任一項(xiàng)所述的分析法，其中標(biāo)記的樣品核酸(A 1)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)的至少一種標(biāo)記通過(guò)熒光進(jìn) 行。(10)如上(1)-(9)中任一項(xiàng)所述的分析法，其中使用BAC-DNA微陣列作為核酸微陣列。
(11)如上(I)-(IO)中任一項(xiàng)所述的分析法，其中兩個(gè)或多個(gè)同種樣點(diǎn)(Χ η)存在于不同的核酸微陣列中，且各核酸微陣列之 間的第η探針核酸的排列和第η探針核酸點(diǎn)樣量在各核酸微陣列之間不同。(12)如上(I)-(Il)中任一項(xiàng)所述的分析法，其中使用與樣品的核酸不同并具有在第一和第η探針核酸上序列的核酸作為標(biāo) 記的鑒定核酸⑶。(13)如上(1)-(12)中任一項(xiàng)所述的分析法，其中使用含有重復(fù)序列的核酸作為標(biāo)記的鑒定核酸(B)。(14)如上(1)-(13)中任一項(xiàng)所述的分析法，其中使用Cot-I DNA作為標(biāo)記的鑒定核酸(B)。
(15)如上(1)-(12)中任一項(xiàng)所述的分析法，其中使用載體來(lái)源的核酸作為標(biāo)記的鑒定核酸(B)。(16)如上(1)-(15)中任一項(xiàng)所述的分析法，其中標(biāo)記量值(F 1)和(Fe 1)中的標(biāo)記量值(Fe 1)由數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)提供。(17)引起計(jì)算機(jī)執(zhí)行用于如上(5)-(16)中任一項(xiàng)所述的分析法的過(guò)程的程序， 所述過(guò)程包括基于標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值(Fe 1)和標(biāo)記量值(Fe η)校正第η標(biāo)記的 樣品核酸(Α η)的標(biāo)記量值(F η) (η是2以上的整數(shù))。(18)計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其存儲(chǔ)有引起計(jì)算機(jī)執(zhí)行用于如上(5)-(16)中任一項(xiàng)所 述的分析法的過(guò)程的程序，所述過(guò)程包括基于標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值(Fe 1)和標(biāo)記量值(Fe η)校正第η標(biāo)記的 樣品核酸(Α η)的標(biāo)記量值(F η) (η是2以上的整數(shù))。(19)計(jì)算樣品間基因表達(dá)量或樣品間基因拷貝數(shù)的方法，其通過(guò)利用如上 (1)-(16)中任一項(xiàng)所述的分析法進(jìn)行。(20)用于如上(1)-(16)中任一項(xiàng)所述的分析法的試劑盒，所述試劑盒包括核酸微陣列，其具有許多樣點(diǎn)，在每個(gè)樣點(diǎn)上固定有探針核酸；和鑒定核酸，其具有能夠與核酸微陣列上全部樣點(diǎn)處探針核酸的至少各自一部分雜 交的序列。附圖簡(jiǎn)述

圖1是本發(fā)明原理的示意圖。在該示意圖中，為了簡(jiǎn)化僅顯示其中樣品來(lái)源的標(biāo) 記樣品核酸的種類為兩種的情形。另外，樣點(diǎn)數(shù)通過(guò)將其簡(jiǎn)化為16樣點(diǎn)/核酸微陣列來(lái)顯 示。A1-A4和al-a4顯示基本相同的探針核酸。在下文中，一組B1-B4和bl_b4，一組C1-C4 和cl-c4以及一組D1-D4和dl-d4分別顯示相同的探針核酸；圖2是當(dāng)使用雌性DNA作為待測(cè)樣品和雄性DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行核酸微陣列，并 且不使用標(biāo)記的鑒定核酸時(shí)進(jìn)行比較的結(jié)果；圖3是當(dāng)使用雌性DNA作為待測(cè)樣品和雄性DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行核酸微陣列，并 且使用標(biāo)記的鑒定核酸校正標(biāo)記量值時(shí)進(jìn)行比較的結(jié)果；圖4顯示其中使用雌性DNA作為待測(cè)樣品和雄性DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，并使用標(biāo)記的 鑒定核酸進(jìn)行校正的情形和其中通過(guò)不使用標(biāo)記的鑒定核酸而不進(jìn)行校正的情形之間的 對(duì)數(shù)比差異；圖5顯示其中使用雌性DNA作為待測(cè)樣品和雄性DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，并使用標(biāo)記的 鑒定核酸進(jìn)行校正的情形和其中通過(guò)不使用標(biāo)記的鑒定核酸而不進(jìn)行校正的情形之間差 量；圖6是當(dāng)未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy 5_雌性和未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy 5-雄性用作樣品并且利用Cy 3-雌性作為標(biāo)記的鑒定核酸校正時(shí)的結(jié)果；圖7A和7B是其中在熒光值中形成偏差的情形的實(shí)例。圖7A是在Cy 3_雌性和 Cy 5-Cot-l的核酸微陣列測(cè)試之后繪制的圖像，和圖7B是在Cy 3-雄性和Cy 5-Cot-l的 核酸微陣列測(cè)試之后繪制的圖像；圖8是這樣的結(jié)果，其中以染色體順序?qū)脠D7A和7B中的樣品雌性和標(biāo)準(zhǔn)品雄性的熒光值計(jì)算的對(duì)數(shù)比進(jìn)行作圖；圖9是這樣的結(jié)果，其中對(duì)圖8的結(jié)果進(jìn)行校正；圖10是這樣的結(jié)果，其中雌性作為待測(cè)樣品和雄性作為標(biāo)準(zhǔn)品分別用作樣品；圖11是利用比圖10的情形更大量的Cot-I (8倍量)作為對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記的物質(zhì)獲 得的結(jié)果；圖12是這樣的結(jié)果，其中在陣列1之間進(jìn)行校正；圖13是這樣的結(jié)果，其中在陣列2之間進(jìn)行校正；圖14是這樣的結(jié)果，其中陣列形式不同并不進(jìn)行校正；圖15是這樣的結(jié)果，其中陣列形式不同并進(jìn)行校正；圖16是這樣情形的結(jié)果，其中標(biāo)記量值作為數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)提供；和圖17是這樣情形的結(jié)果，其中使用載體來(lái)源的核酸作為鑒定核酸。實(shí)施方案說(shuō)明本發(fā)明涉及利用核酸微陣列分析核酸的方法，其特征在于所述核酸微陣列具有樣點(diǎn)(X 1)，在所述樣點(diǎn)上(X 1)固定有包含與序列(a)互補(bǔ) 的驗(yàn)證序列(a’ )的第一探針核酸，且所述方法包括容許待測(cè)樣品的標(biāo)記的樣品核酸(A 1)與固定在樣點(diǎn)(X 1)上的至少所述第一探 針核酸雜交的步驟，對(duì)所述樣點(diǎn)(X 1)提供標(biāo)記的鑒定核酸(B)，并由此容許其與標(biāo)記的鑒定核酸(B) 雜交的步驟，所述鑒定核酸(B)具有能夠在全部樣點(diǎn)處與第一探針核酸的至少一部分雜交 并用與上述標(biāo)記的樣品核酸不同的標(biāo)記物標(biāo)記的序列，測(cè)量在樣點(diǎn)(X 1)上雜交的所述標(biāo)記的樣品核酸的標(biāo)記量值(F 1)的步驟，和測(cè)量在樣點(diǎn)(X 1)上雜交的所述標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值(Fe 1)的步驟。上述分析法優(yōu)選是利用核酸微陣列檢驗(yàn)待測(cè)樣品(A)中具有序列(a)的核酸的核 酸分析法，其特征在于所述核酸微陣列具有樣點(diǎn)(X 1)，在所述樣點(diǎn)(X 1)上固定有包含至少一個(gè)或多 個(gè)與序列(a)互補(bǔ)的序列(a’ )的第一探針核酸，且所述方法包括容許通過(guò)標(biāo)記(A)和鑒定核酸(B)制備的樣品核酸(A 1)，在與用與(A)不同的標(biāo) 記物標(biāo)記的核酸(B 1)共存的條件下，與固定在樣點(diǎn)(X 1)上的所述第一探針核酸雜交的 步驟，所述鑒定核酸(B)具有能夠在全部樣點(diǎn)處與所述第一探針核酸的至少一部分雜交的 序列，進(jìn)一步容許通過(guò)用㈧的相同標(biāo)記物標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品(C)制備的核酸(C 1)與(B 1) 共存并與固定在具有與樣點(diǎn)(X 1)相同序列的樣點(diǎn)(X 1’)上的所述探針核酸雜交的步驟，測(cè)量在樣點(diǎn)(X 1)上雜交的所述標(biāo)記的樣品核酸的標(biāo)記量值(Fa 1)的步驟，測(cè)量在樣點(diǎn)(X 1)上雜交的所述標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值0 1)的步驟，測(cè)量在樣點(diǎn)(X 1’)上雜交的包含所述序列(c)的核酸的標(biāo)記量值(Fe 1)的步 驟，和測(cè)量在樣點(diǎn)(X 1’)上雜交的所述標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值( 1’)的步驟。當(dāng)比較待測(cè)序列(a)的量和(X 1’)處的標(biāo)記量值(Fe 1)以進(jìn)行僅通過(guò)任選樣點(diǎn)(X 1)上的標(biāo)記量值(Fa 1)測(cè)量時(shí)，標(biāo)記的鑒定核酸⑶的標(biāo)記量值0 1，F(xiàn)b 1’ )用于 校正的應(yīng)用使得可能檢測(cè)所述樣點(diǎn)處的誤差，諸如由在該樣點(diǎn)上固定的探針核酸量引起的誤差。當(dāng)使用標(biāo)記的鑒定核酸(B)的該標(biāo)記量值時(shí)，可以判斷所述樣點(diǎn)的異常，例如由 其與指定值(Fe 1)的比較判斷，樣點(diǎn)間誤差可以通過(guò)驗(yàn)證兩個(gè)或更多樣點(diǎn)之間標(biāo)記的鑒 定核酸(B)的標(biāo)記量值來(lái)檢測(cè)，且其也變?yōu)榭赡苄Ｕ撜`差。本發(fā)明可以使用這樣的核酸陣列，其中優(yōu)選地，將具有兩種或更多序列的探針核 酸點(diǎn)樣在一個(gè)位置上。根據(jù)本發(fā)明，樣品核酸(A)的量可以，進(jìn)一步優(yōu)選地通過(guò)以下步驟來(lái)確定當(dāng)雜交 溶液含有核酸時(shí)，對(duì)一個(gè)陣列使用含有待測(cè)樣品(A)和鑒定核酸(B)的溶液，所述鑒定核酸 (B)具有能夠在全部樣點(diǎn)處與探針核酸的至少一部分雜交的序列，隨后利用標(biāo)準(zhǔn)核酸(C) 和標(biāo)記的鑒定核酸(B)對(duì)另一個(gè)陣列進(jìn)行陣列測(cè)試，利用由此檢測(cè)的標(biāo)記的鑒定核酸(B) 的標(biāo)記量值校正㈧的標(biāo)記量值和(C)的標(biāo)記量值，并比較㈧的標(biāo)記量值和(C)的標(biāo)記量 值。就此而言，所述另一個(gè)陣列意指相同類型的陣列，即其上點(diǎn)樣有相同類型探針的陣列。在該情形中，作為進(jìn)行比較和校正的目標(biāo)的樣點(diǎn)不特別受限，但是理想的是它們 是相同類型的樣點(diǎn)(通過(guò)點(diǎn)樣相同探針制備的樣點(diǎn)，即具有與固定的探針核酸的目標(biāo)相同 的序列(a’ )的樣點(diǎn))。通過(guò)本發(fā)明，由探針核酸量差異和雜交差異引起的標(biāo)記量值的變化可以例如被校 正。就此而言，當(dāng)術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記量值”用于本發(fā)明中時(shí)，它包括獲自由標(biāo)記的核酸和探針核酸 雜交產(chǎn)生的復(fù)合物，諸如雙鏈核酸等的標(biāo)記化合物的標(biāo)記量。關(guān)于通過(guò)應(yīng)用含有標(biāo)記的樣品核酸(A)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)的雜交溶液容許標(biāo) 記的樣品核酸(A)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)進(jìn)行雜交來(lái)檢測(cè)標(biāo)記的樣品核酸(A)和標(biāo)記的鑒 定核酸(B)的標(biāo)記量的步驟，所述含有標(biāo)記的樣品核酸(A)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)的雜交 溶液通過(guò)將各自的核酸標(biāo)記到微陣列上的樣點(diǎn)而制備，更用于說(shuō)明地，理想的是該步驟包 括以下步驟(a)-(e)。(a)通過(guò)用標(biāo)記化合物標(biāo)記核酸獲得標(biāo)記的樣品核酸(A)的步驟。(b)通過(guò)用與步驟(a)不同的標(biāo)記化合物標(biāo)記鑒定核酸獲得標(biāo)記的鑒定核酸(B) 的步驟，所述鑒定核酸包含能夠在全部樣點(diǎn)處與探針核酸的至少一部分雜交的序列，(c)制備含有在步驟(a)中獲得的標(biāo)記的樣品核酸(A)和在步驟(b)中獲得的標(biāo) 記的鑒定核酸(B)的雜交溶液的步驟。(d)將步驟(C)中獲得的雜交溶液應(yīng)用于核酸微陣列并由此容許雜交溶液中的標(biāo) 記的樣品核酸(A)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)與探針核酸雜交的步驟。(e)讀取與探針核酸雜交的標(biāo)記的樣品核酸(A)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)的各自量 并由此獲得標(biāo)記量值的步驟。就此而言，在步驟(d)和步驟(e)之間，理想的是進(jìn)一步包括用清洗液清洗雜交的 陣列的步驟。而且，在步驟(c)中添加標(biāo)記的樣品核酸(A)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)中，這些可以 同時(shí)或單獨(dú)添加。另外，其還可以包括以下步驟。
(a”)獲得標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)核酸(C)的步驟。(c”)制備含有標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)核酸(C)和上述步驟(b)中獲得的標(biāo)記的鑒定核酸(B) 的雜交溶液的步驟。(d”)進(jìn)行與相同類型但不同于上述步驟(d)的陣列雜交的步驟。(e”)獲得上述(d”)中雜交的標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)核酸(C)和標(biāo)記的鑒定核酸⑶的各自 標(biāo)記量值，利用由此檢測(cè)的標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值校正((A)的標(biāo)記量值和)(C) 的標(biāo)記量值，和通過(guò)比較(A)的標(biāo)記量值和(C)的標(biāo)記量值確定(A)的量的步驟。雜交可以利用可商購(gòu)的進(jìn)行雜交的設(shè)備或可以僅進(jìn)行溫度控制的設(shè)備來(lái)進(jìn)行。理 想的是在30°C 50°C的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在35°C 45°C的范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行雜交。另外，理想的是將雜交時(shí)間設(shè)置為16 100小時(shí)，更優(yōu)選M 80小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu) 選40 72小時(shí)。在雜交后，任選進(jìn)行清洗等。關(guān)于清洗條件，清洗的影響隨頻率增加而變得很 高，且可能使用具有調(diào)整過(guò)的離子強(qiáng)度的清洗液，諸如2 χ SSC, 2 χ SSC/50%甲酰胺，2 χ SSC/0. 1% SDS, 1 χ SSC等，或通常用于進(jìn)行Southern印跡，northern印跡等雜交實(shí)驗(yàn)的 分散劑，表面活性劑等清洗液。關(guān)于溫度，優(yōu)選設(shè)置為15°C 70°C，更優(yōu)選25°C 50°C，且 需要將溶液體積調(diào)節(jié)到雜交條件的等價(jià)水平。優(yōu)選的是，校正通過(guò)在核酸微陣列之間或在雜交區(qū)域之間點(diǎn)樣相同探針核酸制備 的樣點(diǎn)中的標(biāo)記量值的方法，其包括以下步驟(1)或(1’ )和O)。(1)通過(guò)進(jìn)行以下步驟(al)-(fl)獲得核酸微陣列的步驟，在所述核酸微陣列中 標(biāo)記的樣品核酸(A)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)與樣點(diǎn)上的探針核酸雜交(al)通過(guò)用標(biāo)記化合物標(biāo)記樣品核酸獲得標(biāo)記的樣品核酸(A)的步驟。(bl)通過(guò)用與步驟(a)不同的標(biāo)記化合物標(biāo)記鑒定核酸獲得標(biāo)記的鑒定核酸(B) 的步驟，所述鑒定核酸包含能夠在全部樣點(diǎn)處與探針核酸的至少一部分雜交的序列(所述 鑒定核酸可以與樣品核酸互補(bǔ))，(cl)制備含有在步驟(al)中獲得的標(biāo)記的樣品核酸(A)和在步驟(bl)中獲得的 標(biāo)記的鑒定核酸(B)的雜交溶液的步驟。(dl)通過(guò)將步驟(Cl)中獲得的雜交溶液應(yīng)用于核酸微陣列上來(lái)進(jìn)行雜交的步
馬聚ο(el)用清洗液清洗在步驟(dl)中獲得的核酸微陣列的步驟。(fl)由通過(guò)步驟(el)獲得的核酸微陣列讀取與探針核酸雜交的標(biāo)記的樣品核(A)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)的各自量并由此獲得標(biāo)記量值的步驟。(1，)通過(guò)進(jìn)行以下步驟(al，)_(gl，)獲得核酸微陣列的步驟，其中標(biāo)記的樣品 核酸(A)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)與核酸微陣列上的探針核酸雜交。(al')通過(guò)用標(biāo)記化合物標(biāo)記核酸獲得標(biāo)記的樣品核酸(A)的步驟。(bl’ )通過(guò)用與步驟(a)不同的標(biāo)記化合物標(biāo)記鑒定核酸獲得標(biāo)記的鑒定核酸
(B)的步驟，所述鑒定核酸包含能夠在全部樣點(diǎn)處與探針核酸的至少一部分雜交的序列 (所述鑒定核酸可以與所述核酸互補(bǔ))，(cl’ )制備含有在步驟(bl’ )中獲得的標(biāo)記的鑒定核酸(B)的雜交溶液的步驟。(dl，)通過(guò)混合在步驟(al，)中獲得的標(biāo)記的樣品核酸(A)和在步驟(cl，)中獲得的標(biāo)記的鑒定核酸(B)來(lái)制備含有標(biāo)記的樣品核酸(A)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)的雜交 溶液的步驟。(el’ )通過(guò)將步驟(dl’ )中獲得的溶液應(yīng)用于核酸微陣列上來(lái)進(jìn)行雜交的步驟。(fl’ )用清洗液清洗通過(guò)步驟(el’ )獲得的核酸微陣列的步驟。(gl’)由通過(guò)步驟(fl’)獲得的核酸微陣列讀取與探針核酸雜交的標(biāo)記的樣品核 酸(A)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)的各自量并由此獲得標(biāo)記量值的步驟。(2)通過(guò)對(duì)由至少兩份待測(cè)樣品獲得的各個(gè)核酸進(jìn)行步驟⑴或(1’ )來(lái)計(jì)算待 測(cè)樣品之間基因表達(dá)量或待測(cè)樣品基因拷貝數(shù)，由此獲得與所用待測(cè)樣品種類數(shù)相對(duì)應(yīng)的 核酸微陣列，或與所用待測(cè)樣品種類數(shù)相對(duì)應(yīng)的雜交區(qū)域，并通過(guò)使用標(biāo)記的鑒定核酸(B) 的標(biāo)記量值校正源自所用待測(cè)樣品的標(biāo)記的樣品核酸(A)的標(biāo)記量值中的至少一種的步 馬聚ο在該情形中，理想的是至少一種待測(cè)樣品是上述具有已知量的標(biāo)準(zhǔn)品(C)。由此， 可以更精確地測(cè)量其他待測(cè)樣品。在本發(fā)明的標(biāo)記量值校正法中，通過(guò)容許標(biāo)記的樣品核酸(Al)和標(biāo)記的鑒定核 酸(B)與第一樣點(diǎn)同時(shí)雜交獲得各自的標(biāo)記量值，并且點(diǎn)樣與上述樣點(diǎn)相同的探針核酸， 但是更用于說(shuō)明地，通過(guò)容許與上述標(biāo)記的樣品核酸(Al)不同，但是以與上述標(biāo)記的樣品 核酸(Al)比較標(biāo)記量值為目的制備的標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)核酸(An ;11是2以上的整數(shù))，和標(biāo)記的 鑒定核酸(B)與和不同于上述樣點(diǎn)的第η樣點(diǎn)同時(shí)雜交獲得各自標(biāo)記量值，使用通過(guò)容許 與第一樣點(diǎn)和第η樣點(diǎn)雜交獲得的各個(gè)標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值的比作為所述樣點(diǎn) 之間的系數(shù)，并且與第η樣點(diǎn)雜交的標(biāo)記的樣品核酸(An)的校正的標(biāo)記量值通過(guò)使在所述 樣點(diǎn)處測(cè)量的標(biāo)記的樣品核酸(A’ )的標(biāo)記量值乘以所述系數(shù)獲得。能夠計(jì)算點(diǎn)樣相同探針核酸的兩個(gè)或更多樣點(diǎn)中的標(biāo)記的樣品核酸(A)的標(biāo)記 量值和標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值的至少之一的平均值或平均值偏差。用于說(shuō)明地，在固定有具有與同一核酸陣列或不同陣列上存在的樣點(diǎn)(Xl)相同 的相同序列(a’ )的探針核酸的η樣點(diǎn)(Xn)的情形中，理想的是包括通過(guò)在以上(1)-(6) 項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法獲得與η樣點(diǎn)雜交的所述標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值的步驟和 計(jì)算通過(guò)對(duì)η個(gè)所述標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值取平均值或?qū)ζ淦骄等∑瞰@得的 數(shù)值的步驟。更用于說(shuō)明地，當(dāng)由與源自第一待測(cè)樣品的標(biāo)記的樣品核酸(Al)和標(biāo)記的鑒定 核酸(B)雜交的第一樣點(diǎn)獲得的標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值被作為Fc 1，且源自第η 待測(cè)樣品和標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記的樣品核酸(An)的標(biāo)記量值作為Fc η時(shí)，理想的 是通過(guò)利用以下數(shù)值表達(dá)式(1)計(jì)算校正第η標(biāo)記的樣品核酸(An)后的校正的標(biāo)記量值 來(lái)進(jìn)行校正。式(1)；第η標(biāo)記的樣品核酸(An)的校正的標(biāo)記量值=Fc 1/Fc η χ第η標(biāo)記的 樣品核酸(An)的標(biāo)記量值(η是2以上的整數(shù))本發(fā)明的原理利用圖1描述。就此而言，由于該圖用于描述本發(fā)明的原理并且因 此非常簡(jiǎn)化，所以僅作為實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的要旨，其不包括本發(fā)明的全部上述范圍，因此本 發(fā)明不受該圖的局限。在圖1中，示意圖是為了簡(jiǎn)化的目的，通過(guò)在利用核酸微陣列分析兩種待測(cè)樣品之間拷貝數(shù)的情形中對(duì)兩個(gè)核酸微陣列進(jìn)行成像制成的，其中在一個(gè)陣列上點(diǎn)樣4種探針 樣品核酸(A-D或a-d)和相同的探針核酸1-4，總計(jì)16個(gè)樣點(diǎn)。將作為待測(cè)樣品的細(xì)胞1-來(lái)源的標(biāo)記的樣品核酸㈧、標(biāo)記的鑒定核酸⑶和雜 交溶液的混合物包被在核酸微陣列1上并容許進(jìn)行雜交。并且，將標(biāo)準(zhǔn)品-來(lái)源的標(biāo)記的 樣品核酸(A)、標(biāo)記的鑒定核酸(B)和雜交溶液的混合物包被在核酸微陣列2上并容許進(jìn)行 雜交。雜交和隨后的清洗和干燥步驟后，讀取核酸微陣列1和核酸微陣列2 二者的標(biāo)記量值。關(guān)于核酸微陣列1上樣點(diǎn)Al的標(biāo)記的樣品核酸(A)-來(lái)源的標(biāo)記量值作為F 1， 且關(guān)于相同樣點(diǎn)A 1的標(biāo)記的鑒定核酸(B)-來(lái)源的標(biāo)記量值作為1 1。并且，關(guān)于核酸 微陣列2上樣點(diǎn)al的標(biāo)記的樣品核酸(A)-來(lái)源的標(biāo)記量值作為F 2，且關(guān)于相同樣點(diǎn)al 的標(biāo)記的鑒定核酸(B)-來(lái)源的標(biāo)記量值作為1 2。校正核酸微陣列2上的標(biāo)記的樣品核 酸(A)-來(lái)源的標(biāo)記量值后的校正的標(biāo)記量值F 2’可以，例如，通過(guò)下式來(lái)計(jì)算。在該情形 中，可以從所述標(biāo)記量值中減去或不減去本底標(biāo)記量值。F 2，= Fb 1/Fb 2 χ F 2通過(guò)對(duì)全部樣點(diǎn)如此進(jìn)行來(lái)獲得結(jié)果。即，核酸微陣列2的全部樣點(diǎn)的校正通過(guò) 校正基本相同的驗(yàn)證核酸與之結(jié)合的樣點(diǎn)之間的組，諸如核酸微陣列1上的樣點(diǎn)Α2和核酸 微陣列2上的樣點(diǎn)a2的組，核酸微陣列1上的樣點(diǎn)Bl和核酸微陣列2上的樣點(diǎn)M的組， 等來(lái)進(jìn)行。接下來(lái)，核酸微陣列1和核酸微陣列2之間的比值通過(guò)下式來(lái)計(jì)算。比值=F2，/F 1當(dāng)對(duì)所有樣點(diǎn)組進(jìn)行該計(jì)算時(shí)，獲得拷貝數(shù)成為可能。就此而言，在進(jìn)行校正中，還理想的是通過(guò)以下步驟獲得校正的標(biāo)記的樣品核酸 (A)的標(biāo)記量值使用任選樣點(diǎn)的標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值與在兩個(gè)或更多同種樣 點(diǎn)上測(cè)量的標(biāo)記的鑒定核酸(B)的平均標(biāo)記量值的比，作為所述樣點(diǎn)上的系數(shù)，并用在所 述樣點(diǎn)處測(cè)量的標(biāo)記的樣品核酸(A)的標(biāo)記量值除以所述系數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，待校正的樣點(diǎn)可以針對(duì)任何樣點(diǎn)進(jìn)行校正，條件是它們是基本相同 的驗(yàn)證核酸結(jié)合的樣點(diǎn)。例如，可以舉例在核酸微陣列之間位置對(duì)稱的樣點(diǎn)，即圖1的樣點(diǎn) Al和al，樣點(diǎn)Bl和bl等之間的校正。并且，位置對(duì)稱的樣點(diǎn)的校正也可以在這樣的條件 下進(jìn)行，即基本相同的探針核酸固定于其上。另外，根據(jù)本發(fā)明，不同核酸微陣列之間的校正可以在這樣的條件下進(jìn)行，即探針 核酸幾乎相同。不同的核酸微陣列意指為不同目的生產(chǎn)的核酸微陣列或在具有不同排列、 形狀或密集度的樣點(diǎn)中點(diǎn)樣的核酸微陣列。S卩，即使當(dāng)兩個(gè)或更多核酸微陣列中的探針核酸排列或探針核酸點(diǎn)樣量在各核酸 微陣列中不同時(shí)，評(píng)估可以通過(guò)本發(fā)明的方法對(duì)其進(jìn)行校正來(lái)進(jìn)行。標(biāo)記量值可以是進(jìn)行數(shù)學(xué)處理后的數(shù)值。例如，校正可以在進(jìn)行對(duì)由通過(guò)點(diǎn)樣基 本相同的探針核酸制備的樣點(diǎn)獲得的標(biāo)記量值取平均值的步驟后進(jìn)行。另外，理想的是使 用熒光值作為標(biāo)記量值。作為標(biāo)記量值，還可以使用由通過(guò)點(diǎn)樣基本相同的探針核酸制備的樣點(diǎn)計(jì)算的平 均值。即，在校正前可以對(duì)標(biāo)記量值進(jìn)行取平均值處理。通過(guò)使用平均值，數(shù)據(jù)接近真實(shí) 數(shù)據(jù)。另外，校正后的標(biāo)記量值的平均值可以通過(guò)由點(diǎn)樣基本相同的探針核酸制備的樣點(diǎn)獲得的標(biāo)記量值來(lái)計(jì)算。取平均值也可以針對(duì)通過(guò)在校正后處理標(biāo)記量值獲得的數(shù)學(xué)值來(lái) 計(jì)算。當(dāng)以該方式處理時(shí)，例如，當(dāng)基于通過(guò)校正核酸微陣列獲得的比值計(jì)算通過(guò)點(diǎn)樣基本 相同的探針核酸制備的樣點(diǎn)之間的平均值時(shí)，數(shù)據(jù)接近真實(shí)值，因此可以更準(zhǔn)確地計(jì)算拷 貝數(shù)，由此致使可能抑制所謂的假陽(yáng)性的產(chǎn)生并致使可能急劇提高診斷和預(yù)防疾病的精確 性。另外，還可以使用通過(guò)除去基本相同種類的探針核酸組中的最大值和最小值獲得 的平均值，并且還可以使用其中從探針核酸組的平均標(biāo)記量中除去某一閾值的樣點(diǎn)標(biāo)記量。標(biāo)記量值的校正可以與多種對(duì)照樣點(diǎn)一起進(jìn)行。例如，存在這樣的方法，其中將在 細(xì)胞之間具有相對(duì)恒定表達(dá)量的持家基因預(yù)先點(diǎn)樣在核酸微陣列上，全部樣品基于其雜交 量來(lái)校正，并然后利用本發(fā)明的鑒定核酸進(jìn)行各樣點(diǎn)的校正。另外，通過(guò)在擴(kuò)增或標(biāo)記時(shí)預(yù) 先添加內(nèi)標(biāo)核酸，各樣點(diǎn)通過(guò)本發(fā)明鑒定核酸的校正可以在使用所述內(nèi)標(biāo)核酸校正擴(kuò)增或 標(biāo)記后進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，三個(gè)或更多核酸微陣列之間的校正也是可能的。例如，可以舉例其 中制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的情形。更用于說(shuō)明地，通過(guò)以下步驟計(jì)算量獲 得關(guān)于作為標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)記的樣品核酸的標(biāo)記量值和標(biāo)記的鑒定核酸的標(biāo)記量值的數(shù)據(jù)和 關(guān)于兩種或更多各待測(cè)樣品的標(biāo)記量值和鑒定核酸的標(biāo)記量值的數(shù)據(jù)，利用本發(fā)明的方法 校正各待測(cè)樣品的標(biāo)記量值和標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)記量值，和然后比較標(biāo)準(zhǔn)品和各待測(cè)樣品的標(biāo)記 量值。通過(guò)執(zhí)行這樣的方法，當(dāng)預(yù)先制備僅一種標(biāo)準(zhǔn)品輔助的核酸微陣列的結(jié)果時(shí)，可以執(zhí) 行許多種使用待測(cè)樣品作為靶標(biāo)的核酸微陣列，并且不需要準(zhǔn)備在等價(jià)數(shù)量種類的待測(cè)樣 品中標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品的步驟，因此可以以此程度減少步驟數(shù)并且還可以縮短測(cè)試時(shí)期和診斷時(shí) 期。此外，必需的試劑量也急劇減少，并且由此伴隨著成本可以急劇降低。另外，可以通過(guò) 使用兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)品使結(jié)果更加清楚?！春怂嵛㈥嚵小当疚闹惺褂玫暮怂嵛㈥嚵惺沁@樣的核酸微陣列，其中探針核酸結(jié)合、固定在固體 材料的表面上(所述表面用于本文中時(shí)也稱為三維表面且纖維表面等也包括在其中，即在 大形狀的情形中，當(dāng)其基本上是表面時(shí)，即使當(dāng)其似乎內(nèi)藏時(shí)，本文中將其稱為表面)。對(duì) 所述固體材料沒(méi)有特別地限制，只要它是探針核酸可以結(jié)合的材料即可，如通常所用的載 玻片等玻璃材料，以及塑性材料，碳化纖維，凝膠或溶膠，膜，金屬等。對(duì)所述固體材料的形 狀，諸如平面狀、突起物的尖端、顆粒狀、毛細(xì)管的內(nèi)部等也沒(méi)有特別地限制。利用點(diǎn)樣儀 (spotter)生產(chǎn)的DNA微陣列和通過(guò)半導(dǎo)體技術(shù)生產(chǎn)的DNA芯片也包括在本發(fā)明的核酸微 陣列中。根據(jù)本發(fā)明，BAC-DNA陣列、寡核苷酸微陣列、c_DNA微陣列等可以用作核酸微陣 列。另外，微陣列樣點(diǎn)的排列可以改變，并且存在具有兩個(gè)或更多陣列區(qū)并可以測(cè)量一個(gè)基 盤上的兩個(gè)或更多待測(cè)樣品的多樣品陣列，通過(guò)組合兩個(gè)或更多陣列在一個(gè)基盤上復(fù)制大 量樣點(diǎn)的tiling陣列，等。存在不同形狀的微陣列，且可以舉例其中反應(yīng)效率通過(guò)形成三維結(jié)構(gòu)提高的那 些，其中核酸以顆粒狀形狀結(jié)合的那些，其中核酸結(jié)合在磁帶等上的那些，以及其中核酸結(jié) 合在⑶等圓盤形狀中的那些。
對(duì)BAC-DNA陣列沒(méi)有特別的限制，且可以是任何陣列，條件是它在將哺乳動(dòng)物等 的插入物引入至BAC中的狀態(tài)下基于DNA制成的，包括對(duì)其應(yīng)用自身的那些和其中利用PCR 等擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增的那些?！刺结樅怂帷堤结樅怂崾前A(yù)先已知其內(nèi)含物的序列的核酸，且在微陣列的情形中，一般兩 種或更多探針核酸以樣點(diǎn)的形式固定。作為探針核酸，可以化學(xué)合成的核酸、cDNA、BAC (細(xì)菌人工染色體)、YAC (酵母人 工染色體)等，和其中利用遺傳工程技術(shù)擴(kuò)增這些物質(zhì)的那些。而且，通過(guò)化學(xué)修飾DNA、 RNA等天然類型的核酸制備的核酸可以用作探針核酸。例如，可以使用PNA(肽核酸)， BNA (橋連核酸)，甲基膦酸酯型DNA，硫代磷酸酯型DNA，亞磷酰胺(phosphoramidite)型 DNA，硼基磷酸酯(boranophosphate)型DNA等。另外，還可以使用嵌合型核酸。例如，可以 使用在核酸中混合DNA結(jié)構(gòu)部分和RNA結(jié)構(gòu)部分的那些和其中混合天然型核酸和修飾型核 酸的那些等。關(guān)于將探針核酸結(jié)合到固體基板上的方法，可以使用下列方法其中使用結(jié)合了 以GeneChip為代表的光解吸基團(tuán)的amidite單體并使用掩蔽劑來(lái)逐一化學(xué)合成核苷酸的 方法，其中通過(guò)用噴墨法將amidite單體點(diǎn)樣到固體基板上來(lái)化學(xué)合成需要的序列的方 法，其中通過(guò)改變電極上溶液的PH并利用pH的改變釋放保護(hù)基從而在基板上合成核酸 的方法，其中將預(yù)先化學(xué)合成的核酸純化并將其點(diǎn)樣到基板上的方法，其中使用點(diǎn)樣儀將 cDNA進(jìn)行點(diǎn)樣的方法等。關(guān)于點(diǎn)樣方法，可以使用噴墨法、針陣列法等。理想的是探針核酸的尺寸為IOb 101Λ，優(yōu)選50b 51Λ，更優(yōu)選100b 21Λ。樣點(diǎn)一般地，核酸微陣列具有兩個(gè)或更多區(qū)域(樣點(diǎn))，其中大量并高密度地固定具有 基本相同序列的探針核酸，并且本發(fā)明中可以使用的探針核酸的基本同種和等量的樣點(diǎn)數(shù) 可以是一個(gè)或更多，其與樣點(diǎn)數(shù)無(wú)關(guān)。其可以響應(yīng)于分析目的而任意選擇。探針核酸的固定量?jī)?yōu)選0. 8 5 μ g/樣點(diǎn)，更優(yōu)選1. 0 2. 0 μ g/樣點(diǎn)。樣點(diǎn)形狀不受限，但是優(yōu)選使用圓形。樣點(diǎn)的直徑不受限，但是優(yōu)選10 μ m 1000 μ m?！创郎y(cè)樣品〉根據(jù)本發(fā)明的待測(cè)樣品是認(rèn)為待用核酸微陣列分析的核酸(樣品核酸)、含有核 酸的細(xì)胞等，其意指全部被認(rèn)為待用核酸微陣列分析且不受特別限制的那些。例如，其是分析對(duì)象，即包括用于測(cè)量核酸表達(dá)量和存在量、基因組中拷貝數(shù)等的 核酸，用于評(píng)估診斷等的細(xì)胞，但其還包括器官、個(gè)體等，因此其不局限于細(xì)胞本身。作為可以被認(rèn)作為待測(cè)樣品的其他物質(zhì)，用于利用其中預(yù)先已知或未知合成核酸 等的存在量的物質(zhì)來(lái)測(cè)試陣列和測(cè)量?jī)x器等能力的那些也可以被認(rèn)作為待測(cè)樣品，且當(dāng)將 隨后描述的鑒定核酸認(rèn)作為測(cè)量對(duì)象時(shí)，也可能將其認(rèn)作為待測(cè)樣品。作為待測(cè)樣品，可以舉例可以由具有某種疾病的患者或動(dòng)物獲得的核酸，可以由 其獲得核酸的細(xì)胞，等，并且包括所有包括細(xì)胞的那些。在狹義上，其意指核酸。例如，作為 疾病，認(rèn)為具有可能具有某些核酸信息的所有疾病，諸如癌癥、遺傳性疾病、炎癥等歸于此 情形，而無(wú)其他特殊限制。
另外，還可以使用被施用LCM(激光捕獲顯微解剖)處理的待測(cè)癌癥樣品。標(biāo)準(zhǔn)品意指所有這樣的情形，其包括預(yù)先具有某種程度用于與待測(cè)樣品比較的信 息的上述核酸，可以由其獲得核酸和其詳細(xì)信息的細(xì)胞。即使在與一般存在量不同時(shí)，仍可 能將其視為標(biāo)準(zhǔn)品，條件是信息可以通過(guò)與待測(cè)樣品比較獲得。例如，假設(shè)在具有CNV或某 種嵌合體的患者中形成癌癥，且當(dāng)獲自癌癥細(xì)胞的核酸與獲自除癌癥細(xì)胞外的正常細(xì)胞的 細(xì)胞比較時(shí)，認(rèn)為所述CNV和某種嵌合體彼此抵消，因此不妨礙使用其作為標(biāo)準(zhǔn)品。另外，即使在由具有完全不同來(lái)源的細(xì)胞等制備核酸的情形中，可能將其視為標(biāo) 準(zhǔn)品，條件是它可以用作比較對(duì)象。根據(jù)本發(fā)明，可以使用由待測(cè)樣品中作為樣品核酸提取的樣品核酸和標(biāo)準(zhǔn)品二 者，但是如前所述，理想的是使由待測(cè)樣品提取的樣品核酸和標(biāo)準(zhǔn)品與分別的陣列雜交。根據(jù)本發(fā)明，理想的是使用癌癥細(xì)胞-來(lái)源的核酸或源自正常細(xì)胞(不引起癌癥 的細(xì)胞)的核酸作為樣品核酸。核酸的純化根據(jù)本發(fā)明，理想的是在由待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品制備核酸中進(jìn)行純化。在進(jìn)行標(biāo)記 中，產(chǎn)生多種副反應(yīng)并且細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的蛋白、脂質(zhì)、糖類等對(duì)標(biāo)記反應(yīng)施加影響并對(duì)本 底噪聲施加嚴(yán)重影響，因此當(dāng)不進(jìn)行純化時(shí)，核酸微陣列的測(cè)量能力極大地降低。作為純化步驟，可以使用利用攜帶二氧化硅、纖維素衍生物等核酸吸附膜的柱體 的方法、乙醇沉淀或異丙醇沉淀、苯酚-氯仿提取等。也有效使用的是通過(guò)固相提取柱體 的方法，所述固相提取柱體利用離子交換樹(shù)脂，連接有十八基基團(tuán)等疏水性取代基的二 氧化硅載體，具有大小排阻作用的樹(shù)脂等，和通過(guò)層析法等的方法。其中，理想的是通過(guò) QuickGene系列(mfd.來(lái)自富士膠片公司(Fuji Photo Film))的純化，其中柱體中保持有 通過(guò)皂化三乙酸纖維素制備的核酸吸附多孔膜。這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)使用QuickGene系列，可以 利用低價(jià)機(jī)器半自動(dòng)地制備核酸。另外，這與二氧化硅系統(tǒng)核酸吸附多孔膜相比非常薄，并 適合于以小量進(jìn)行核酸提取，因此在與其他方法比較中，可以獲得具有明顯高濃度的核酸。 而且，這是適合于獲得處于小量并具有高濃度標(biāo)記的核酸的方法，因?yàn)樵谂c可以以小液體 體積進(jìn)行純化的乙醇沉淀法和異丙醇沉淀法的比較中，可以獲得具有更高純度的核酸。另 外，因?yàn)楫?dāng)使用苯酚-氯仿提取法或其他多種沉淀法時(shí)對(duì)后繼步驟具有不良影響，所以當(dāng) 由待測(cè)樣品制備核酸時(shí)，也可以進(jìn)行兩個(gè)或更多純化步驟，以提高純度。當(dāng)由待測(cè)樣品的純化通過(guò)柱方法進(jìn)行時(shí)，其中將含有二氧化硅作為主要成分的核 酸吸附膜固定于柱體并且其回收的液體體積通常很大，并且獲得的核酸的濃度變得非常 稀。為了解決該問(wèn)題，可能通過(guò)乙醇沉淀等除去所有的溶液或利用超濾柱等對(duì)其進(jìn)行濃縮。根據(jù)本發(fā)明，更理想的是不對(duì)由待測(cè)樣品提取的核酸鏈長(zhǎng)進(jìn)行斷裂，這來(lái)自于步 驟簡(jiǎn)單且處理時(shí)期短的視角，但是對(duì)由待測(cè)樣品提取的核酸鏈長(zhǎng)進(jìn)行斷裂，即其縮短，可以 通過(guò)進(jìn)行酶處理、超聲波處理、機(jī)械斷裂處理、化學(xué)處理等來(lái)進(jìn)行。另外，在進(jìn)行這些處理后 可以進(jìn)行純化步驟或省略純化步驟。另外，當(dāng)進(jìn)行純化步驟時(shí)，根據(jù)本發(fā)明，核酸的純度通過(guò)使用限制酶等核酸酶對(duì)其 進(jìn)行斷裂和純化由此獲得的核酸而提高，而且，具有更高純度和更高濃度的核酸可以通過(guò) 在純化時(shí)引入濃縮步驟，例如通過(guò)使用比核酸溶液體積小的回收液體體積來(lái)對(duì)其進(jìn)行提取 來(lái)獲得，由此使其適合使用，因?yàn)楂@得靶核酸的效率變得良好。
作為用于酶處理的酶，理想的是使用限制酶或核酸酶。還可能使用兩種或更多種 限制酶。根據(jù)本發(fā)明的機(jī)械斷裂處理意指進(jìn)行容器朝向某一方向的相對(duì)運(yùn)動(dòng)(然而，包括 8字形等運(yùn)動(dòng))。當(dāng)在進(jìn)行該處理中加入球諸如玻璃、不銹鋼、氧化鋯等時(shí)，處理進(jìn)一步進(jìn)展 并進(jìn)一步消化核酸，因此這些可以是適合使用的。另外，可以進(jìn)行通過(guò)超聲波處理的切斷?？鄢ū景l(fā)明的方法還可以通過(guò)扣除法(subtraction method)增加核酸微陣列測(cè)量的 準(zhǔn)確性。所述扣除法是當(dāng)目的基因的拷貝數(shù)或表達(dá)數(shù)中存在差異時(shí)，通過(guò)進(jìn)行扣除的技巧 減去基因中存在的差異而有效分離基因的方法。例如，可以使用PCR選擇法、RDA(代表性差 別分析)法，DsDD(雙鏈體特異性直接消化(Duplex-specific Direct Digestion))法等。具體地，在癌細(xì)胞的情形中，大量正常細(xì)胞與癌細(xì)胞一起包含在癌組織中，結(jié)果， 核酸微陣列的性能在癌細(xì)胞的情形中顯著降低，但是所述性能降低可以通過(guò)扣除法防止到 某種程度?！礃?biāo)記〉標(biāo)記是容許可檢測(cè)的物質(zhì)結(jié)合核酸的行為，并且只要它是可檢測(cè)的，任何物質(zhì)可 以被結(jié)合到本發(fā)明中。例如，可以包括熒光物質(zhì)、無(wú)機(jī)化合物、酶、放射性同位素、色素等，且 標(biāo)記通過(guò)熒光進(jìn)行是理想的。還可能對(duì)一份待測(cè)樣品標(biāo)記兩種或更多物質(zhì)。熒光物質(zhì)作為熒光物質(zhì)，盡管沒(méi)有對(duì)其應(yīng)用特別限定，可以使用異硫氰酸熒光素(FITC)、 Cy-染料、ALEXA、綠色熒光蛋白(GFP)、藍(lán)色熒光蛋白(BFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、紅色熒 光蛋白(RFP)、吖啶、DAPI、溴化乙錠、SYBR Green、德克薩斯紅、稀少金屬熒光標(biāo)記試劑、 TAMRA、ROX等物質(zhì)，條件是它們是可商購(gòu)的或可以制備的，且優(yōu)選，熒光標(biāo)記可以通過(guò)cy-3 或cy-5進(jìn)行。作為無(wú)機(jī)化合物，盡管沒(méi)有對(duì)其待用原材料特別限定，可以提及例如由半導(dǎo)體無(wú) 機(jī)材料制成的量子點(diǎn)。作為其實(shí)例，可以提及二氧化硅，CdTe，a^e或Cdk的納米顆粒。該 顆?？梢酝ㄟ^(guò)改變其顆粒直徑而改變其產(chǎn)生的熒光波長(zhǎng)，且其在直徑2nm時(shí)變?yōu)樗{(lán)色，在 直徑3nm時(shí)變?yōu)榫G色，在直徑4nm時(shí)變?yōu)辄S色和在直徑5nm時(shí)變?yōu)榧t色。因此，可以檢測(cè)其 熒光，或可以直接檢測(cè)其顆粒的存在。例如，作為用于直接檢測(cè)顆粒存在的手段，可以使用 AFM(原子力顯微鏡)或電子顯微鏡。此外，還可以使用地高辛(digoxigenin) (DIG)、生物素等質(zhì)。作為使用生物素的實(shí) 例，其可以用于檢測(cè)紫色顯影，這可以在容許抗生物素蛋白結(jié)合于連接探針的生物素，將生 物素連接的堿性磷酸酶與其連接并接著將氮藍(lán)四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸加入其中 作為堿性磷酸酶的底物時(shí)觀察到。此外，可以對(duì)其進(jìn)行非酶標(biāo)記。例如，可以使用ULS陣列CGH標(biāo)記試劑盒(ULS arrayCGH Labeling Kit)(由 Kreatech Biotechnology BV 制造)等。直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法作為標(biāo)記方法，在本發(fā)明中可以使用直接標(biāo)記法或間接標(biāo)記法。所述直接標(biāo)記法 是這樣的方法，其中當(dāng)例如使用Cy-染料時(shí)，將核酸轉(zhuǎn)化為單鏈并容許短鏈核酸與其雜交， 并且將與Cy-染料結(jié)合的核苷酸衍生物與核苷酸一起與之混合，以上步驟均預(yù)先進(jìn)行，然后在一個(gè)步驟中合成標(biāo)記的核酸。盡管存在問(wèn)題，因?yàn)楫?dāng)酶吸收非天然型核苷酸衍生物時(shí) 的吸收效率比吸收天然型核苷酸的效率低，但是所述步驟是方便的且可以合適地用于本發(fā) 明中。間接標(biāo)記法是這樣的方法，其中當(dāng)例如使用Cy-染料時(shí)，將核酸轉(zhuǎn)化為單鏈，并容許 短鏈核酸與其雜交，并且將具有可結(jié)合Cy-染料的取代基的核苷酸衍生物如具有氨基烯丙 基的核苷酸衍生物與天然型核苷酸一起與之混合，以上步驟均預(yù)先進(jìn)行，并且首先通過(guò)合 成具有這種取代基的核酸獲得標(biāo)記的核酸，并然后容許Cy-染料通過(guò)氨基烯丙基與之連 接。盡管該方法的過(guò)程很復(fù)雜，但是氨基烯丙基結(jié)合的核苷酸衍生物的三維結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)上 比在直接標(biāo)記法中使用的Cy-染料結(jié)合的核苷酸衍生物更接近天然型核苷酸，且其吸收標(biāo) 記化合物的效率很高，因此這也可以合適地用于本發(fā)明中。根據(jù)本發(fā)明，可以將隨機(jī)引物法(引物延伸法)、切口平移法、PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng))法、末端標(biāo)記法等用作將標(biāo)記化合物引入核酸的方法。隨機(jī)引物法可以特別適合地用 于本發(fā)明中。隨機(jī)引物法是這樣的方法，其中容許從幾bp (堿基對(duì))至十幾bp的隨機(jī)引物核酸 與核酸雜交并且通過(guò)同時(shí)利用聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記來(lái)合成標(biāo)記的核酸。切口平移法是這 樣的方法，其中通過(guò)容許DNA聚合酶在雙鏈核酸被例如，DNA酶I切口時(shí)起作用來(lái)降解DNA， 并同時(shí)通過(guò)DNA聚合酶活性合成標(biāo)記的核酸。PCR法是這樣的方法，其中通過(guò)制備兩種引物 和通過(guò)同時(shí)利用該引物經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記來(lái)獲得標(biāo)記的核酸。末端標(biāo)記法在標(biāo) 記5’末端的情形中是這樣的方法，其中將標(biāo)記化合物引入至被堿性磷酸酶脫磷酸化的核酸 的5’末端，這通過(guò)T4多核苷酸激酶的磷酸化反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。用于標(biāo)記3’末端的方法是這樣 的方法，其中通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶將標(biāo)記化合物加入至核酸的3’末端中。染料交換法染料交換法也可以用于本發(fā)明中。例如，在如本文中所述的染料交換法中，容許用 Cy3標(biāo)記源自標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞的核酸并用Cy5標(biāo)記鑒定核酸的樣品在第一核酸微陣列上雜交，并 且容許用Cy3標(biāo)記源自樣品細(xì)胞的核酸并用Cy5標(biāo)記鑒定核酸的樣品在第二核酸微陣列上 雜交。由獲自第一和第二核酸微陣列的熒光值計(jì)算比例。接下來(lái)，容許用Cy5標(biāo)記源自標(biāo) 準(zhǔn)細(xì)胞的核酸并用Cy3標(biāo)記鑒定核酸的樣品在第三核酸微陣列上雜交，并且容許用Cy5標(biāo) 記源自樣品細(xì)胞的核酸并用Cy3標(biāo)記鑒定核酸的樣品在第四核酸微陣列上雜交。由獲自第 三和第四核酸微陣列的熒光值計(jì)算比例。這是這樣的方法，其中通過(guò)該方法校正由于標(biāo)記 化合物引起的酶引入效率差異。酶活性的鈍化根據(jù)本發(fā)明，作為標(biāo)記的樣品核酸和標(biāo)記的鑒定核酸，也可能使用包含它們的未 純化溶液。當(dāng)使用這樣的未純化溶液時(shí)，酶等剩余在這些溶液中，因此理想的是在其制備 后，鈍化溶液中剩余的酶的活性。這是因?yàn)?，例如，在?biāo)記源自具有Cy3的待測(cè)樣品的標(biāo)記 的樣品核酸和具有Cy5的標(biāo)記的鑒定核酸的情形中，存在混合包含它們的未純化溶液步 驟，且當(dāng)混合時(shí)該溶液中存在剩余的酶時(shí)，存在這樣的可能性，即通過(guò)剩余的酶，標(biāo)記的樣 品核酸進(jìn)一步被Cy5標(biāo)記，且標(biāo)記的鑒定核酸進(jìn)一步被Cy3標(biāo)記，由此引起其對(duì)數(shù)據(jù)再現(xiàn)性 施加影響的可能性。根據(jù)本發(fā)明，任何可以鈍化酶的方法可以用作酶鈍化法，但是理想的是進(jìn)行添加 螯合劑和在60°C以上熱處理的方法之一或二者。加熱溫度優(yōu)選為60°C以上，更優(yōu)選63°C以上。加熱時(shí)期可以是1分鐘以上，但最理想地，理想的是在65°C以上進(jìn)行加熱處理5分鐘以上。另外，在使用Klenow片段的標(biāo)記法的情形中，可能利用渦流攪拌器等鈍化酶的活性。標(biāo)記的核酸標(biāo)記的核酸意指結(jié)合標(biāo)記化合物的核酸，且其可以是純化的或未純化的。
包含標(biāo)記的核酸的純化溶液包含標(biāo)記的核酸的純化溶液意指通過(guò)對(duì)包含標(biāo)記的核酸的溶液應(yīng)用純化步驟獲 得的核酸溶液。在該情形中，純化步驟是在進(jìn)行標(biāo)記處理后去除未反應(yīng)的標(biāo)記化合物、酶等 的步驟，但是由于其還包括去除對(duì)雜交無(wú)貢獻(xiàn)的核酸和對(duì)隨后的雜交施加影響的生物物質(zhì) 和化學(xué)物質(zhì)的手段，因此在該步驟之前或之后的任何去除某些物質(zhì)的情形被認(rèn)為是純化步
馬聚ο包含標(biāo)記的核酸的未純化溶液包含標(biāo)記的核酸的未純化溶液意指通過(guò)在對(duì)由待測(cè)樣品提取的核酸溶液進(jìn)行標(biāo) 記步驟后不進(jìn)行純化步驟獲得的核酸溶液。在該情形中，純化步驟是在進(jìn)行標(biāo)記處理后去 除未反應(yīng)的標(biāo)記化合物、酶等的步驟，但是用于制備核酸溶液的純化步驟不包括在其中。由 于不進(jìn)行純化，所以該溶液為與通過(guò)標(biāo)記步驟添加的多種未反應(yīng)的化合物，諸如引物、酶、 核苷酸、緩沖液中包含的離子等共存的核酸溶液。另外，在進(jìn)行加熱后，以鈍化共存的酶為 目的，對(duì)包含標(biāo)記的核酸的未純化溶液進(jìn)行添加螯合劑等的處理的核酸溶液也在本發(fā)明中 稱為包含標(biāo)記的核酸的未純化溶液?！磋b定核酸〉鑒定核酸是這樣的核酸，其在全部目標(biāo)樣點(diǎn)上，具有能夠雜交探針核酸的至少一 部分的序列，可以檢測(cè)目標(biāo)樣點(diǎn)中雜交能力異常，舉例說(shuō)明地，由固定在所述樣點(diǎn)上的探針 核酸的量引起的異常，并進(jìn)一步用于校正異常樣點(diǎn)之間的探針核酸點(diǎn)樣量。因此，鑒定核酸 可以是任何這樣的核酸，其可以與固定于核酸微陣列上的全部樣點(diǎn)的探針核酸雜交，且可 以具有任何序列或鏈長(zhǎng)。在該情形中，所有樣點(diǎn)代表具有與同一溶液中的待測(cè)樣品反應(yīng)和 標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)的可能性的所有樣點(diǎn)且通常是單核酸微陣列上的所有樣點(diǎn)。另外，其可以是任何核酸，條件是它可以進(jìn)行雜交，且可以使用DNA、RNA等野生型 核酸或通過(guò)化學(xué)修飾DNA、RNA等野生型核酸制備的核酸。例如，可以使用PNA(肽核酸)、 BNA (橋連核酸)、甲基膦酸酯型DNA、硫代磷酸酯型DNA、亞磷酰胺型DNA、硼基磷酸酯型DNA 等。另外，還可以使用嵌合型核酸。例如，可以使用在核酸中混合DNA結(jié)構(gòu)部分和RNA結(jié)構(gòu) 部分的那些和其中混合天然型核酸和修飾型核酸的那些。作為標(biāo)記的鑒定核酸(B)，可以使用例如，被認(rèn)為在制造陣列時(shí)在所有樣點(diǎn)中存在 的核酸序列，諸如重復(fù)序列、載體、大腸桿菌(Escherichia coli)基因組等，且理想的是使 用與待測(cè)樣品不同且在第一和第η探針核酸上具有序列的核酸。作為載體，可以提及質(zhì)粒、BAC、YAC、PAC、粘粒、病毒等病毒載體，且可以使用在制 造陣列中使用的任何載體或具有與該載體相同序列的核酸。重復(fù)序列可以作為鑒定核酸是理想的序列提及。重復(fù)序列也稱為重復(fù)性序列 (repetitive sequence)，其是每一定數(shù)量堿基對(duì)重復(fù)出現(xiàn)的限制酶識(shí)別區(qū)等序列，其實(shí)例包括重復(fù)一定模式的短核苷酸序列許多次的序列，諸如多聚d(AT)，多聚d(GC)等，和其中 達(dá)到數(shù)千堿基對(duì)/單元的長(zhǎng)序列重復(fù)許多次的序列，且已知這在人等較高等生命的基因組 中高頻出現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，例如，可以合適地使用獲自hvitrogen的Cot-I DNA。例如，在使用哺乳動(dòng)物BAC-DNA的核酸微陣列的情形中理想的是使用Cot_l DNA。 Cot-I DNA是這樣的核酸，其通常用于在核酸微陣列測(cè)量時(shí)封閉獲自哺乳動(dòng)物的待測(cè)樣品 中的重復(fù)序列，并且在使用哺乳動(dòng)物BAC探針的核酸微陣列的情形中，通常證明，重復(fù)序列 包含在充分多BAC探針中。例如，在使用在探針中具有重復(fù)序列的BAC-DNA的核酸微陣列的情形中，通過(guò)添 加Cot-I DNA經(jīng)由非特異性雜交封閉靶核酸和探針核酸上存在的重復(fù)序列，防止靶核酸側(cè) 上存在的重復(fù)序列與探針核酸側(cè)上存在的探針核酸的非特異性雜交，因此可以選擇性檢測(cè) 源自特異性雜交的熒光值。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)通過(guò)標(biāo)記至少其一部分來(lái)利用Cot-I DNA(優(yōu) 選，與同種標(biāo)記的鑒定核酸相同(即具有相同的序列)的未標(biāo)記核酸，例如未標(biāo)記的Cot-I DNA 一起)，可能增加特異性雜交的檢測(cè)靈敏性和減小樣點(diǎn)間的差異。另外，具有與探針核酸中普遍存在的核酸序列結(jié)構(gòu)部分基本互補(bǔ)的核酸序列的合 成寡核苷酸可以用作鑒定核酸。根據(jù)本發(fā)明，理想的是使用基于核酸的摩爾比為1以上的量的鑒定核酸。這是因 為核酸微陣列的容量通過(guò)使用q以上的摩爾比而提高。鑒定核酸的尺寸優(yōu)選為20bp以上，更優(yōu)選20bp IMbp，進(jìn)一步優(yōu)選IOObp 500kb。理想地，鑒定核酸的使用量設(shè)定為基于待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品核酸的0. 5 2倍摩爾。標(biāo)記的鑒定核酸(B)標(biāo)記的鑒定核酸(B)意指這樣的鑒定核酸，其中標(biāo)記化合物與鑒定核酸相連，且 在純化或未純化時(shí)稱為本發(fā)明中的標(biāo)記的鑒定核酸。作為標(biāo)記的鑒定核酸，可以使用源自待測(cè)樣品的核酸，源自正常細(xì)胞的核酸或包 含重復(fù)序列的核酸，且使用Cot-I DNA是理想的。理想地，使用1摩爾以上的量的標(biāo)記的鑒定核酸，更理想地以基于樣品核酸(A)的 3摩爾以上，最理想8摩爾以上的量對(duì)其進(jìn)行使用。包含標(biāo)記的鑒定核酸的純化溶液包含標(biāo)記的鑒定核酸的純化溶液意指通過(guò)對(duì)包含標(biāo)記的鑒定核酸(B)的溶液應(yīng) 用純化步驟獲得的包含標(biāo)記的鑒定核酸的溶液。在該情形中，純化步驟是在進(jìn)行標(biāo)記處理 后去除未反應(yīng)的標(biāo)記化合物、酶等的步驟。包含標(biāo)記的鑒定核酸的未純化溶液包含標(biāo)記的鑒定核酸的未純化溶液意指通過(guò)不對(duì)包含標(biāo)記的鑒定核酸(B)的溶 液應(yīng)用純化步驟獲得的包含標(biāo)記的鑒定核酸的溶液。由于不進(jìn)行純化，所以該溶液為其中 通過(guò)標(biāo)記步驟添加的多種未反應(yīng)的化合物，諸如引物、酶、核苷酸、緩沖液中包含的離子等 共存的包含標(biāo)記的鑒定核酸的溶液。另外，在進(jìn)行加熱后，以鈍化剩余的酶為目的，對(duì)包含 標(biāo)記的鑒定核酸的未純化溶液進(jìn)行添加螯合劑等的處理的核酸溶液也在本發(fā)明中稱為包 含標(biāo)記的鑒定核酸的未純化溶液。〈封閉齊[J>
本文中所述的封閉劑用于減小雜交時(shí)的非特異性雜交的檢測(cè)，且可以在制備雜交 溶液時(shí)與標(biāo)記的樣品核酸(A)、標(biāo)記的鑒定核酸(B)等一起加入。例如，其意指tRNA(轉(zhuǎn)運(yùn) RNA)、變性的鮭精DNA、多聚腺苷酸、多聚dA、脫脂乳等物質(zhì)，所述物質(zhì)主要具有降低核酸微 陣列的本底噪聲的功能，并且還可以使用通常市場(chǎng)上出售的封閉劑。<雜交溶液組成>本發(fā)明可以使用如下物質(zhì)作為雜交溶液組成，例如，在使用BAC-DNA的核酸微陣 列的情形中，具有增加核酸濃度作用和即使當(dāng)通過(guò)增加的粘性而分割時(shí)保持一定程度面積 的功能的硫酸葡聚糖，具有降低核酸的解鏈溫度作用的甲酰胺和可以增加離子強(qiáng)度并具有 保持PH恒定水平功能的溶液可以作為實(shí)例提及。根據(jù)本發(fā)明，理想的是使用包含以下試劑的溶液。聚乙二醇(PEG，JP-A-2000-325099)、硫酸葡聚糖等可以用作具有排除體積效應(yīng) (excluded volume effect)的物質(zhì)。甲酰胺、甘油、甲醛、DMSO、DMF、GuSCN、碘等可以用作降低解鏈溫度的化合物。除SSC外，SSPE可以一般作為調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度的溶液提及。除了這些以外，可以使 用MES雜交緩沖液等。<雜交溶液>如本發(fā)明中所述的雜交溶液是其中混合上述試劑和封閉劑和其他試劑，標(biāo)記的樣 品核酸和標(biāo)記的鑒定核酸的溶液，是具有最優(yōu)化標(biāo)記的樣品核酸(A)和標(biāo)記的鑒定核酸 (B)與核酸微陣列上的探針核酸的雜交的性質(zhì)的溶液，是促進(jìn)探針核酸與標(biāo)記的樣品核酸 和標(biāo)記的鑒定核酸之間具有高度序列一致性的雜交并且在另一方面具有抑制具有低序列 一致性的雜交的作用的溶液。除這些以外，如JP-A-2005-087109中所述，還可以將磷脂，Denhardt溶液 (包含聚糖體、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白作為主要成分的溶液)，季銨鹽，甜菜 堿(Biochemistry (生物化學(xué)),32,137-144 (1993))，TMAC (四甲基氯化銨)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)),82,1585-1588 (1985))，市售的雜交溶液如 ExpressHyb (Clontech), PerfectHyb (Τ0Υ0Β0), ULTRAhyb (Amicon 等)等用在本發(fā)明中作為 雜交溶液組成之一。還可以將表面活性劑加入至雜交溶液中。作為表面活性劑，還可以使用陽(yáng)離子表 面活性劑、陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑。作為陰離子表面活性劑，理想地使用 十二烷基硫酸鈉。十二烷基硫酸鈉可以有效抑制本底。除此之外，使用N-月桂基肌氨酸、 十二烷基硫酸鋰等。作為非離子表面活性劑，已知吐溫(注冊(cè)商標(biāo))、Triton X(注冊(cè)商標(biāo)) 等，這些表面活性劑可以用在本發(fā)明中。含有標(biāo)記的樣品核酸(A)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)的雜交溶液如本發(fā)明中所述的含有標(biāo)記的樣品核酸和標(biāo)記的鑒定核酸的雜交溶液意指這樣 的雜交溶液，其中加入至少一種標(biāo)記的樣品核酸和至少一種標(biāo)記的鑒定核酸。含有標(biāo)記的樣品核酸(A)、標(biāo)記的鑒定核酸(B)和封閉劑的雜交溶液如本發(fā)明中所述的含有標(biāo)記的樣品核酸、標(biāo)記的鑒定核酸和封閉劑的雜交溶液意 指這樣的雜交溶液，其中加入至少一種標(biāo)記的樣品核酸、至少一種標(biāo)記的鑒定核酸和至少 一種封閉劑。
制備含有多種核酸的雜交溶液制備不含有標(biāo)記的樣品核酸但含有其他核酸的雜交溶液可以由用戶進(jìn)行，但其可 以由陣列的提供者等來(lái)制備并提供。當(dāng)在該雜交溶液中包含標(biāo)記的鑒定核酸(B)時(shí)，理想 的是統(tǒng)一標(biāo)記的鑒定核酸的濃度和類型、產(chǎn)物的批號(hào)等，從而使用戶可以容易地進(jìn)行具有 高準(zhǔn)確性的核酸微陣列測(cè)試。S卩，理想的是還濃縮或純化在上述步驟(a)中制備的標(biāo)記的樣品核酸(A)和在步 驟(b)中制備的標(biāo)記的鑒定核酸中的至少一種，并且理想的是還濃縮或純化在步驟(c)中 制備的雜交溶液。濃縮當(dāng)預(yù)先對(duì)不含標(biāo)記的樣品核酸但含其他核酸的雜交溶液進(jìn)行濃縮時(shí)，運(yùn)行具有高 準(zhǔn)確性的核酸微陣列成為可能。即，認(rèn)為可以進(jìn)行具有更高準(zhǔn)確性的測(cè)試，因?yàn)檫_(dá)到使核酸 彼此雜交的頻率變得很高。純化如本發(fā)明中所述的術(shù)語(yǔ)“純化”與提取、分離和分餾同義使用。另外作為用于純化的手段，可以包括使用攜帶二氧化硅、纖維素衍生物等核酸吸 附膜的柱體、乙醇沉淀或異丙醇沉淀、酚-氯仿萃取的方法，和通過(guò)使用離子交換樹(shù)脂、結(jié) 合了十八烷基等疏水性取代基的二氧化硅載體或具有尺寸排阻作用的樹(shù)脂的固相提取柱 體、和通過(guò)層析的方法。〈用于讀出雜交的方法〉用于讀出核酸陣列上的雜交的方法可以是可以測(cè)量標(biāo)記物的任何方法且不受限 制。另外，在放射性同位素的情形中可以使用X-射線膠片或BASS(富士膠片公司 (Fuji Photo Film))。使用熒光掃描儀的方法是最適合用于本發(fā)明的方法。這在使用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記 的核酸的標(biāo)記化合物時(shí)合適地使用。作為熒光掃描儀，可以提及，例如FLA系列(由Fuji Photo Film 生產(chǎn))，GenePix 系列(Axon 儀器)，LS Reloaded(Tecan)等，然而不特別受限， 條件是只要可以讀取微陣列的設(shè)備。另外，當(dāng)核酸可以在不標(biāo)記的條件下測(cè)量并可以進(jìn)行校正等計(jì)算時(shí)，不能認(rèn)為標(biāo) 記是必需條件。例如，可以考慮由sra系統(tǒng)進(jìn)行的測(cè)量。〈自動(dòng)化〉關(guān)于本發(fā)明的方法，所有步驟可以通過(guò)手動(dòng)進(jìn)行，一些步驟可以利用自動(dòng)化機(jī)器 進(jìn)行或全部步驟可以利用自動(dòng)化機(jī)器進(jìn)行。通過(guò)進(jìn)行自動(dòng)化，工人可以從繁重的工作中釋 放出來(lái)，勞動(dòng)成本降低，并且可以通過(guò)減小由于熟練性差異引起的結(jié)果間差異而防止人為誤差?！磾?shù)據(jù)的提供〉根據(jù)本發(fā)明，可能使用預(yù)先測(cè)量特定標(biāo)準(zhǔn)品的技術(shù)，并通過(guò)提供所述技術(shù)評(píng)估待 測(cè)樣品。結(jié)果，在無(wú)需總制備標(biāo)準(zhǔn)品的條件下單獨(dú)進(jìn)行待測(cè)樣品雜交成為可能，因此有效進(jìn) 行測(cè)試成為可能。另外，還可能通過(guò)將它們作為標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)使用關(guān)于待測(cè)樣品的數(shù)據(jù)。< 程序 >
當(dāng)處理通過(guò)運(yùn)行核酸微陣列測(cè)量獲得的數(shù)據(jù)時(shí)，為了有效進(jìn)行處理，可能進(jìn)行利 用程序的數(shù)據(jù)處理。所述程序一般是以記錄在計(jì)算機(jī)可讀記錄介質(zhì)上的形式提供的。所述記錄介質(zhì)并 不進(jìn)行特別限制，條件是其可被計(jì)算機(jī)讀取。本發(fā)明的記錄介質(zhì)包括便攜型的和固定型的 介質(zhì)，例如，可以提及光盤(CD)，軟盤(FD)、數(shù)字視頻光盤(DVD)，硬盤，半導(dǎo)體存儲(chǔ)器等等。該發(fā)明的程序可以通過(guò)在上述記錄介質(zhì)上記錄來(lái)進(jìn)行流通并且也可以預(yù)先在計(jì) 算機(jī)的記錄裝置上記錄并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)傳遞給其它計(jì)算機(jī)的形式來(lái)進(jìn)行流通。用于本發(fā)明分析法的試劑盒包含具有許多其上分別固定了探針核酸的樣點(diǎn)的核 酸微陣列，和具有能夠與核酸微陣列上全部樣品處的探針核酸的至少各自一部分雜交的序 列的鑒定核酸。所述鑒定核酸可以預(yù)先進(jìn)行標(biāo)記，或者可以由用戶在使用時(shí)進(jìn)行標(biāo)記。此 外，還優(yōu)選提供鑒定核酸，作為控制離子強(qiáng)度或包含表面活性劑等的雜交溶液的組分。
實(shí)施例以下將基于實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限于此。就此而言，除非另外指出，術(shù)語(yǔ)％表示質(zhì)量％。[比較實(shí)施例1]在利用未純化標(biāo)記 的核酸作為樣品并不使用鑒定核酸的情形中的核酸微陣列測(cè)試和分析。<制備未純化的標(biāo)記的核酸>將3 μ 1 (0. 75 μ g)女性 DNA G 1521 (Promega 生產(chǎn))，8 μ 1 水(蒸餾水，無(wú) DNA 酶和 RNA酶，GIBCO生產(chǎn))和BioPrime (R)陣列法CGH基因組標(biāo)記系統(tǒng)的20 μ 1的2. 5χ隨機(jī)引 物溶液(Invitrogen生產(chǎn))放入1. 7ml容量的微量管(鉬管，BM Equipments生產(chǎn))，并在 封閉溫箱BI-5;35A (BLOCK INCUBATOR BI-535A) (ASTEC生產(chǎn))上于95°C進(jìn)行加熱處理5分 鐘。五分鐘后，將微量管從封閉溫箱中取出，在冰上進(jìn)行10分鐘快速冷卻處理。通過(guò)向其 中加入5 μ 1份的BioPrime (R)陣列法CGH基因組標(biāo)記系統(tǒng)的IOx dCTP核苷酸混合物(由 hvitrogen生產(chǎn))，3μ 1 的散裝 250nmol Cy3_dCTP(GE Healthcare Bioscience (GE 健康護(hù) 理生物科學(xué))生產(chǎn))和1 μ 1的BioPrime (R)陣列法CGH基因組標(biāo)記系統(tǒng)(由hvitrogen 生產(chǎn))的Exo-Klenow片段，在封閉溫箱BI-535A上于37°C進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)和標(biāo)記反應(yīng)2小 時(shí)。2小時(shí)后，將微量管從溫箱中取出，并通過(guò)在設(shè)置到65°C的封閉溫箱BI-535A上進(jìn)行加 熱處理來(lái)將包含在反應(yīng)溶液中的Exo-Klenow片段滅活。通過(guò)也對(duì)男性DNA進(jìn)行上述操作，獲得2種類型的未純化的核酸。就此而言，也將 Cy3-dCTP (GE Healthcare Bioscience (GE健康護(hù)理生物科學(xué))生產(chǎn))作為標(biāo)記化合物用于 男性DNA。<制備含有Cot-IDNA的溶液(溶液A) >將65 μ 1份的Cot-IDNA (65 μ g，由hvitrogen生產(chǎn))放入1. 7ml容量微量管中， 并向其中加入6. 5 μ 1的3M乙酸鈉(ρΗ 5. 2)和167 μ 1冷卻至_20°C的乙醇，并混合，隨后 容許該混合物在_80°C靜置10分鐘。之后，使用TOMY SEIKO生產(chǎn)的離心機(jī)MX-300于4°C 以15，OOOrpm進(jìn)行離心30分鐘。離心后，由于沉淀物堆積在離心管底部，棄去上清液同時(shí)小 心不要吸出沉淀物。接下來(lái)，通過(guò)讓離心管靜置10分鐘，同時(shí)打開(kāi)其蓋，除去殘余的乙醇。 十分鐘后，向其中加入18 μ 1 20% SDS并讓其靜置30分鐘。30分鐘后，向其中加入20 μ 1 溶液(其通過(guò)混合和溶解Ig硫酸葡聚糖(SIGMA (西格瑪)生產(chǎn))、5ml甲酰胺和Iml 20 χSSC和然后通過(guò)添加水將液體體積調(diào)節(jié)至7ml來(lái)制備)并通過(guò)攪拌充分混合。就此而言，理想地，該步驟不由用戶進(jìn)行，而由試劑盒生產(chǎn)者預(yù)先制備?！粗苽潆s交溶液〉將20 μ 1份的在 < 制備未純化的標(biāo)記的核酸 > 中制備的女性未純化的標(biāo)記的核 酸、20 μ 1為了符合實(shí)施例1的條件而添加的水和38 μ 1溶液A放入1. 7ml容量的微量管 中并進(jìn)行充分的攪拌(渦旋)處理。另外，以相同的方式，將在〈制備未純化的標(biāo)記的核酸 >中制備的20 μ 1男性未純化的標(biāo)記的核酸、20 μ 1為了符合實(shí)施例1的條件而添加的水和 38 μ 1溶液A放入1. 7ml容量的微量管中并進(jìn)行充分的攪拌(渦旋)處理。<關(guān)于核酸陣列>在大量培養(yǎng)市售BAC克隆后，BAC DNA可以通過(guò)利用離子交換柱(質(zhì)粒微型試劑 ^ 100 (Plasmid Midi Kit 100)，產(chǎn)品目錄號(hào)12145，QIAGEN生產(chǎn))對(duì)其進(jìn)行提取和純化來(lái)獲得。其后，用四堿基識(shí)別酶Rsal，DpnI和HaeIII消化BAC DNA,然后通過(guò)加入銜接子 進(jìn)行連接。接下來(lái)，通過(guò)利用具有銜接子的一個(gè)寡核苷酸的相同序列的引物的PCR方法對(duì)其 進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為約1，000 3，OOObp的探針DNA。利用GENESHOT(NGK INSULATORS生產(chǎn)，Nagoya)，將由此獲得的探針DNA點(diǎn)樣在玻 璃基板上由此，獲得具有總共1，600個(gè)樣點(diǎn)的核酸微陣列，其中在玻璃基板上分別對(duì)由BAC 克隆制備800個(gè)探針DNA種類的每一個(gè)點(diǎn)樣兩個(gè)樣點(diǎn)，并且將其用于以下測(cè)試中。<預(yù)處理核酸微陣列>將約200ml的封閉溶液(由Matsunami Glass生產(chǎn))置于玻璃容器中，將上述核 酸微陣列浸沒(méi)在其中，并利用SLIDE WASHER, Sff-4(由JUJI FIELD生產(chǎn))在上下移動(dòng)載玻 片的同時(shí)進(jìn)行20分鐘的封閉反應(yīng)。在反應(yīng)20分鐘后，從封閉溶液中取出核酸微陣列并將 其置于充以200ml水的容器中。使用SLIDE WASHER將其洗滌3分鐘，并在3分鐘后，再次 將其置于充以200ml新鮮水的容器中，并使用SLIDE WASHER洗滌。3分鐘后，將其置于充以 200ml乙醇的容器中，并再次使用SLIDE WASHER來(lái)對(duì)其進(jìn)行洗滌。3分鐘后，取出核酸微陣 列，并通過(guò)使用臺(tái)式離心機(jī)微型離心干燥器(Spin Dryer mini) 2350 (由TOMY SEIKO生產(chǎn)) 對(duì)其進(jìn)行離心來(lái)干燥所述核酸微陣列。在封閉后，將所述核酸微陣列浸入沸水中2分鐘，隨后將其浸入-20°C的70%乙醇 2分鐘，-20°C的85%乙醇2分鐘，和_20°C的100%乙醇2分鐘，接著，通過(guò)以離心干燥器離 心1分鐘來(lái)干燥核酸微陣列。< 雜交 >1 ^ njSGuidebook for Practical Use of Array CGH Diagnosis-Chromosomal Fine Structure Aberrancy to be Known Beforehand(關(guān) 于實(shí)踐應(yīng)用陣列法CGH診斷的指南——預(yù)先已知的染色體微細(xì)結(jié)構(gòu)異常)(以日文編 寫)，，(Iyaku (Medicine and Drug) Journal (Iyaku (醫(yī)學(xué)和藥物)雜志))中所述的流程來(lái)進(jìn) 行。具體地，將在 < 制備雜交溶液 > 中制備的兩種樣品溶液在75°C分別進(jìn)行16分鐘的加熱 處理。隨后在42°C進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)30分鐘以上。將所述溶液中的每一種逐滴加入至各核酸微陣列板的每個(gè)板上，并以不形成氣泡的方式將間隙蓋玻片04 χ 50mm) (Matsunami Glass 生產(chǎn))置于其上。將這兩個(gè)核酸微陣列置于1號(hào)密封盒(Tight Box No. 1) (CH0PLA生產(chǎn))中，并將 該密封盒置于恒溫箱(HYBRIDIZATION INCUBATOR, HB-80, TAITEC生產(chǎn))中以在37°C進(jìn)行 雜交16小時(shí)。在該情形中，為了防止核酸微陣列的干燥，將紙巾(kimtowel)置于密封盒中 并將細(xì)1 50%甲酰胺Λ χ SSC溶液加入其上。<洗滌核酸微陣列>在進(jìn)行雜交后，將各核酸微陣列置于充以45ml 2 χ SSC溶液的SUMIL0N管中并浸 沒(méi)在其中直至蓋玻片自然脫離核酸微陣列。接下來(lái)，將蓋玻片脫離的各核酸微陣列置于充 以 45ml 的 50% 甲酰胺/2 χ SSC (ρΗ7. 0)溶液的 50ml 容量 SUMIL0N管(Sumitomo Bakelite 生產(chǎn))，所述溶液已經(jīng)預(yù)先加熱至50°C。將其置于雜交溫箱(HYBRIDIZATION INCUBATOR) 中，從而在50°C，通過(guò)以30轉(zhuǎn)/分鐘的速率搖動(dòng)臺(tái)架(stage)進(jìn)行洗滌15分鐘。接下來(lái)， 將各核酸微陣列置于充以2 χ SSC/0. 1% SDS (pH 7. 0)溶液的SUMIL0N管中，所述溶液已 經(jīng)預(yù)先加熱至50°C。將其置于恒溫溫箱中，從而在50°C，通過(guò)以30轉(zhuǎn)/分鐘的速率搖動(dòng)臺(tái) 架進(jìn)行洗滌30分鐘。接下來(lái)，將各核酸微陣列置于充以45ml的2 χ SSC溶液的50ml容量 SUMIL0N管中并在室溫下，通過(guò)以30轉(zhuǎn)/分鐘的速率搖動(dòng)臺(tái)架進(jìn)行洗滌5分鐘。洗滌后，各 核酸微陣列通過(guò)利用微型離心干燥器2350進(jìn)行離心1分鐘來(lái)干燥。<數(shù)據(jù)獲取>將由此洗滌的兩個(gè)微陣列使用GenePix 4000B (由Axon Instruments生產(chǎn))進(jìn)行 掃描。<數(shù)據(jù)處理>通過(guò)將未純化的標(biāo)記的核酸Cy3_女性-來(lái)源的熒光值視為FF，將其本底噪聲視為 BF,將未純化的標(biāo)記的核酸Cy3-男性-來(lái)源的熒光值視為FM，將其本底噪聲視為BM，利用 對(duì)數(shù)比=Lo&{ (FF-BF)/(FM-BM)}計(jì)算對(duì)數(shù)比(Log Ratio)。在該情形中，對(duì)所有樣點(diǎn)計(jì)算 對(duì)數(shù)比值。就此而言，雖然在該比較實(shí)施例中減去本底噪聲值，但是存在不必須減去的情形。另外，從與X染色體相對(duì)應(yīng)部分的對(duì)數(shù)比值中減去與常染色體相對(duì)應(yīng)部分的對(duì)數(shù) 比值的結(jié)果也可以計(jì)算為對(duì)數(shù)比的差。由于女性具有2個(gè)X染色體且男性具有1個(gè)X染色體，對(duì)數(shù)比的差值理論上為1.0。< 結(jié)果 >對(duì)數(shù)比的圖表顯示在圖2中。[發(fā)明實(shí)施例1]在使用未純化的標(biāo)記的核酸作為樣品和未純化的標(biāo)記的Cot-I DNA作為鑒定核酸的情形中的核酸微陣列測(cè)試和分析<制備未純化的標(biāo)記的核酸>各未純化的標(biāo)記的樣品核酸通過(guò)比較實(shí)施例1的 < 制備未純化的標(biāo)記的核酸 > 的 相同方法，由女性-來(lái)源的核酸和男性-來(lái)源的核酸制備。<制備未純化的標(biāo)記的鑒定核酸>將0.75 μ g Cot-I DNA，8yl的水，20μ1的2.切隨機(jī)引物溶液置于1.7ml容量的 微量管(鉬管，由BM Equipment生產(chǎn))中，并在95°C，在封閉溫箱BI-535A中進(jìn)行加熱處理5分鐘。5分鐘后，取出微量管，并在冰上進(jìn)行10分鐘快速冷卻處理。向其中加入5μ1份的 10 X dCTP 核苷酸混合物，3μ 1 的散裝 250nmol Cy5_dCTP(GE Healthcare Bioscience (GE 健康護(hù)理生物科學(xué))生產(chǎn))和1 μ 1的Exo-Klenow片段，在封閉溫箱ΒΙ-535Α上于37°C進(jìn) 行擴(kuò)增反應(yīng)和標(biāo)記反應(yīng)2小時(shí)。2小時(shí)后，將微量管從溫箱中取出，并通過(guò)在設(shè)置到65°C的 封閉溫箱BI-535A上進(jìn)行加熱處理來(lái)將包含在反應(yīng)溶液中的Exo-Klenow片段滅活?！粗苽淙芤篈>制備溶液A通過(guò)比較實(shí)施例1的相同方法進(jìn)行。〈制備雜交溶液〉將20 μ 1份的在 < 制備未純化的標(biāo)記的核酸 > 中制備的未純化的標(biāo)記的樣品核酸 Cy3-女性、20 μ 1在 < 純化未純化的標(biāo)記的鑒定核酸 > 中制備的未純化的標(biāo)記的鑒定核酸 Cy5-Cot-l DNA和38 μ 1溶液A放入1. 7ml容量的微量管中并進(jìn)行充分的攪拌(渦旋)處 理。另外，以相同的方式，將20 μ 1份的在 < 制備未純化的標(biāo)記的核酸 > 中制備的未純化的 標(biāo)記的樣品核酸Cy3-男性、20 μ 1在 < 純化未純化的標(biāo)記的鑒定核酸 > 中制備的未純化的 標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA和38 μ 1溶液A放入1. 7ml容量的微量管中并進(jìn)行充分的 攪拌(渦旋)處理?！搭A(yù)處理核酸微陣列〉這通過(guò)比較實(shí)施例1的 < 預(yù)處理核酸微陣列 > 的相同方法進(jìn)行?！措s交〉雜交通過(guò)比較實(shí)施例1的〈雜交〉的相同方法進(jìn)行。在該情形中，未純化的標(biāo)記 的樣品核酸Cy3-女性和未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA的混合物以及未純化的 標(biāo)記的樣品核酸Cy3-男性和未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA的混合物分別用作樣品?！聪礈旌怂嵛㈥嚵小迪礈旌怂嵛㈥嚵型ㄟ^(guò)比較實(shí)施例1的 < 洗滌核酸微陣列 > 的相同方法進(jìn)行?！磾?shù)據(jù)獲取〉將由此洗滌的兩個(gè)微陣列使用GenePix 4000B (由Axon Instruments生產(chǎn))進(jìn)行 掃描。<數(shù)據(jù)處理>通過(guò)將未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy3_女性-來(lái)源的熒光值視為FF，將其本底噪 聲視為BF，將與未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy3-女性同時(shí)雜交的未純化的標(biāo)記的鑒定核 酸Cy5-Cot-l DNA的熒光值視為Fcl，將其本底噪聲視為Bcl，將未純化的標(biāo)記的樣品核酸 Cy3-男性-來(lái)源的熒光值視為FM，將其本底噪聲視為BM，將與未純化的標(biāo)記的樣品核酸 Cy3-男性同時(shí)雜交的未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA的熒光值視為Fc2，將其本 底噪聲視為Bc2，通過(guò)下列公式計(jì)算校正后男性-來(lái)源的未純化的標(biāo)記的樣品核酸的熒光 值FM，F(xiàn)M，= (FeI-Bc 1)/(Fc2-BC2)X(FM-BM)。對(duì)所有樣點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算。在該情形中，校正 后的女性-來(lái)源的未純化的標(biāo)記的樣品核酸的熒光值FF’可以通過(guò)下式計(jì)算。FF' = (Fc2_Bc2)/(Fcl-Bcl) χ (FF-BF)就此而言，雖然在本發(fā)明實(shí)施例中減去本底噪聲值，但是存在不必須減去的情形。
另外，對(duì)數(shù)比值可以通過(guò)下式計(jì)算對(duì)數(shù)比(Log Ratio) = Log2 {(FF-BF)/FM' }。該計(jì)算針對(duì)全部樣點(diǎn)進(jìn)行。就此而言，當(dāng)計(jì)算FF’時(shí)，對(duì)數(shù)比值可以利用
對(duì)數(shù)比=Log2 {FF，/ (FM-BM)}來(lái)計(jì)算。對(duì)數(shù)比差通過(guò)以比較實(shí)施例1中相同的方式計(jì)算獲得。< 結(jié)果 >對(duì)數(shù)比的繪圖顯示在圖3中。當(dāng)比較實(shí)施例1的圖2與發(fā)明實(shí)施例1的圖3比較時(shí)，常染色體的標(biāo)繪在通過(guò)未 純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA進(jìn)行校正的情形中一般在零點(diǎn)附近。其對(duì)對(duì)數(shù)比差進(jìn)行繪圖的附圖顯示在圖4中。就此而言，對(duì)數(shù)比差通過(guò)比較實(shí)施 例1的相同方法獲得。即，對(duì)數(shù)比差由X染色體結(jié)構(gòu)部分對(duì)數(shù)比平均值和常染色體結(jié)構(gòu)部 分對(duì)數(shù)比平均值之間的差異計(jì)算。較大的該差值意味著作為核酸微陣列測(cè)量的優(yōu)越性。當(dāng) 不進(jìn)行校正時(shí)，其為0. 38，且在進(jìn)行校正時(shí)為0. 55，因此通過(guò)校正將對(duì)數(shù)比差增大約0. 17。 首先，X染色體數(shù)在比較男性和女性時(shí)不同，因此必然存在與常染色體的不同。當(dāng)該差異更 清楚時(shí)，可以以更高的靈敏性理解拷貝數(shù)變化，并可以進(jìn)行更正確的評(píng)判。即，對(duì)數(shù)比差顯 示鑒定核酸的應(yīng)用效力的事實(shí)。圖5顯示僅對(duì)與女性-來(lái)源的和男性-來(lái)源的常染色體結(jié)構(gòu)部分相對(duì)應(yīng)的部分的 常染色體結(jié)構(gòu)部分計(jì)算的差量平均值。在進(jìn)行校正的情形中，差量為0. 189，其與未校正的 差量0. 313相比是非常小的數(shù)值且接近真實(shí)值，因此顯示出鑒定核酸的應(yīng)用效力。[發(fā)明實(shí)施例2]在使用未純化的標(biāo)記的核酸作為樣品和未純化的標(biāo)記的鑒定核 酸作為鑒定核酸的情形中的核酸微陣列測(cè)試和分析<制備未純化的標(biāo)記的核酸>各未純化的標(biāo)記的樣品核酸通過(guò)比較實(shí)施例1的相同方法，由女性-來(lái)源的核酸 和男性-來(lái)源的核酸制備?！粗苽湮醇兓臉?biāo)記的鑒定核酸〉在該發(fā)明實(shí)施例中，將女性-來(lái)源的未純化的標(biāo)記的核酸用作未純化的標(biāo)記的鑒 定核酸。在該情形中，將Cy3用作標(biāo)記化合物。<制備溶液A>制備溶液A通過(guò)比較實(shí)施例1的相同方法進(jìn)行。<制備雜交溶液>將20 μ 1份的在 < 制備未純化的標(biāo)記的核酸 > 中制備的未純化的標(biāo)記的樣品核酸 Cy5-女性、20 μ 1在 < 純化未純化的標(biāo)記的鑒定核酸 > 中制備的未純化的標(biāo)記的鑒定核酸 Cy3-女性DNA和38 μ 1溶液A放入1. 7ml容量的微量管中并進(jìn)行充分的攪拌(渦旋)處 理。另外，以相同的方式，將20 μ 1在 < 制備未純化的標(biāo)記的核酸 > 中制備的未純化的標(biāo)記 的樣品核酸Cy5-男性、20 μ 1在 < 純化未純化的標(biāo)記的鑒定核酸 > 中制備的未純化的標(biāo)記 的鑒定核酸Cy3-女性DNA和38 μ 1溶液A放入1. 7ml容量的微量管中并進(jìn)行充分的攪拌 (渦旋)處理。<預(yù)處理核酸微陣列>這通過(guò)比較實(shí)施例1的 < 預(yù)處理核酸微陣列 > 的相同方法進(jìn)行。
< 雜交 >雜交通過(guò)比較實(shí)施例1的〈雜交〉的相同方法進(jìn)行。在該情形中，未純化的標(biāo)記 的樣品核酸Cy5_女性和未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy3_女性的混合物以及未純化的標(biāo)記的 樣品核酸Cy5_男性和未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy3_女性的混合物分別用作樣品?！聪礈旌怂嵛㈥嚵小颠@通過(guò)比較實(shí)施例1的 < 洗滌核酸微陣列 > 的相同方法進(jìn)行。<數(shù)據(jù)獲取>將由此洗滌的兩個(gè)微陣列使用GenePix 4000B (由Axon Instruments生產(chǎn))進(jìn)行 掃描。<數(shù)據(jù)處理>通過(guò)將未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy5_女性-來(lái)源的熒光值視為FF，將其本底噪 聲視為BF，將與未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy5-女性同時(shí)雜交的未純化的標(biāo)記的鑒定核 酸Cy3-女性DNA的熒光值視為Fcl，將其本底噪聲視為Bcl，將未純化的標(biāo)記的樣品核酸 Cy5-男性-來(lái)源的熒光值視為FM，將其本底噪聲視為BM，將與未純化的標(biāo)記的樣品核酸 Cy5-男性同時(shí)雜交的未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy3-女性DNA的熒光值視為Fc2，將其本底 噪聲視為Bc2，通過(guò)下列公式計(jì)算校正后男性-來(lái)源的未純化的標(biāo)記的樣品核酸的熒光值 FM，F(xiàn)M，= (Fcl-Bcl)/(Fc2_Bc2)χ(FM-BM)。對(duì)所有樣點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算。就此而言，雖然在本發(fā)明實(shí)施例中減去本底噪聲值，但是存在不必須減去的情形。另外，對(duì)數(shù)比值可以通過(guò)下式計(jì)算對(duì)數(shù)比=Log2 {(FF-BF)/FM' }。該計(jì)算針對(duì)全部樣點(diǎn)進(jìn)行。對(duì)數(shù)比差通過(guò)以比較實(shí)施例1中相同的方式計(jì)算獲得。< 結(jié)果 >對(duì)數(shù)比的繪圖顯示在圖6中。當(dāng)與圖3中不使用鑒定核酸的情形比較時(shí)，常染色體和X染色體之間的區(qū)別非常 清楚且對(duì)數(shù)比值也處于一定范圍內(nèi)，由此也顯示出該發(fā)明實(shí)施例中鑒定核酸的應(yīng)用效力。[發(fā)明實(shí)施例3]當(dāng)對(duì)數(shù)比明顯變化時(shí)的校正實(shí)施例<制備未純化的標(biāo)記的核酸>各未純化的標(biāo)記的樣品核酸通過(guò)比較實(shí)施例1的相同方法，由女性-來(lái)源的核酸 和男性-來(lái)源的核酸制備。<制備未純化的標(biāo)記的鑒定核酸>利用Cot-I DNA作為鑒定核酸制備未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot_l DNA。<制備溶液A>制備溶液A通過(guò)比較實(shí)施例1的相同方法進(jìn)行。<制備雜交溶液>制備含有未純化的標(biāo)記的樣品核酸和未純化的標(biāo)記的鑒定核酸的雜交溶液。 即，制備含有未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy3_女性和未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot_l DNA的雜交溶液，和含有未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy3-男性和未純化的標(biāo)記的鑒定核酸 Cy5-Cot-l DNA的雜交溶液。
<預(yù)處理核酸微陣列>這通過(guò)比較實(shí)施例1的 < 預(yù)處理核酸微陣列 > 的相同方法進(jìn)行。在該情形中，將由BAC克隆制備的、以NGK INSULATORS點(diǎn)樣的由800個(gè)基因，2樣 點(diǎn)/基因組成的1，600樣點(diǎn)的微陣列用作核酸微陣列。< 雜交 >雜交通過(guò)比較實(shí)施例1的〈雜交〉的相同方法進(jìn)行。在該情形中，未純化的標(biāo)記 的樣品核酸Cy3-女性和未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA的混合物以及未純化的 標(biāo)記的樣品核酸Cy3-男性和未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA的混合物分別用作樣品。<洗滌核酸微陣列>這通過(guò)比較實(shí)施例1的 < 洗滌核酸微陣列 > 的相同方法進(jìn)行?！磾?shù)據(jù)獲取〉將由此洗滌的兩個(gè)核酸微陣列使用GenePix 4000B(由Axon Instruments生產(chǎn)) 進(jìn)行掃描。<數(shù)據(jù)處理>這通過(guò)發(fā)明實(shí)施例1的 < 數(shù)據(jù)處理 > 中的相同方法進(jìn)行。< 結(jié)果 >由該發(fā)明實(shí)施例獲得的掃描圖像顯示在圖8中。右側(cè)附圖的右側(cè)中垂直行的圖像 密度變得稀疏。在不利用鑒定核酸進(jìn)行校正的情形中的對(duì)數(shù)比繪圖顯示在圖8中。在利用鑒定核酸進(jìn)行熒光值校正的情形中的對(duì)數(shù)比繪圖顯示在圖9中。當(dāng)比較圖8和圖9時(shí)，在圖8的情形中，認(rèn)為源自圖7B圖像右側(cè)垂直行的讀數(shù)標(biāo) 記量的稀疏性是其原因，且該區(qū)域內(nèi)的樣點(diǎn)對(duì)數(shù)比值顯示與真實(shí)值明顯不同的數(shù)值。然而， 與該數(shù)據(jù)相反，當(dāng)評(píng)估圖9的結(jié)果時(shí)，其中計(jì)算公式中包括通過(guò)鑒定核酸校正的數(shù)值，明顯 成功地減少數(shù)據(jù)波動(dòng)。因此，本發(fā)明的方法特別在數(shù)據(jù)明顯變化時(shí)發(fā)揮其功效。[發(fā)明實(shí)施例4]當(dāng)雜交溶液中含有標(biāo)記的鑒定核酸的結(jié)果<制備未純化的標(biāo)記的核酸>各未純化的標(biāo)記的樣品核酸通過(guò)比較實(shí)施例1的相同方法，由女性-來(lái)源的核酸 和男性-來(lái)源的核酸制備。就此而言，Cy3用于兩種情形中。<制備未純化的標(biāo)記的鑒定核酸>通過(guò)發(fā)明實(shí)施例1的相同方法，利用Cy5作為標(biāo)記化合物和Cot_l DNA作為鑒定 核酸制備未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA。<制備含有標(biāo)記的鑒定核酸的溶液(溶液B) >將20 μ 1份的在 < 制備未純化的標(biāo)記的鑒定核酸 > 中制備的Cy5-Cot_l DNA和 65 μ 1(65 μ g) Cot-I DNA放入1. 7ml容量的微量管中，并向其中加入8. 5 μ 1的3Μ乙酸鈉 (ρΗ 5. 2)和218 μ 1冷卻至-20°C的乙醇，并混合，隨后容許該混合物在_80°C靜置10分鐘。 之后，使用TOMY SEIKO生產(chǎn)的離心機(jī)MX-300于4°C以15，OOOrpm進(jìn)行離心30分鐘。離心 后，由于沉淀物堆積在離心管底部，棄去上清液同時(shí)小心不要吸出沉淀物。接下來(lái)，通過(guò)讓離心管靜置10分鐘，同時(shí)打開(kāi)其蓋，除去殘余的乙醇。十分鐘后，向其中加入18 μ 1 20% SDS并讓其靜置30分鐘。30分鐘后，向其中加入20 μ 1溶液(其通過(guò)混合和溶解Ig硫酸 葡聚糖(SIGMA (西格瑪)生產(chǎn))、5ml甲酰胺和Iml 20 χ SSC和然后通過(guò)添加水將液體體 積調(diào)節(jié)至7ml制備)并充分混合該溶液以獲得溶液B。理想地，該步驟不用用戶進(jìn)行，而由試劑盒生產(chǎn)者預(yù)先制備。<制備雜交溶液>將20 μ 1份的在 < 制備未純化的標(biāo)記的核酸 > 中制備的未純化的標(biāo)記的樣品核酸 Cy3-女性和58 μ 1溶液B放入1. 7ml容量的微量管中并進(jìn)行充分的攪拌(渦旋)處理。另 外，以相同的方式，將20μ 1在〈制備未純化的標(biāo)記的核酸〉中制備的未純化的標(biāo)記的樣品 核酸Cy3-男性和58 μ 1溶液B放入1. 7ml容量的微量管中并進(jìn)行充分的攪拌(渦旋)處理。<預(yù)處理核酸微陣列>這通過(guò)比較實(shí)施例1的 < 預(yù)處理核酸微陣列 > 的相同方法進(jìn)行。< 雜交 >雜交通過(guò)比較實(shí)施例1的〈雜交〉的相同方法進(jìn)行。在該情形中，未純化的標(biāo)記 的樣品核酸Cy3-女性和未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA的混合物以及未純化的 標(biāo)記的樣品核酸Cy3-男性和未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA的混合物分別用作樣品。<洗滌核酸微陣列>這通過(guò)比較實(shí)施例1的 < 洗滌核酸微陣列 > 的相同方法進(jìn)行。<數(shù)據(jù)獲取>將由此洗滌的兩個(gè)微陣列使用GenePix 4000B (由Axon Instruments生產(chǎn))進(jìn)行 掃描。<數(shù)據(jù)處理>這通過(guò)發(fā)明實(shí)施例1的 < 數(shù)據(jù)處理 > 中的相同方法進(jìn)行?！唇Y(jié)果〉本發(fā)明實(shí)施例的對(duì)數(shù)比繪圖顯示在圖10中。對(duì)數(shù)比差變?yōu)?. 644，其與圖5 (發(fā)明實(shí)施例1)的校正結(jié)果的數(shù)值0. 547相比提 高約0. 1，這顯示進(jìn)一步提高的作為核酸微陣列的能力。認(rèn)為其原因?yàn)檫M(jìn)行純化的影響，因 為在本發(fā)明實(shí)施例的情形中，在混合未純化的標(biāo)記的鑒定核酸和雜交溶液后進(jìn)行了乙醇沉 淀，即純化，而在發(fā)明實(shí)施例1的情形中將未純化的標(biāo)記的鑒定核酸直接加入至雜交溶液 中并攪拌，且通過(guò)進(jìn)行乙醇沉淀，雜交溶液的液體體積與本發(fā)明實(shí)施例1的情形相比減小 20 μ 1，即增加雜交溶液中核酸濃度的作用。另外，差量也變?yōu)?. 134，其小于圖6中的校正 結(jié)果0. 189，因此其作為核酸微陣列的能力進(jìn)一步提高。認(rèn)為這也是關(guān)于相同原因的理由。[發(fā)明實(shí)施例5]利用標(biāo)記的鑒定核酸的量依賴性〈制備未純化的標(biāo)記的核酸〉各未純化的標(biāo)記的樣品核酸通過(guò)比較實(shí)施例1的相同方法，由女性-來(lái)源的核酸 和男性-來(lái)源的核酸制備?！粗苽湮醇兓臉?biāo)記的鑒定核酸〉
通過(guò)發(fā)明實(shí)施例1的相同方法，利用Cy5作為標(biāo)記化合物和Cot_l DNA作為鑒定 核酸制備未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA。在該情形中，將3yg Cot-I DNA用作 Cot-I DNA。<制備含有標(biāo)記的鑒定核酸的溶液>這通過(guò)發(fā)明實(shí)施例3的 < 制備含有標(biāo)記的鑒定核酸的溶液 > 中的相同方法進(jìn)行?！粗苽潆s交溶液〉這通過(guò)發(fā)明實(shí)施例3的 < 制備雜交溶液 > 中的相同方法進(jìn)行。<預(yù)處理核酸微陣列>這通過(guò)比較實(shí)施例1的 < 預(yù)處理核酸微陣列 > 的相同方法進(jìn)行。< 雜交 >這通過(guò)發(fā)明實(shí)施例1的〈雜交〉中的相同方法進(jìn)行。<洗滌核酸微陣列>這通過(guò)比較實(shí)施例1的 < 洗滌核酸微陣列 > 的相同方法進(jìn)行。<數(shù)據(jù)獲取>將由此洗滌的兩個(gè)微陣列使用GenePix 4000B (由Axon Instruments生產(chǎn))進(jìn)行 掃描?！磾?shù)據(jù)處理〉這通過(guò)發(fā)明實(shí)施例1的 < 數(shù)據(jù)處理 > 中的相同方法進(jìn)行。< 結(jié)果 >在利用鑒定核酸進(jìn)行熒光值校正的情形中的對(duì)數(shù)比的繪圖顯示在圖11中。與圖 10比較，常染色體進(jìn)一步會(huì)聚在0。對(duì)數(shù)比差變?yōu)?.641，其在與這樣的情形的結(jié)果(發(fā)明 實(shí)施例4)數(shù)值0. 644相比，幾乎相同，在所述情形中使用利用0. 75 μ g Cot-I DNA作為初 始材料制備的未純化的標(biāo)記的鑒定核酸。[發(fā)明實(shí)施例6]不同陣列形式之間的校正根據(jù)本發(fā)明，即使當(dāng)陣列之間生產(chǎn)日、生產(chǎn)方法、生產(chǎn)批次、繪圖模式、固定的探針 核酸量等不同時(shí)，它們的校正可以在使用相同類型的探針核酸時(shí)進(jìn)行。作為其實(shí)例，在陣列 上具有不同繪圖模式，即陣列形式的情形的發(fā)明實(shí)施例顯示如下?！搓嚵?>陣列1是這樣的陣列，在其上對(duì)16個(gè)基因的每一個(gè)點(diǎn)樣4個(gè)樣點(diǎn)，總共 64個(gè)樣點(diǎn)。這是與比較實(shí)施例1等中使用的陣列相同的陣列。<陣列2>陣列2是多重測(cè)試樣品陣列，在其上對(duì)550個(gè)基因的每一個(gè)點(diǎn)樣3個(gè)樣 點(diǎn)，并具有兩個(gè)雜交區(qū)。就此而言，陣列2的雜交利用雜交儀來(lái)進(jìn)行。在該發(fā)明實(shí)施例中，利用鑒定核酸在這兩種陣列中普遍的10種探針核酸之間進(jìn) 行比較。10 種探針是 20pll. 22，20pl2. 3，20pll. 21，21q22. 3，22ql2. 2，Xpll. 23，Xpl2, Xql3. 3，Xq24 和 Xq26. 2。利用女性DNA和男性DNA作為樣品并利用Cot_l DNA作為鑒定核酸，通過(guò)其它發(fā) 明實(shí)施例的相同方法進(jìn)行樣品的標(biāo)記、雜交和數(shù)據(jù)獲取。就此而言，盡管陣列2是多重測(cè)試 樣品陣列，但是使用來(lái)自僅一個(gè)雜交區(qū)的數(shù)據(jù)。另外，盡管將相同探針的4個(gè)樣點(diǎn)點(diǎn)樣在陣 列1上，但是它們中的3個(gè)用于比較。數(shù)據(jù)的評(píng)估通過(guò)利用3點(diǎn)的平均值舉例說(shuō)明對(duì)數(shù)比 來(lái)進(jìn)行。
圖12是這樣的情形的結(jié)果，在所述情形中，雜交針對(duì)陣列1的兩個(gè)板進(jìn)行，即第 一陣列上的具有Cy5-Cot-l DNA的Cy3_女性DNA，和第二陣列上的具有Cy5-Cot_l DNA的 Cy3-男性DNA，且它們的校正通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行。如附圖中所示，常染色體結(jié)構(gòu)部分和 X染色體結(jié)構(gòu)部分彼此充分分開(kāi)。圖13是這樣的情形的結(jié)果，在所述情形中，雜交針對(duì)陣列2的兩個(gè)板進(jìn)行，即第 一陣列上的具有Cy5-Cot-l DNA的Cy3_女性DNA，和第二陣列上的具有Cy5-Cot_l DNA的 Cy3-男性DNA，且它們的校正通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行。如附圖中所示，常染色體結(jié)構(gòu)部分和 X染色體結(jié)構(gòu)部分也在該情形中彼此充分分開(kāi)。圖14是這樣的情形的結(jié)果，在所述情形中，雜交針對(duì)利用陣列1和陣列2的兩 個(gè)板進(jìn)行，即第一陣列上的具有Cy5-Cot-l DNA的Cy3_男性DNA，和第二陣列上的具有 Cy5-Cot-l DNA的Cy3_女性DNA，且不進(jìn)行它們的校正。如附圖中所示，常染色體結(jié)構(gòu)部分 和X染色體結(jié)構(gòu)部分不彼此分開(kāi)。圖15是這樣的情形的結(jié)果，在所述情形中，雜交針對(duì)利用陣列1和陣列2的兩 個(gè)板進(jìn)行，即第一陣列上的具有Cy5-Cot-l DNA的Cy3_男性DNA，和第二陣列上的具有 Cy5-Cot-l DNA的Cy3_女性DNA，且它們的校正通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行。如附圖中所示，常 染色體結(jié)構(gòu)部分和X染色體結(jié)構(gòu)部分彼此充分分開(kāi)。當(dāng)與圖14比較時(shí)，顯示通過(guò)本發(fā)明使 用鑒定核酸是明顯有效的方法，因?yàn)榧词乖陉嚵行问讲煌瑫r(shí)，也可以充分進(jìn)行校正。另外， 由于雜交在不同條件下進(jìn)行，即通過(guò)蓋玻片對(duì)陣列1進(jìn)行手動(dòng)靜態(tài)雜交和通過(guò)雜交儀對(duì)陣 列2進(jìn)行攪拌型雜交，這些結(jié)果顯示即使當(dāng)雜交條件不同時(shí)，它們的校正可以通過(guò)使用本 發(fā)明的方法充分進(jìn)行。[發(fā)明實(shí)施例7]采用提供數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)形式的核酸微陣列〈制備未純化的標(biāo)記的核酸〉，〈制備未純化的標(biāo)記的鑒定核酸〉，〈制備含有Cot-I DNA溶液 >，< 制備雜交溶液 >，< 預(yù)處理核酸微陣列 >，〈雜交 > 和 < 洗滌核酸微陣列 > 通過(guò) [本發(fā)明實(shí)施例1]的相同方法進(jìn)行。在該情形中，Cy3-女性DNA，即假設(shè)正常細(xì)胞-來(lái)源 的核酸，和標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA用作提供數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)的數(shù)據(jù)的樣品，這些核酸在核 酸微陣列上雜交，并由其獲得的數(shù)據(jù)用作數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)提供應(yīng)用的數(shù)據(jù)。在計(jì)算該數(shù)據(jù)那天之 后的另一天，Cy3-男性DNA，即假設(shè)異常細(xì)胞-來(lái)源的核酸，和標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot_l DNA(使用與上述標(biāo)記的鑒定核酸Cy5-Cot-l DNA完全相同的樣品)在核酸微陣列(其具有 與上述核酸微陣列相同的探針和相同的探針排列)上雜交，并且利用該數(shù)據(jù)和上述數(shù)據(jù)， 根據(jù)[本發(fā)明實(shí)施例1]的 < 數(shù)據(jù)處理 > 進(jìn)行由這兩種標(biāo)記的鑒定核酸對(duì)Cy3-男性DNA標(biāo) 記量值的校正。< 結(jié)果 >該結(jié)果顯示在圖16中。常染色體結(jié)構(gòu)部分的數(shù)據(jù)會(huì)聚在0點(diǎn)，且還充分發(fā)現(xiàn)X染 色體結(jié)構(gòu)部分的分離。[發(fā)明實(shí)施例8]其中使用載體-來(lái)源的核酸作為鑒定核酸的情形中的核酸微陣列 測(cè)試和分析<制備未純化的標(biāo)記的核酸>各未純化的標(biāo)記的樣品核酸通過(guò)比較實(shí)施例1的相同方法，由女性-來(lái)源的核酸 和男性-來(lái)源的核酸制備。在該情形中，女性和男性二者均用Cy3來(lái)標(biāo)記。
<制備未純化的標(biāo)記的鑒定核酸>在該發(fā)明實(shí)施例中，使用載體-來(lái)源的核酸作為鑒定核酸。<制備鑒定核酸>由RPCI-Il中選擇一個(gè)克隆并在LB培養(yǎng)基中，使用BE-43FL(TAITEC生產(chǎn))37°C 培養(yǎng)過(guò)夜，所述LB培養(yǎng)基已經(jīng)增補(bǔ)了氯霉素至100mg/ml的濃度。使用由Qiagen制造的 QIAamp微量制備試劑盒^lIAamp Miniprep kit)從其提取BAC。使用由Nippon Gene生產(chǎn) 的限制酶NotI消化由此提取的BAC，并將其進(jìn)行瓊脂糖電泳。切去約71Λ的片段，并將其使 用麗制造的Nucleospin柱從瓊脂糖中純化。使用由hvitrogen生產(chǎn)的T4 DNA連接酶， 在4°C將其連接一夜。由此，獲得了 pBAC108L。將pBAC108L加入由hvitrogen生產(chǎn)的DH-10B化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，容許在冰上靜 置30分鐘后，將其在42°C加熱30秒，接著再次在冰上靜置2分鐘。將其與600 μ L的SOC 培養(yǎng)基混合，并且用分散片(spreader)將其分散在包含100mg/mL的氯霉素的LB培養(yǎng)基 中。將其在37°C靜置兩夜，挑取如此生長(zhǎng)的克隆，并接種到含100mg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基 中。將其在37°C培養(yǎng)一夜后，使用QIApr印生產(chǎn)的QIApr印旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒(QIApr印 spin Miniprep kit)提取BAC DNA，從而獲得BAC載體。通過(guò)利用Cy5對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，獲得 載體-來(lái)源的標(biāo)記的鑒定核酸。<制備溶液A>制備溶液A通過(guò)比較實(shí)施例1的相同方法進(jìn)行。<制備雜交溶液>將20μ1份的通過(guò)發(fā)明實(shí)施例1的相同方法制備的未純化的標(biāo)記的樣品核酸 Cy3-女性、20 μ 1通過(guò)發(fā)明實(shí)施例1的相同方法制備的未純化的標(biāo)記的鑒定核酸Cy3-女性 DNA和38 μ 1溶液A放入1.7ml容量的微量管中并進(jìn)行充分的攪拌(渦旋)處理。另外，以 相同的方式，將20μ 1在 < 制備未純化的標(biāo)記的核酸 > 中制備的未純化的標(biāo)記的樣品核酸 Cy3-男性、20 μ 1在 < 制備鑒定核酸 > 中制備的載體-來(lái)源的標(biāo)記的鑒定核酸和38 μ 1溶 液A放入1.7ml容量的微量管中并進(jìn)行充分的攪拌(渦旋)處理。<預(yù)處理核酸微陣列>這通過(guò)比較實(shí)施例1的 < 預(yù)處理核酸微陣列 > 的相同方法進(jìn)行。< 雜交 >雜交以與比較實(shí)施例1的〈雜交〉的相同方法進(jìn)行。然而，在該情形中，使用由 ALOKA生產(chǎn)的HS-300作為雜交裝置。另外，未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy3_女性與上述 載體-來(lái)源的標(biāo)記的鑒定核酸的混合物，和未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy3-男性與上述載 體-來(lái)源的標(biāo)記的鑒定核酸的混合物分別用作兩種類型的樣品。<洗滌核酸微陣列>這通過(guò)比較實(shí)施例1的 < 洗滌核酸微陣列 > 的相同方法進(jìn)行。<數(shù)據(jù)獲取>將由此洗滌的兩個(gè)微陣列使用GenePix 4000B (由Axon Instruments生產(chǎn))進(jìn)行 掃描。<數(shù)據(jù)處理>通過(guò)將未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy3_女性-來(lái)源的熒光值視為FF，將與未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy3_女性同時(shí)雜交的載體-來(lái)源的標(biāo)記的鑒定核酸的熒光值視為FclJf 未純化的標(biāo)記的樣品核酸Cy3_男性-來(lái)源的熒光值視為FM，將與未純化的標(biāo)記的樣品核酸 Cy3-男性同時(shí)雜交的載體-來(lái)源的標(biāo)記的鑒定核酸的熒光值視為Fc2，基于Lo&(FM/Fc2/ FF - Fcl)計(jì)算數(shù)值并針對(duì)每一探針染色體進(jìn)行排列。另外，對(duì)相同探針的數(shù)值取平均值并 制成圖表。結(jié)果顯示在圖17中。Lo&(FM/Fc2/FF · Fcl)值在常染色體的情形中幾乎會(huì)聚在 士0. 25內(nèi)，并且在X染色體的情形中變?yōu)閹缀?. 6以上的差異，因此其可以以高靈敏性來(lái)檢 測(cè)。工業(yè)適用性盡管可能通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品使用相同標(biāo)記物來(lái)除去由于不同標(biāo)記物引起 的差異，但是進(jìn)一步使用借助于標(biāo)記的鑒定核酸(B)的校正法已經(jīng)導(dǎo)致可能除去核酸微陣 列之間樣點(diǎn)的差異和高度精確的核酸微陣列測(cè)量。另外，合適的校正可以通過(guò)是本發(fā)明的 校正法來(lái)進(jìn)行，即使當(dāng)樣點(diǎn)不同時(shí)，只要使用相同的探針即可。例如，即使當(dāng)探針核酸的點(diǎn) 樣量和樣點(diǎn)排列和數(shù)量不同時(shí)，其進(jìn)一步變?yōu)榭赡苄Ｕ呻s交后微小雜交條件引起的差
已關(guān)于在執(zhí)行校正中使用的標(biāo)記的鑒定核酸(B)，還發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步良好的結(jié)果可以通 過(guò)在其標(biāo)記步驟中進(jìn)一步增加其所需濃度而獲得。本申請(qǐng)基于2008年5月27日提交的日本專利申請(qǐng)JP 2008-138533和2009年5 月26日提交的JP 2009-U6780，通過(guò)參考將其全部?jī)?nèi)容引入本文，如同詳述的那樣。
權(quán)利要求
1.一種借助于核酸微陣列的分析法，所述核酸微陣列具有在其上固定第一探針核酸的 樣點(diǎn)(X 1)，所述方法包括容許待測(cè)樣品的標(biāo)記的樣品核酸(A 1)與固定在所述樣點(diǎn)(X 1)上的第一探針核酸雜 對(duì)所述樣點(diǎn)(X 1)提供標(biāo)記的鑒定核酸(B)，所述鑒定核酸(B)具有能夠與所述第一探 針核酸的至少一部分雜交的序列并用與標(biāo)記的樣品核酸(A 1)不同的標(biāo)記物標(biāo)記，并容許 所述標(biāo)記的鑒定核酸(B)在所有樣點(diǎn)處與至少所述第一探針核酸雜交；測(cè)量在樣點(diǎn)(X 1)上雜交的標(biāo)記的樣品核酸(A 1)的標(biāo)記量值(F 1)；和 測(cè)量在樣點(diǎn)(X 1)上雜交的標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值(Fe 1)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析法，其中容許標(biāo)記的樣品核酸(A 1)進(jìn)行雜交和容許標(biāo)記的鑒定核酸(B)進(jìn)行雜交是同時(shí) 進(jìn)行的，且測(cè)量雜交的標(biāo)記的樣品核酸(A 1)的量和測(cè)量雜交的鑒定核酸(B)的量是同時(shí)進(jìn)行的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分析法，其中固定在樣點(diǎn)(X 1)上的第一探針核酸的量基于標(biāo)記量值(Fe 1)檢測(cè)，且標(biāo)記量值 (F 1)基于檢測(cè)的量來(lái)校正。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的分析法，還包括對(duì)樣點(diǎn)(Χ η)提供與標(biāo)記的樣品核酸(A 1)相同或不同的標(biāo)記的樣品核酸(An)，在所 述樣點(diǎn)(Χ η)上固定有第η探針核酸，所述第η探針核酸具有與固定在樣點(diǎn)(X 1)上的第 一探針核酸基本相同的序列，和容許所述標(biāo)記的樣品核酸(Α η)與固定在樣點(diǎn)(Χ η)上的 第η探針核酸雜交，所述樣點(diǎn)(Χ η)存在于樣點(diǎn)(X 1)的同一個(gè)核酸微陣列或另一個(gè)核酸 微陣列上；對(duì)樣點(diǎn)(Χ η)提供標(biāo)記的鑒定核酸(B)，并容許所述標(biāo)記的鑒定核酸(B)與至少第η探 針核酸雜交；測(cè)量在樣點(diǎn)(Χ η)上雜交的標(biāo)記的樣品核酸(An)的標(biāo)記量值(F η)；和 測(cè)量在樣點(diǎn)(Χ η)上雜交的標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值(Fe η)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分析法，還包括通過(guò)比較標(biāo)記量值(Fe 1)和(Fe η)，計(jì)算樣點(diǎn)(X 1)和樣點(diǎn)(Χ η)處的標(biāo)記量值的系數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的分析法，其中所述標(biāo)記的樣品核酸(A 1)和標(biāo)記的樣品核酸(Α η)通過(guò)標(biāo)記獲自不同樣品的核 酸來(lái)制備。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的分析法，其中在與標(biāo)記化合物混合前，另外將與標(biāo)記的鑒定核酸(B)的同種相同的未標(biāo)記的核 酸加入至標(biāo)記的鑒定核酸(B)的雜交中。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述的分析法，其中與樣點(diǎn)(Χ η)上的標(biāo)記的樣品核酸(Α η)的雜交量相對(duì)應(yīng)的校正的標(biāo)記量值通過(guò) 利用下式(1)來(lái)計(jì)算式(1)；標(biāo)記的樣品核酸(Α η)的校正的標(biāo)記量值=標(biāo)記量值(Fe 1)/標(biāo)記量值( n)x第η標(biāo)記的樣品核酸(Α η)的標(biāo)記量值(F η) (η是2以上的整數(shù))。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的分析法，其中所述標(biāo)記的樣品核酸(A 1)和標(biāo)記的鑒定核酸(B)的至少一種標(biāo)記通過(guò)熒光產(chǎn)生。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的分析法， 其中使用BAC-DNA微陣列作為核酸微陣列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的分析法，其中兩個(gè)或多個(gè)同種樣點(diǎn)(Χ η)存在于不同的核酸微陣列中，且各核酸微陣列之間的 第η探針核酸的排列和第η探針核酸點(diǎn)樣量在各核酸微陣列中不同。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的分析法，其中使用與樣品的核酸不同并具有在第一和第η探針核酸上序列的核酸作為標(biāo)記的 鑒定核酸⑶。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的分析法，其中使用含有重復(fù)序列的核酸作為標(biāo)記的鑒定核酸(B)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的分析法， 其中使用Cot-I DNA作為標(biāo)記的鑒定核酸(B)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的分析法， 其中使用載體來(lái)源的核酸作為標(biāo)記的鑒定核酸(B)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的分析法，其中標(biāo)記量值(F 1)和(Fe 1)中的標(biāo)記量值(Fe 1)由數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)提供。
17.引起計(jì)算機(jī)執(zhí)行用于根據(jù)權(quán)利要求5-16中任一項(xiàng)所述的分析法的過(guò)程的程序，所 述過(guò)程包括基于標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值(Fe 1)和標(biāo)記量值(Fe η)校正第η標(biāo)記的樣品 核酸(An)的標(biāo)記量值(F η) (η是2以上的整數(shù))。
18.計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其存儲(chǔ)有引起計(jì)算機(jī)執(zhí)行用于根據(jù)權(quán)利要求5-16中任一項(xiàng)所述 的分析法的過(guò)程的程序，所述過(guò)程包括基于標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值(Fe 1)和標(biāo)記量值(Fe η)校正第η標(biāo)記的樣品 核酸(Α η)的標(biāo)記量值(F η) (η是2以上的整數(shù))。
19.計(jì)算樣品間基因表達(dá)量或樣品間基因拷貝數(shù)的方法，其通過(guò)利用根據(jù)權(quán)利要求 1-16中任一項(xiàng)所述的分析法進(jìn)行。
20.用于根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的分析法的試劑盒，所述試劑盒包括 核酸微陣列，其具有許多樣點(diǎn)，在每個(gè)樣點(diǎn)上固定有探針核酸；和鑒定核酸，其具有能夠與所述核酸微陣列上全部樣點(diǎn)處探針核酸的至少各自一部分雜 交的序列。
全文摘要
一種借助于核酸微陣列的分析方法，所述核酸微陣列具有在其上固定第一探針核酸的樣點(diǎn)(X 1)，所述方法包括容許待測(cè)樣品的標(biāo)記的樣品核酸(A 1)與第一探針核酸雜交；對(duì)樣點(diǎn)(X 1)提供標(biāo)記的鑒定核酸(B)，所述鑒定核酸(B)具有能夠與第一探針核酸的至少一部分雜交的序列并用與標(biāo)記的樣品核酸(A 1)不同的標(biāo)記物標(biāo)記，并容許所述標(biāo)記的鑒定核酸(B)在所有樣點(diǎn)處與至少所述第一探針核酸雜交；測(cè)量標(biāo)記的樣品核酸(A 1)的標(biāo)記量值(F 1)；和測(cè)量標(biāo)記的鑒定核酸(B)的標(biāo)記量值(Fc 1)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102105597SQ200980128809
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者井本逸勢(shì), 氏原大, 稻澤讓治, 金原秀行 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人東京醫(yī)科齒科大學(xué), 富士膠片株式會(huì)社