專利名稱：糖類的分析裝置及分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法的還原糖的分離分析裝置及使用該裝置的分離分析方法，特別涉及在將經(jīng)柱色譜分離的試樣溶液與堿性氨基酸一起加熱使它們反應(yīng)的加熱器和熒光檢測(cè)器之間的流路上配置背壓發(fā)生器的利用柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法的還原糖的分離分析裝置。
背景技術(shù)：
還原糖的分析法已知如下的方法將包含還原糖的試樣置于使用含硼酸的水性溶液作為流動(dòng)相的液相色譜儀中進(jìn)行洗脫，在流路中，向洗脫液加入含精氨酸等堿性氨基酸的硼酸水溶液，進(jìn)行加熱反應(yīng)后冷卻，向該反應(yīng)液照射激發(fā)光，測(cè)定熒光強(qiáng)度或吸光度(專利文獻(xiàn)I)。其中使用的裝置是將液相色譜儀的流出路延長(zhǎng)，將含堿性氨基酸的硼酸水溶液的供給通路與該流路連接，還裝有加熱裝置、冷卻裝置、激發(fā)光的照射裝置、及熒光強(qiáng) 度等測(cè)定裝置的裝置。在該方法中，必須預(yù)先設(shè)置用于在來(lái)自液相色譜儀的洗脫液加入含堿性氨基酸的硼酸水溶液使其反應(yīng)的供給通路。還有，作為上述方法的改良型已知如下的方法將包含還原糖的試樣置于使用含有硼酸及作為反應(yīng)試劑的精氨酸等堿性氨基酸的流動(dòng)相的液相色譜儀中進(jìn)行洗脫，在流路中，加熱洗脫液使反應(yīng)試劑和還原糖反應(yīng)(加熱反應(yīng))后冷卻，向該反應(yīng)液照射激發(fā)光，測(cè)定熒光強(qiáng)度或吸光度(專利文獻(xiàn)2)。在該方法中，由于液相色譜儀的流動(dòng)相使用含有堿性氨基酸的硼酸水溶液，無(wú)需設(shè)置用于其后在洗脫液中加入含堿性氨基酸的硼酸水溶液的供給通路。這些還原糖分析法被稱為柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法。上述還原糖分析法都是將還原糖在硼酸存在下與精氨酸等堿性氨基酸經(jīng)加熱反應(yīng)生成發(fā)出強(qiáng)熒光的衍生物的機(jī)理利用于從柱洗脫出的還原糖的檢測(cè)(非專利文獻(xiàn)I)。該發(fā)熒光衍生物是呈由還原糖與作為氨基化合物的堿性氨基酸的加熱反應(yīng)(美拉德反應(yīng))產(chǎn)生的褐色的褐色物質(zhì)(黑精，melanoidin)，它如果受到作為激發(fā)光的波長(zhǎng)320nm的光的照射，則放射波長(zhǎng)430nm的光。此外，這些還原糖分析法還利用還原糖具有易與硼酸結(jié)合生成陰離子性絡(luò)離子的性質(zhì)，及該陰離子性絡(luò)離子被保持于陰離子交換柱色譜。柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法中，流動(dòng)相使用含有O. 01 5%濃度的堿性氨基酸和O. 05 O. 5M濃度的硼酸的水溶液(pH7 10)。這時(shí)使用的堿性氨基酸是精氨酸，賴氨酸，組氨酸等。還已知，最近，作為液相色譜的流動(dòng)相，使用由O. IM硼酸緩沖液及O. 4M硼酸緩沖液構(gòu)成的梯度進(jìn)行糖的分離(專利文獻(xiàn)3、4)。柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法中，液相色譜儀中的試樣的洗脫在室溫 70°C的溫度下進(jìn)行，此外加熱反應(yīng)(美拉德反應(yīng))在140 180°C下進(jìn)行(專利文獻(xiàn)2)。由于洗脫和反應(yīng)在這樣的高溫下以高硼酸濃度進(jìn)行，產(chǎn)生由熱引起的流動(dòng)相的膨脹，在流動(dòng)相內(nèi)的對(duì)流等。這些現(xiàn)象在柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法中會(huì)成為由熒光檢測(cè)器檢測(cè)的熒光的噪聲的原因，進(jìn)而成為使檢測(cè)靈敏度降低的原因。因此，利用相同的方法，在進(jìn)行還原糖的分析，特別是其定量分析時(shí)，必須使用專用的軟件修正檢測(cè)結(jié)果。
可用柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法分析的還原糖是與堿性氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)的還原糖，包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、鼠李糖，巖藻糖等單糖類，麥芽糖、麥芽三糖等低聚糖類，氨基葡萄糖、半乳糖胺等氨基糖類，葡萄糖醛酸等糖醛酸類等。作為該方法的分析對(duì)象，可例舉來(lái)自于糖蛋白質(zhì)的糖鏈的還原糖。構(gòu)成糖蛋白質(zhì)的糖鏈的還原糖有甘露糖、半乳糖、巖藻糖等單糖類，半乳糖胺等氨基糖類等。糖鏈有時(shí)還包含甘露糖-6-磷酸(M6P)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I日本專利特開昭58-216953號(hào)公報(bào) 專利文獻(xiàn)2日本專利特開昭61-25059號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3日本專利特開2006-184131號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4日本專利特開2008-245550號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I Mikami H.等，Bunseki Kagaku (分析化學(xué))(1983) 32, E20
發(fā)明內(nèi)容
在上述背景下，本發(fā)明的目的是，除去在柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法中，因加熱、冷卻流路所產(chǎn)生的由熒光檢測(cè)器檢測(cè)的熒光的噪聲，提高檢測(cè)靈敏度。在面向上述目的的研究中，本發(fā)明者嘗試在柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法中，在將經(jīng)柱色譜分離的試樣溶液與堿性氨基酸一起加熱以使它們反應(yīng)的加熱器與熒光檢測(cè)器之間的流路上配置背壓發(fā)生器。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)配置背壓發(fā)生器，可以除去由熒光檢測(cè)器檢測(cè)的熒光的噪聲，可以提高檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明是基于這些發(fā)現(xiàn)完成的。S卩，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案I.還原糖的分離分析裝置，它是試樣溶液中所含的還原糖的使用柱色譜的分離分析裝置，包含陰離子交換樹脂柱用于分離該試樣溶液中所含的還原糖；加熱器用于使來(lái)自該柱的洗脫液中所含的還原糖與堿性氨基酸反應(yīng)；熒光檢測(cè)器向通過(guò)該加熱器反應(yīng)后的該洗脫液連續(xù)地照射激發(fā)光并測(cè)定從該洗脫液放射的熒光的強(qiáng)度；設(shè)置于該加熱器與該熒光檢測(cè)器之間的背壓發(fā)生器。2.上述I的還原糖的分離分析裝置，其中，在該加熱器與該背壓發(fā)生器之間還設(shè)有冷卻裝置。3.使用上述I或2的裝置的還原糖的分離分析方法，該方法包含將含還原糖的試樣溶液負(fù)載于陰離子交換樹脂柱并將足量的含有規(guī)定濃度的硼酸的水溶液即第I流動(dòng)相通過(guò)該柱，藉此清洗柱，以規(guī)定的流速連續(xù)地向該柱供給相較第I流動(dòng)相硼酸或水溶性無(wú)機(jī)鹽的濃度高的硼酸水溶液即第2流動(dòng)相，藉此將還原糖洗脫，將來(lái)自該柱的洗脫液連續(xù)地導(dǎo)入流路中，以規(guī)定速度向該洗脫液中連續(xù)地添加至少I種堿性氨基酸，將該添加后的洗脫液用規(guī)定的時(shí)間通過(guò)該流路的規(guī)定溫度的加熱器內(nèi)，藉此將該混合溶液加熱，將該加熱后的混合溶液通過(guò)背壓發(fā)生器后，記錄該混合溶液的經(jīng)熒光檢測(cè)器測(cè)得的熒光強(qiáng)度。4.使用上述I或2的裝置的還原糖的分離分析方法，該方法包含將含還原糖的試樣溶液負(fù)載于陰離子交換樹脂柱并將足量的含有規(guī)定濃度的至少I種堿性氨基酸和規(guī)定濃度的硼酸的水溶液即第I流動(dòng)相通過(guò)該柱，藉此清洗柱，以規(guī)定的流速連續(xù)地向該柱供給相較第I流動(dòng)相硼酸或水溶性無(wú)機(jī)鹽的濃度高的硼酸水溶液即第2流動(dòng)相，藉此將還原糖洗脫，將來(lái)自該柱的洗脫液連續(xù)地導(dǎo)入流路中，
將該洗脫液用規(guī)定的時(shí)間通過(guò)該流路的規(guī)定溫度的加熱器內(nèi)，藉此將該洗脫液加
執(zhí)，將該加熱后的洗脫液通過(guò)背壓發(fā)生器后，記錄該洗脫液的經(jīng)熒光檢測(cè)器測(cè)得的熒光強(qiáng)度。5.上述3或4的方法，其中，還原糖包含甘露糖-6-磷酸。本發(fā)明通過(guò)在基于柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法的還原糖的分析中除去噪聲，可以提高檢測(cè)靈敏度。因此，通過(guò)本發(fā)明的分離分析裝置或分離分析方法，無(wú)需用專用軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行修正，可以直接使用，不僅簡(jiǎn)便，而且能夠準(zhǔn)確檢測(cè)。


圖I實(shí)施例的裝置的配置及流路的示意圖。圖2表示未設(shè)置背壓發(fā)生器時(shí)的還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果的色譜圖。縱軸表示熒光強(qiáng)度，橫軸表示還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液負(fù)載完成后的經(jīng)過(guò)時(shí)間(分鐘)。a d的峰分別對(duì)應(yīng)a:甘露糖，b:巖藻糖，c:半乳糖，d:M6P。圖3表示設(shè)有背壓發(fā)生器時(shí)的還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果的色譜圖(I)?？v軸、橫軸及a d的峰同上。溶液B的制備所用的水溶性無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉。圖4表示設(shè)有背壓發(fā)生器時(shí)的還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果的色譜圖(2)?？v軸，橫軸及a d的峰同上。溶液B的制備所用的水溶性無(wú)機(jī)鹽為，氯化鈉(Na:虛線)及氯化鉀(K:實(shí)線)。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中，“硼酸水溶液”一詞也包含為了適當(dāng)調(diào)整pH而添加了少量的氫氧化鈉(或硼酸鈉)等這樣的作為PH調(diào)節(jié)劑的堿或堿性鹽的水溶液。在本發(fā)明中，硼酸水溶液的硼酸濃度是指該水溶液中的硼換算成硼酸(H3BO3)時(shí)的濃度。因此，也包含以(硼酸鈉等)鹽的形式添加的硼酸。在本發(fā)明中，柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法的條件也包括上述現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中記載的條件，只要可以分離分析還原糖，可以沒(méi)有特別限定地設(shè)定，例如能夠以表I及表2所示的條件(I法及II法)進(jìn)行。I法中無(wú)機(jī)鹽(氯化鈉)的濃度，II法中硼酸的濃度經(jīng)時(shí)提高。在待分析的還原糖中含有M6P時(shí)，采用表I所示的I法或參照其的方法可以特別良好地分尚分析M6P。
表I柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法的諸條件(I法及II法)
權(quán)利要求
1.還原糖的分離分析裝置，它是試樣溶液中所含的還原糖的使用柱色譜的分離分析裝置，其特征在于，包含陰離子交換樹脂柱用于分離該試樣溶液中所含的還原糖；加熱器用于使來(lái)自該柱的洗脫液中所含的還原糖與堿性氨基酸反應(yīng)；熒光檢測(cè)器向通過(guò)該加熱器反應(yīng)后的該洗脫液連續(xù)地照射激發(fā)光并測(cè)定從該洗脫液放射的熒光的強(qiáng)度；設(shè)置于該加熱器與該熒光檢測(cè)器之間的背壓發(fā)生器。
2.如權(quán)利要求I所述的還原糖的分離分 析裝置，其特征在于，在該加熱器與該背壓發(fā)生器之間還設(shè)有冷卻裝置。
3.使用權(quán)利要求I或2的裝置的還原糖的分離分析方法，其特征在于，該方法包含將含還原糖的試樣溶液負(fù)載于陰離子交換樹脂柱并將足量的含有規(guī)定濃度的硼酸的水溶液即第I流動(dòng)相通過(guò)該柱，藉此清洗柱， 以規(guī)定的流速連續(xù)地向該柱供給相較第I流動(dòng)相硼酸或水溶性無(wú)機(jī)鹽的濃度高的硼酸水溶液即第2流動(dòng)相，藉此將還原糖洗脫， 將來(lái)自該柱的洗脫液連續(xù)地導(dǎo)入流路中， 以規(guī)定速度向該洗脫液中連續(xù)地添加至少I種堿性氨基酸， 將該添加后的洗脫液用規(guī)定的時(shí)間通過(guò)該流路的規(guī)定溫度的加熱器內(nèi)，藉此將該混合溶液加熱， 將該加熱后的混合溶液通過(guò)背壓發(fā)生器，然后， 記錄該混合溶液的經(jīng)熒光檢測(cè)器測(cè)得的熒光強(qiáng)度。
4.使用權(quán)利要求I或2的裝置的還原糖的分離分析方法，其特征在于，該方法包含將含還原糖的試樣溶液負(fù)載于陰離子交換樹脂柱，將足量的含有規(guī)定濃度的至少I種堿性氨基酸和規(guī)定濃度的硼酸的水溶液即第I流動(dòng)相通過(guò)該柱，藉此清洗柱， 以規(guī)定的流速連續(xù)地向該柱供給相較第I流動(dòng)相硼酸或水溶性無(wú)機(jī)鹽的濃度高的硼酸水溶液即第2流動(dòng)相，藉此將還原糖洗脫， 將來(lái)自該柱的洗脫液連續(xù)地導(dǎo)入流路中， 將該洗脫液用規(guī)定的時(shí)間通過(guò)該流路的規(guī)定溫度的加熱器內(nèi)，藉此將該洗脫液加熱， 將該加熱后的洗脫液通過(guò)背壓發(fā)生器后， 記錄該洗脫液的經(jīng)熒光檢測(cè)器測(cè)得的熒光強(qiáng)度。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，還原糖包含甘露糖-6-磷酸。
全文摘要
揭示了使基于柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法的還原糖的分析中提高分析靈敏度的分離方法及分析裝置。該方法是還原糖的使用柱后熒光檢測(cè)-硼酸絡(luò)合物陰離子交換法的分離分析方法，分離分析裝置中，在將經(jīng)柱色譜分離的試樣溶液與堿性氨基酸一起加熱使它們反應(yīng)的加熱器與熒光檢測(cè)器之間的流路上配置背壓發(fā)生器。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102859352SQ20118002111
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者橫山哲雄 申請(qǐng)人:日本化學(xué)研究株式會(huì)社