專利名稱：作為用于識別真菌和酵母種類的診斷目標(biāo)的EIF2γ基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測一種或更多種真菌和酵母種類(species)的核酸引物和探針。更 具體而言，本發(fā)明涉及eIF2Y基因(也稱為EF-2基因)、相應(yīng)的RNA、特異性探針、引物和 與其有關(guān)的寡核苷酸，以及它們在檢測和/或區(qū)分真菌和酵母種類的診斷檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酵母和真菌感染是免疫妥協(xié)患者發(fā)病率和死亡率的主要原因。處于酵母和真菌感 染風(fēng)險中的免疫妥協(xié)患者每年持續(xù)增加，這如同引起疾病的真菌和酵母因子的范圍每年持 續(xù)增加一樣。由真菌感染、尤其是侵襲性真菌感染引起的死亡率在某些風(fēng)險群體中是30% 或更高?？捎玫目拐婢鷦┑年嚾菰谠鲩L；然而，對固有的和新出現(xiàn)的抗真菌藥物抗性的識別 也在增長。這些因素促成了在實驗室檢測中進(jìn)行經(jīng)費控制的增加需求，并已經(jīng)導(dǎo)致檢測程
^ (Iaboratoryconsolidation)。侵襲性真菌感染正在增加。在2003年，估計有900萬的風(fēng)險患者，其中120萬發(fā) 生感染。念珠菌屬菌種(假絲酵母屬菌種，Candida spp.)和曲霉屬菌種(Aspergillus spp.)現(xiàn)被列為感染免疫抑制患者的最主要病原體。尤其地，在泌尿道、呼吸系統(tǒng)和血流 中，在插入支架、導(dǎo)管和整形外科接頭的部位處，感染是常見的。約10%的已知念珠菌屬菌 種已經(jīng)牽涉到人類感染。當(dāng)念珠菌進(jìn)入血流時發(fā)生侵襲性念珠菌病，并且，估計其在美國 以8/100,000人口的頻率發(fā)生，死亡率為40%。白色念珠菌(Candida albicans)是血流 感染的第四種最常見的原因。曲霉病通常始于肺部感染，其在一些患者中可發(fā)展成致命的 侵襲性感染，并具有大于90%的死亡率。新出現(xiàn)的真菌病因子包括鐮刀菌屬(Fusarium)、 絲孢菌屬(Scedosporium)、接合菌(Zygomycetes)禾口毛孢子菌菌禾中(Trichosporon spp.) ("Stakeholder Insight Invasivefungal infections (侵襲j"生真菌感染)，，，Datamonitor， Jan 2004)。免疫妥協(xié)患者，包括移植患者和手術(shù)患者、新生兒、癌癥患者、糖尿病患者和那 些患有HIV/AIDs的患者處于發(fā)生侵襲性真菌感染的高風(fēng)險中(Datamonitorr印ort Stakeholder opinion-Invasive fungal infections,options outweighreplacements(jx 襲性真菌感染，選擇重于取代)2004)。每年有大量嚴(yán)重的膿毒癥病例被報道。盡管其醫(yī) 學(xué)管理有所改進(jìn)，但膿毒癥仍是重癥特別護理醫(yī)學(xué)中最大的挑戰(zhàn)之一。引起膿毒癥的微生 物(細(xì)菌、真菌和酵母)傳統(tǒng)地借助差靈敏性(25-82%)的微生物學(xué)培養(yǎng)方法在醫(yī)院化驗 室中檢測，其非常耗費時間，通常要花費2到5天來完成，并且花費多達(dá)8天來診斷真菌感 染。由酵母或真菌引起的感染的確診通常是基于從臨床樣本中回收并識別特定因子，或者 顯微鏡證明具有獨特形態(tài)學(xué)特征的真菌。然而，存在這些方法不能提供關(guān)于感染因子的結(jié) 論性證據(jù)的眾多情況。在這些情況中，可以應(yīng)用特異性宿主抗體反應(yīng)的檢測，盡管這可再 次被患者的免疫狀態(tài)所影響。在檢測并識別通常由細(xì)菌、酵母或真菌引起的血流感染中， 時間是關(guān)鍵性的。有效處理取決于迅速有效地找到感染源并就抗生素或抗真菌劑做出正 確的決定。只有在病原體被正確識別后，才能開始使用特異性抗生素或抗真菌劑的靶向 治療。許多醫(yī)師希望看到用于酵母和真菌早期診斷的更好的體外擴增和直接檢測診斷技術(shù)的發(fā)展(“Stakeholder Insight Jnvasive fungal infections (侵襲性真菌感染)，，， Datamonitor, Jan 2004)。最近，RocheTM 發(fā)起了基于實時 PCR 的分析(S印tifasttm)，以在 臨床樣品中檢測細(xì)菌、真菌和酵母DNA。因此，明顯需要發(fā)展用于臨床有意義細(xì)菌和真菌病 原體的新穎快速的診斷測試，用于臨床部門中的生物分析應(yīng)用。這已經(jīng)致使本發(fā)明人識別 新的真菌和酵母核酸目標(biāo)以應(yīng)用于核酸診斷(NAD)檢測?；谡婢徒湍负怂岬脑\斷主要集中于核糖體RNA(rRNA)基因、RNA轉(zhuǎn)錄物及其 相關(guān)的DNA/RNA區(qū)域。rRNA基因在所有真菌種類中高度保守，并且它們也含有分歧的和 獨特的基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。核糖體rRNA包含3個基因大亞單位基因(28S)、小亞單位基 因(18S)和5.8S基因。28S和18S rRNA基因被5. 8S rRNA和兩個內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1和 ITS2)分開。由于ITS區(qū)域含有多數(shù)的序列多態(tài)性，許多研究者已經(jīng)將他們的努力集中于此 作為目標(biāo)(Atkins and Clark, 2004) 0 rRNA基因也是多拷貝基因，在真菌基因組中大于10 個拷貝。

許多團隊從事于開發(fā)真菌和酵母感染的新分析。US2004044193涉及白色念珠 菌的轉(zhuǎn)錄因子CaTECl ；其抑制劑，以及診斷和治療與念珠菌屬感染相關(guān)的疾病的方法；也 涉及含有核酸序列、蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞和/或抗體的診斷和藥物組合物，和許多其它方面。 W00183824涉及雜交分析探針和附屬寡核苷酸(accessoryoligonucleotides)，用于檢測 來自白色念珠菌和/或都柏林念珠菌(Candidadubliniensis)的核糖體核酸。US6017699 和US5426026涉及一組DNA引物，其可以用于擴增并形成(speciate) 5個醫(yī)學(xué)上重要的念 珠菌屬種類的DNA。US 6747137公開了有助于診斷念珠菌屬感染的序列。EP 0422872和US 5658726公開了基于18S rRNA基因的探針，而US 5958693公開了基于28S rRNA的探針，用 于診斷一系列酵母和真菌種類。US 6017366描述了基于幾丁質(zhì)合酶基因的序列，用于一系 列念珠菌屬種類的基于核酸的診斷學(xué)。但是清楚的是，需要開發(fā)更快、更精確的診斷方法，尤其是鑒于由現(xiàn)代抗微生物 劑治療引起的選擇壓力，所述抗微生物劑治療產(chǎn)生具有突變基因組序列的抗性有毒菌 株的增加群體。能早期診斷感染的微生物病因的方法使得能夠選擇特定狹窄范圍的抗 生素或抗真菌劑來治療該感染(Datamonitor report Stakeholderopinion-Invasive fungal infections, options outweigh replacements (侵襲性真菌感染，選擇重于取 代),2004 ；Datamonitor report :Stakeholder Opinion-Sepsis, under reactionto an overreaction (膿毒癥，反應(yīng)不足到過度反應(yīng))，2006)。真核起始因子2(eIF2)是由三個亞單位eIF2alpha (eIF2 α )、eIF2beta (eIF2 β ) 和eIF2gamma(eIF2 γ )組成的異源三聚體。eIF2是真核翻譯起始因子2，它是起始tRNA到 核糖體的GTP依賴型輸送所需的異源三聚體G蛋白。eIF2Y亞單位(eif2 γ )具有與原核翻 譯延伸因子EF-Tu相似的氨基酸序列，其作為微生物的分子診斷學(xué)目標(biāo)被授予專利(Alone and Dever,2006 ；Dorris et al. ,1995 ；Erickson et al. ,1996 and 1997)?，F(xiàn)可在NCBI基因庫數(shù)據(jù)庫中獲得171條eIF2 γ的序列，包括3個念珠菌屬菌 種，其包括白色念珠菌的2條注釋的eIF2 γ序列和光滑念珠菌(Candida, glabrata)的一 個假定蛋白——其與白色念珠菌eIF2 γ有78%的同源性；和6條曲霉屬菌種序列，其中3 條注釋為eIF2 γ，和3條假定序列。公布的序列約為1600個堿基對長，其提供適于針對念 珠菌屬和曲霉屬菌種的種類識別的RCP引物和探針設(shè)計的許多序列區(qū)域。對于念珠菌屬，發(fā)明人集中于這樣的eIF2Y基因區(qū)域，其相當(dāng)于白色念珠菌中堿基對(bp)位置718到bp 位置1040。對于曲霉屬，發(fā)明人設(shè)計引物以擴增這樣的eIF2 γ基因區(qū)域，其相當(dāng)于煙曲霉 (Aspergillus fumigatus)中 bp 位置 121 到 bp 位置 374。定義“合成寡核苷酸”指不直接來自基因組DNA或活的生物的2個或更多個核苷酸堿 基的核酸聚合物分子。術(shù)語合成寡核苷酸擬包含已經(jīng)用化學(xué)方法制造的或在體外酶合成的 DNA、RNA 和 DNA/RNA 雜交物?！肮押塑账帷笔蔷哂袃蓚€或更多個共價結(jié)合在一起的核苷酸亞單元的核苷酸聚合 物。寡核苷酸通常為約10到約100個核苷酸。核苷酸亞單元的糖基團可以是核糖、脫氧核 糖，或其改性的衍生物如OMe。核苷酸亞單元可以由如磷酸二酯鍵、修飾的鍵的鍵連接，或由 不阻止寡核苷酸雜交到其互補的目標(biāo)核苷酸序列上的非核苷酸部分連接。修飾的鍵包括這 些鍵，其中標(biāo)準(zhǔn)的磷酸二酯鍵被不同的鍵取代，所述不同的鍵如硫代磷酸酯鍵、甲基磷酸酯 鍵或中性肽鍵。根據(jù)本發(fā)明，含氮堿基類似物也可以是寡核苷酸的組分?！澳繕?biāo)核酸”是包含目標(biāo)核酸序列的核酸?！澳繕?biāo)核酸序列”、“目標(biāo)核苷酸序列”或 “目標(biāo)序列”是可以與互補寡核苷酸雜交的特定脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。“寡核苷酸探針”是具有這樣的核苷酸序列的寡核苷酸，所述核苷酸序列足以與其 目標(biāo)核酸序列互補，以能夠在高度嚴(yán)格雜交條件下形成可檢測的雜交探針目標(biāo)雙鏈體。寡 核苷酸探針是一種分離的化學(xué)物質(zhì)，并可以包括目標(biāo)區(qū)域外面的另外的核苷酸，只要這些 核苷酸不阻止高度嚴(yán)格雜交條件下的雜交。非互補序列，如啟動子序列、限制性內(nèi)切核酸酶 識別位點、或者賦予期望的二級或三級結(jié)構(gòu)如催化活性部位的序列可以被使用，以促進(jìn)使 用發(fā)明探針的檢測。寡核苷酸探針任選地可以標(biāo)記有可檢測部分，如放射性同位素、熒光部 分、化學(xué)發(fā)光劑、納米顆粒部分、酶或配體，它們可以被使用以檢測或確定探針雜交到其目 標(biāo)序列。寡核苷酸探針優(yōu)選地在約10到約100個核苷酸長的大小范圍，盡管探針有可能長 達(dá)約500個核苷酸及多于約500個核苷酸，或者長度小于10個核苷酸?！半s交物”或“雙鏈體”是通過互補堿基之間的Watson-Crick堿基配對或非規(guī)范堿 基配對在兩條單鏈核酸序列之間形成的復(fù)合體。“雜交”是這樣的過程，通過該過程，兩個互 補的核酸鏈聯(lián)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)(“雜交物”或“雙鏈體”)?！罢婢被颉敖湍浮币庵刚婢绲?任何生物，并且優(yōu)選地，關(guān)注于子囊菌(Ascomycota)門的任何生物?！盎パa”是由單鏈DNA或RNA的堿基序列賦予的一種特性，通過各自鏈上的 Watson-Crick堿基對之間的氫鍵，所述單鏈DNA或RNA可以形成雜交物或雙鏈DNA:DNA、 RNA RNA或DNA: RNA。腺嘌呤(A)通常與胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)互補，而鳥嘌呤(G)通 常與胞嘧啶(C)互補。術(shù)語“嚴(yán)格(stringency) ”用于描述在雜交以及隨后的處理步驟過程中存在的溫 度、離子強度和溶劑組成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到“嚴(yán)格”條件可通過單獨或共同改變 那些參數(shù)而變化。在高度嚴(yán)格條件下，只有高度互補核酸雜交物才會形成；沒有足夠程度互 補性的雜交物不會形成。因此，試驗條件的嚴(yán)格性決定了形成雜交物的兩個核酸鏈之間需 要的互補性的量。嚴(yán)格條件被選擇以最大化由目標(biāo)和非目標(biāo)核酸形成的雜交物之間的穩(wěn)定 性差異。在“高度嚴(yán)格”條件下，核酸堿基配對只會發(fā)生在具有高頻率互補堿基序列的核酸片段之間(例如，在“高度嚴(yán)格”條件下的雜交可發(fā)生在具有約85-100%同一性、優(yōu)選約 70-100%同一性的同系物之間)。在中等嚴(yán)格條件下，核酸堿基配對會發(fā)生在具有中間頻率 互補堿基序列的核酸之間(例如，在“中等嚴(yán)格”條件下的雜交可在具有約50-70%同一性 的同系物之間發(fā)生)。因此，“弱”或“低”嚴(yán)格條件常常是來自遺傳上不同的生物的核酸所 要求的，因為互補序列的頻率通常較低。‘高度嚴(yán)格’條件是那些相當(dāng)于這樣的條件，即于42°C下，在由5 X SSPE (43. Sg/ 1(克/升)NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O 禾口 1. 85g/l EDTA，用 NaOH 將 pH 調(diào)至 7. 4)、0· 5% SDS、 5 XDenhardt，s試劑和100 μ g/ml (微克/毫升)變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交， 接下來，于42°C下，在含有0. 1XSSPEU.0% SDS的溶液中洗滌，其時使用約500個核苷酸 長的探針?！爸械葒?yán)格”條件是那些相當(dāng)于這樣的條件，即于42°C下，在由5XSSPE(43.8g/ 1 NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O 和 1. 85g/l EDTA,用 NaOH 將 ρΗ 調(diào)至 7. 4)、0· 5 % SDS、 5 XDenhardt，s試劑和100 μ g/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，接下來，于42°C 下，在含有1. 0XSSPEU. 0% SDS的溶液中洗滌，其時使用約500個核苷酸長的探針?！蛧?yán)格，條件是那些相當(dāng)于這樣的條件，即于42°C下，在由5XSSPE(43.8g/ 1 NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O 禾口 1. 85g/l EDTA,用 NaOH 將 ρΗ 調(diào)至 7. 4)、0. 1 % SDS、 5XDenhardt' s i式劑[每 500ml 的 50XDenhardt' s 含有5g Ficoll (Type 400， Pharamcia)、5g BSA (Fraction V ；Sigma)]和 100 μ g/ml 變性鮭精 DNA 組成的溶液中結(jié)合 或雜交，接下來，于42 °C下，在含有5 X SSPE、0. 1 % SDS的溶液中洗滌，其時使用約500個核 苷酸長的探針。在基于核酸體外擴增的技術(shù)的上下文中，通過使用該體外擴增技術(shù)特定的溫度條 件和離子緩沖條件來實現(xiàn)“嚴(yán)格”。例如，在PCR和實時PCR的上下文中，通過使用特定的溫 度和離子緩沖強度來實現(xiàn)“嚴(yán)格”，以將寡核苷酸引物，而對于實時PCR來說是探針，雜交到 目標(biāo)核酸上，以體外擴增目標(biāo)核酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，本發(fā)明的實質(zhì)上相應(yīng)的探針可以與所提到的序列不 同，并仍與相同的目標(biāo)核酸序列雜交。核酸的這種變異可根據(jù)序列中一致堿基的百分比或 探針與其目標(biāo)序列之間完全互補堿基的百分比來陳述。如果這些百分比是從約100%到約 80%，或者從約10個核苷酸目標(biāo)序列中0堿基錯配到約10個核苷酸目標(biāo)序列中約2個堿 基錯配，那么本發(fā)明的探針實質(zhì)上相應(yīng)于核酸序列。在優(yōu)選的實施方式中，該百分比是從約 100%到約85%。在更優(yōu)選的實施方式中，該百分比是從約90%到約100%;在其它優(yōu)選的 實施方式中，該百分比是從約95%到約100%。通過“充分互補(sufficiently complementary) ”或“實質(zhì)上互補(基本互補， substantially complementary) ”意指核酸具有足夠鄰接互補核苷酸數(shù)量，以在高度嚴(yán)格 雜交條件下形成穩(wěn)定用于檢測的雜交物。實質(zhì)上互補也可以指與給定的參考序列具有至少 90% 同一性至例如 95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 同一性的序列。術(shù)語“同一的”或百分比“同一性”在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中， 指兩個或更多個序列或子序列，如使用BLAST或BLAST 2. 0序列比較算法用以下描述的默 認(rèn)參數(shù)所測定的，或者通過手工比對和目視檢查(參見例如ncbi. ηlm. nih. rov/BLAST/的 NCBI網(wǎng)站或類似物)所測定的，它們是相同的或者具有指定百分比的相同的氨基酸殘基或核苷酸(即，當(dāng)在比較窗口或指明區(qū)域中針對最大相關(guān)性進(jìn)行比較和比對時，在指定區(qū)域 中 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性)。這樣的序 列隨后被稱為“實質(zhì)上同一的”。該定義也指測試序列的評價(compliment)，或者可用于測 試序列的評價。該定義也包括具有缺失和/或插入的序列，以及那些具有置換的序列。如 下所述，優(yōu)選的算法可以解釋空位和類似物。優(yōu)選地，同一性存在于至少約25個氨基酸或 核苷酸長的區(qū)域中，或者更優(yōu)選地，存在于50-100個氨基酸或核苷酸長的區(qū)域中。對于序列比較，通常一條序列作為參考序列，測試序列與所述參考序列相比較。當(dāng) 使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入到計算機中，指定子序列坐標(biāo)，如果需要則指 定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選地，可以使用默認(rèn)程序參數(shù)，或者可以指定可選的參數(shù)。然后， 基于程序參數(shù)，序列比較算法計算測試序列相對于參考序列的序列同一性百分比。如本文所使用的“比較窗口”包括參考選自從20到600、通常約50到約200、更通 常約100到約150的連續(xù)位置數(shù)目中的任何一個的區(qū)段，其中，一個序列可以與該相同數(shù)目 連續(xù)位置的參考序列相比較——在這兩條序列最佳比對之后。比對序列用于比較的方法在 本領(lǐng)域是眾所周知的。用于比較的最佳序列比對可以例如由Smith&Waterman，Adv. App 1. Math. 2 482(1981)的局部同源性算法(localhomology algorithm)、Needleman&Wunsch， J. Mol.Biol.48 443(1970)的同源性比對算法(homology alignment algorithm)、 Pearson&Lipman, Proc. Nat' 1. Acad. Sci· USA 85:2444(1988)的搜索相似性方法(search for similarity method)、這些算法的計算機化執(zhí)行(GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA， Wisconsin Genetics SoftwarePackage 中，Genetics Computer Group,575Science Dr., Madison, WI)進(jìn)行，或者通過手工比對和目視檢查(參見例如，Current Protocols in Molecular Biology (當(dāng)前的分子生物學(xué)方案)(Ausubel et al.，eds. 1987-2005，Wiley Interscience))進(jìn)行。適于確定序列同一性百分比和序列相似性的算法的優(yōu)選例子是BLAST和BLAST 2. O算法，其在Altschul et al. ,Nuc. Acids Res. 25 :3389_3402(1977)和Altschulet al.， J. Mol. Biol. 215 403-410 (1990)中各有描述。使用本文描述的參數(shù)，BLAST和BLAST 2.0 被用于確定本發(fā)明核酸和蛋白質(zhì)的序列同一性百分比。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過美國 國立生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公開獲得。該 算法包括通過識別查詢序列中長度W的短字串來首先識別高分序列對(HSPs)，其在與數(shù)據(jù) 庫序列中相同長度的字串比對時或者匹配、或者滿足一些正賦值的閾值分值T。T是指鄰近 字串分值閾值(Altschul et al.，見上)。這些最初的鄰近字串命中充當(dāng)起始搜索的種子 以找到包含它們的更長的HSPs。字串命中沿每條序列在兩個方向上延伸，直到積累的比對 分值可以增加。對于核苷酸序列，積累分值是使用參數(shù)M(對匹配殘基對的賦分；通常> 0) 和N(對錯配殘基的罰分；通常<0)計算的。對于氨基酸序列，得分矩陣被用于計算累計分 值。當(dāng)積累的比對分值從其最大獲得值下降數(shù)量X時；當(dāng)由于一個或更多個負(fù)得分殘基比 對的積累，累積分值變?yōu)榱慊蛐∮诹銜r；或者當(dāng)達(dá)到任一序列的末端時，每一方向中的字串 命中延伸被停止。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對 于核苷酸序列)使用默認(rèn)的字串長(W) 11、期望值(E)10、M= 5、N = -4和比較兩條鏈。對 于氨基酸序列，BLASTP程序使用默認(rèn)的字串長3和期望值(E) 10，以及BL0SUM62得分矩陣 (參考 Henikoff&HenikofT，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915 (1989))比對(B)50、期望值(E) 10、M = 5、N = _4和比較兩條鏈。“核酸”指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，和其單鏈或雙鏈形式的聚合物，以及其 互補物。該術(shù)語包含含有已知的核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，其是合成 的、自然發(fā)生的以及非自然發(fā)生的，其具有與參考核酸相似的結(jié)合特性，并且其以與參考 核苷酸相似的方式被代謝。這樣的類似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯 (phosphoramidate)、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2_0_甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNAs)?！昂怂犭s交”或“探針目標(biāo)雙鏈體”意為雙鏈、氫鍵結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選為約10到約 100個核苷酸長，更優(yōu)選為14到50個核苷酸長，盡管這將在一定程度上取決于寡核苷酸探 針的總長度。該結(jié)構(gòu)足夠穩(wěn)定，以便通過如化學(xué)發(fā)光或熒光檢測、放射自顯影術(shù)、電化學(xué)分 析或凝膠電泳的手段來檢測。這樣的雜交物包括RNA RNA、RNADNA或DNADNA雙鏈體分 子。"RNA和DNA等價物”指具有相同互補堿基對雜交特性的RNA和DNA分子。RNA和 DNA等價物具有不同的糖基團(即，核糖對脫氧核糖)，并且可以通過尿嘧啶存在于RNA中 和胸腺嘧啶存在于DNA中而不同。RNA和DNA等價物之間的差異不促成實質(zhì)上相應(yīng)的核酸 序列中的差異，因為等價物對特定的序列具有相同程度的互補性?！皟?yōu)先雜交”表示在高度嚴(yán)格雜交條件下，寡核苷酸探針可以與其目標(biāo)核酸雜交以 形成穩(wěn)定的探針目標(biāo)雜交物(因而表明存在目標(biāo)核酸)，而不形成穩(wěn)定的探針非目標(biāo)雜 交物(其將表明存在來自其它生物的非目標(biāo)核酸)。因此，探針以比非目標(biāo)核酸實質(zhì)上更大 的程度雜交到目標(biāo)核酸上，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能正確地檢測這些種類的存在(例如，念 珠菌屬)并將這些種類與其它生物區(qū)分開。優(yōu)先雜交可以使用本領(lǐng)域已知的和本文描述的 技術(shù)來測量?！爸委熢\斷學(xué)”意為使用診斷檢測技術(shù)診斷疾病，選擇正確的治療方案，并監(jiān)控患 者對治療的反應(yīng)。本發(fā)明的治療診斷學(xué)可以基于本發(fā)明的NAD分析在樣品、拭子或從患者 收集的樣本上的使用。發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供序列和/或診斷檢測以檢測并識別一個或更多個酵母 和真菌種類。本發(fā)明人已經(jīng)利用eIF2Y基因序列來設(shè)計對念珠菌屬eIF2 γ基因和曲霉屬 eIF2y基因具有特異性的引物。這樣的引物不僅允許檢測酵母和真菌種類，而且也允許區(qū) 分念珠菌屬和曲霉屬菌種。這比現(xiàn)有技術(shù)有優(yōu)勢，所述優(yōu)勢在于如果想在含有念珠菌屬作 為共生體的樣品中識別真菌病原體，使用通用引物的方法可能不是成功的。很有可能念珠 菌屬在擴增過程中會在競爭中勝過真菌病原體且會被優(yōu)先擴增，導(dǎo)致無法檢測引起疾病的 病原體。本發(fā)明還提供了引物和探針，其允許在不同的念珠菌屬種類之間和在不同的曲霉 屬種類中進(jìn)行辨別。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于檢測并識別酵母和/或真菌種類的診斷試劑盒，其包含至少一 種寡核苷酸探針，所述探針能夠與至少部分eIF2 γ基因或其相應(yīng)mRNA結(jié)合。該寡核苷酸 探針可以具有與部分eIF2Y基因或其相應(yīng)mRNA實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補的序列。因此， 它能夠與互補DNA或RNA分子結(jié)合或雜交。eIF2Y基因可以是真菌eIF2Y基因。eIF2 γ 基因可以是酵母eIF2Y基因。核酸分子可以是合成的。
eIF2 γ基因的所述部分可以與白色念珠菌eIF2 γ基因的堿基對位置718到1040 的基因區(qū)域的一部分相當(dāng)。eIF2Y基因的所述部分可以與白色念珠菌eIF2 γ基因的堿基 對位置790到934的基因區(qū)域的一部分相當(dāng)。eIF2Y基因的所述部分可以與光滑念珠菌 eIF2y基因的堿基對位置872到972的基因區(qū)域的一部分相當(dāng)。eIF2 γ基因的所述部分 可以與近平滑念珠菌(C. parapsilosis)eIF2 γ基因的堿基對位置151到274的基因區(qū)域 的一部分相當(dāng)。eIF2Y基因的所述部分可以與熱帶念珠菌(C.tropicaliS)eIF2Y基因的 堿基對位置140到270的基因區(qū)域的一部分相當(dāng)。eIF2 γ基因的所述部分可以與克柔念珠 菌(C. krusei)eIF2 γ基因的堿基對位置115到224的基因區(qū)域的一部分相當(dāng)。eIF2 γ基 因的所述部分可以與煙曲霉(A. fumigatus)eIF2 γ基因的堿基對位置121到374的基因區(qū) 域的一部分相當(dāng)。eIF2Y基因的所述部分可以與煙曲霉eIF2 γ基因的堿基對位置164到 261的基因區(qū)域的一部分相當(dāng)。eIF2Y基因的所述部分可以與黃曲霉(A. flavus) eIF2 γ 基因的堿基對位置155到252的基因區(qū)域的一部分相當(dāng)。eIF2 γ基因的所述部分可以與黑 曲霉(A.niger)eIF2Y基因的堿基對位置92到189的基因區(qū)域的一部分相當(dāng)。eIF2 γ基 因的所述部分可以與土曲霉(A. terreus)eIF2 γ基因的堿基對位置149到246的基因區(qū)域 的一部分相當(dāng)。技術(shù)人員會理解，與這些區(qū)域相當(dāng)?shù)男蛄锌梢栽谄渌镏姓业?，但不一?是在相同的位置。寡核苷酸探針可具有SEQ ID NO 1、2、84、85、86、87、88、108、109、110、111、125 或
138的序列，或者也可以充當(dāng)eIF2 γ基因的探針的與這些序列實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補的 序列。試劑盒可以含有多于一種這樣的探針。具體地說，試劑盒可以包含多數(shù)這樣的探 針。此外，試劑盒可以包含用于其它生物，例如，如細(xì)菌種類或病毒的另外的探針。試劑盒還可以包括至少一種引物，用于擴增至少部分eIF2 γ基因。適當(dāng)?shù)兀噭?盒可以包括至少一種正向體外擴增引物和/或至少一種反向體外擴增引物，所述正向擴增 引物具有選自包括 SEQ ID NO 3、5、89、91、93、95、97、104、105、112、113、114、115、116、117、 118、119、120、135或136的序列，或者也可以充當(dāng)eIF2 γ基因的正向擴增引物的與它們實 質(zhì)上同源或互補的序列，和/或所述反向擴增引物具有選自包括SEQ ID NO 4、6、90、92、94、 96、98、106、107、121、122、123、124或137的序列，或者也可以充當(dāng)eIF2 γ基因的反向擴增 引物的與它們實質(zhì)上同源或互補的序列。用于檢測念珠菌屬eIF2 γ多核苷酸的試劑盒包括至少一種寡核苷酸探針，其選 自包括 SEQ ID NOs :1、84、85、86、87、88 或 138 的集合，或者其與與被 SEQ IDNOs :1、84、85、 86、87、88或138優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交。試劑盒還可以包括 至少一種正向引物，其選自包括SEQ ID NOs :5、89、91、93、95、97、135或136的集合，或者其 與與被SEQ ID NOs :5、89、91、93、95、97、135或136優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序 列優(yōu)先雜交；和/或反向引物，其選自包括SEQ ID NOs :6、90、92、94、96、98、137的集合，或 者其與與被SEQ ID NOs :6、90、92、94、96、98或137優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序 列優(yōu)先雜交。用于檢測或識別白色念珠菌eIF2 γ多核苷酸的試劑盒包括至少一種寡核苷酸 探針，其選自包括SEQ ID NO :1、84或138的集合，或者其與與被SEQ ID N0:l、84或138優(yōu) 先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；而且還包括至少一種正向引物，其選自包括SEQ ID NO :5、89、135或136的集合，或者其與與被SEQ ID NO :5、89、135或136優(yōu)先 雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；和/或至少一種反向引物，其選自包括SEQ ID NO :6、90或137的集合，或者其與與被SEQ ID NO :6、90或137優(yōu)先雜交的核苷酸序列 相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交。用于檢測或識別光滑念珠菌eIF2 γ多核苷酸的試劑盒包括至少一種寡核苷酸 探針，其選自包括SEQ ID NO :85的集合，或者其與與被SEQ ID NO :85優(yōu)先雜交的核苷酸序 列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；而且還包括至少一種正向引物，其選自包括SEQ ID Ν0:91 的集合，或者其與與被SEQ ID NO :91優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交； 和/或至少一種反向引物，其選自包括SEQ IDNO :92的集合，或者其與與被SEQ ID NO 92 優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交。用于檢測或識別近平滑念珠菌eIF2 γ多核苷酸的試劑盒包括至少一種寡核苷 酸探針，其選自包括SEQ ID NO :86的集合，或者其與與被SEQ ID NO :86優(yōu)先雜交的核苷酸 序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；而且還包括至少一種正向引物，其選自包括SEQ ID NO 93的集合，或者其與與被SEQ ID NO :93優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜 交；和/或至少一種反向引物，其選自包括SEQID NO :94的集合，或者其與與被SEQ ID NO 94優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交。用于檢測或識別熱帶念珠菌eIF2 γ多核苷酸的試劑盒包括至少一種寡核苷酸 探針，其選自包括SEQ ID NO :87的集合，或者其與與被SEQ ID NO :87優(yōu)先雜交的核苷酸序 列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；而且還包括至少一種正向引物，其選自包括SEQ ID Ν0:95 的集合，或者其與與被SEQ ID NO :95優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交； 和/或至少一種反向引物，其選自包括SEQ IDNO :96的集合，或者其與與被SEQ ID NO 96 優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交。用于檢測或識別克柔念珠菌eIF2 γ多核苷酸的試劑盒包括至少一種寡核苷酸 探針，其選自包括SEQ ID NO 88的集合，或者其與與被SEQ ID NO 88優(yōu)先雜交的核苷酸 序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；而且還包括至少一種正向引物，其選自包括ID NO 97的 集合，或者其與與被SEQ ID NO :97優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；和 /或至少一種反向引物，其選自包括SEQ ID NO :98的集合，或者其與與被SEQ ID Ν0:98優(yōu) 先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交。用于檢測或識別曲霉屬eIF2 γ多核苷酸的診斷試劑盒包括至少一種寡核苷酸探 針，其選自包括SEQ ID NOs :2、108、109、110、111或125的集合，或者其與與被SEQ ID NOs 2、108、109、110、111或125優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交。該試劑盒 還可以包括至少一種正向引物，其選自包括SEQ ID NOs :3、104、105、112、113、114、115、 116、117、118、119 或 120 的集合，或者其與與被 SEQ ID NOs :3、104、105、112、113、114、115、 116、117、118、119或120優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；和/或至少 一種反向引物，其選自包括SEQ ID N0s:4、106、107、121、122、123或124的集合，或者其與 與被SEQ ID NOs :4、106、107、121、122、123或124優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序 列優(yōu)先雜交。用于檢測或識別煙曲霉eIF2 γ多核苷酸的試劑盒包括至少一種寡核苷酸探針， 其選自包括SEQ ID NO :2、111或125的集合，或者其與與被SEQ ID NO :2、111或125優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；而且還包括至少一種正向引物，其選自包 括 SEQ ID NO :3、112、113、115、117、119 或 120 的集合，或者其與與被 SEQ ID N0:3、112、
113、115、117、119或120優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；和/或至少 一種反向引物，其選自包括SEQ ID NO :4、106、121、123、124的集合，或者其與與被SEQ ID NO :4、106、121、123、124優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交。用于檢測或識別黃曲霉eIF2 γ多核苷酸的試劑盒包括至少一種寡核苷酸探針， 其選自包括SEQ ID NO: 110的集合，或者其與與被SEQ ID NO 110優(yōu)先雜交的核苷酸序列 相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；而且還包括至少一種正向引物，其選自包括SEQ ID NO 104 或114的集合，或者其與與被SEQ ID NO :104或114優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸 序列優(yōu)先雜交；和/或至少一種反向引物，其選自包括SEQ ID NO: 106、122或123的集合，
或者其與與被SEQ ID NO :106、122或123優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜 、-父。用于檢測或識別黑曲霉eIF2 γ多核苷酸的試劑盒包括至少一種寡核苷酸探針， 其選自包括SEQ ID NO: 108的集合，或者其與與被SEQ ID NO 108優(yōu)先雜交的核苷酸序列 相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；而且還包括至少一種正向引物，其選自包括SEQ ID NO 104,
114、116的集合，或者其與與被SEQID NO :104、114、116優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核 苷酸序列優(yōu)先雜交；和/或至少一種反向引物，其選自包括SEQ ID N0:107、122、123的集 合，或者其與與被SEQ ID N0:107、122、123優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先 雜交。用于檢測或識別土曲霉eIF2 γ多核苷酸的試劑盒包括至少一種寡核苷酸探針， 其選自包括SEQ ID Ν0:109的集合，或者其與與被SEQ ID NO 109優(yōu)先雜交的核苷酸序列 相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交；而且還包括至少一種正向引物，其選自包括SEQ ID N0:105、
115、118的集合，或者其與與被SEQID NO 105、115、118優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核 苷酸序列優(yōu)先雜交；和/或至少一種反向引物，其選自包括SEQ ID N0:107、122或123的集 合，或者其與與被SEQ ID NO :107、122或123優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu) 先雜交。被識別的序列不僅適于基于體外DNA/RNA擴增的檢測系統(tǒng)，也適于基于信號擴增 (信號放大)的檢測系統(tǒng)。此外，被鑒定為合適目標(biāo)的本發(fā)明序列提供了下列優(yōu)勢在一些 區(qū)域中具有顯著的基因內(nèi)序列異質(zhì)性，這是有利的，并使本發(fā)明的方面能夠關(guān)注于類群或 種類特異性目標(biāo)；而且在一些區(qū)域中也具有顯著的序列同質(zhì)性，這使本發(fā)明的方面能夠關(guān) 注于屬特異性酵母和真菌引物以及探針，以用于直接核酸檢測技術(shù)、信號擴增核酸檢測技 術(shù)以及核酸體外擴增技術(shù)而用于酵母和真菌診斷學(xué)。eIF2 γ序列在診斷檢測中允許多檢測 性能和自動操作。本發(fā)明序列的優(yōu)勢之一是近緣酵母和真菌種類之間的基因內(nèi)eIF2 γ核苷酸序列 多樣性使用于診斷學(xué)分析以檢測酵母和真菌的特異性引物和探針能夠被設(shè)計。eIF2 γ核苷 酸序列——既有DNA也有RNA——均可與直接檢測、信號擴增檢測和體外擴增技術(shù)一起用 于診斷學(xué)分析。eIF2Y序列在診斷檢測中允許多檢測性能和自動操作。試劑盒還可以包括用于擴增至少部分eIF2 γ基因的至少一種引物。適當(dāng)?shù)?，試?盒包括部分eIF2Y基因的正向和反向引物。
eIF2 γ基因的所述部分可以與白色念珠菌中eIF2 γ基因的堿基對位置718到堿 基對位置1040的基因區(qū)域的一部分相當(dāng)。尤其優(yōu)選的是這樣的試劑盒，其含有用于部分 eIF2y白色念珠菌基因的探針，和/或用于相當(dāng)于白色念珠菌中eIF2 γ基因的堿基對位 置718到堿基對位置1040的基因區(qū)域的一部分的探針。相當(dāng)于堿基對位置718到堿基對 位置1040的序列可以在其它生物中找到，但不一定在相同的位置。eIF2 γ基因的所述部分可以與煙曲霉中堿基對位置121到堿基對位置374的基因 區(qū)域的一部分相當(dāng)。尤其優(yōu)選的是這樣的試劑盒，其含有用于部分eIF2 γ煙曲霉基因的探 針，和/或用于相當(dāng)于煙曲霉中堿基對位置121到堿基對位置374的基因區(qū)域的一部分的 探針。相當(dāng)于堿基對位置121到堿基對位置374的序列可以在其它生物中找到，但不一定 在相同的位置。試劑盒還可以包含另外的引物或探針。引物可以具有選自從SEQ ID NO 3 到SEQ ID NO 6的序列，或者具有與這些序列實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補的序列，所述序列也 可以充當(dāng)eIF2Y基因的引物。試劑盒可以包括至少一種正向體外擴增引物和至少一種反向體外擴增引物，正向 擴增引物具有選自SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5的序列，或者也可以充當(dāng)eIF2 γ基因的正 向擴增引物的與它們實質(zhì)上同源或互補的序列，而反向擴增引物具有選自SEQ ID NO 4或 SEQ ID NO 6的序列，或者也可以充當(dāng)eIF2 γ基因的反向擴增引物的與它們實質(zhì)上同源或 互補的序列。診斷試劑盒可以基于直接核酸檢測技術(shù)、信號擴增核酸檢測技術(shù)，而核酸體外擴 增技術(shù)選自下列一種或更多種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、基于核酸 序列的擴增(NASBA)、鏈置換擴增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、分支DNA技術(shù)(bDNA)以及 滾環(huán)擴增技術(shù)(RCAT)，或其它體外酶擴增技術(shù)。本發(fā)明也提供了核酸分子，其選自SEQ ID NO. 1到SEQ ID NO. 135、優(yōu)選為從SEQ ID NO. 1到74和從SEQ ID NO. 84到135，以及與其實質(zhì)上同源、或與其部分實質(zhì)上互補并在 基于eIF2Y基因的診斷學(xué)中具有功能的序列。核酸分子可以含有這樣的寡核苷酸，其具有 與 SEQ ID NO. 1 到 SEQ ID N0. 135、優(yōu)選為從 SEQ IDN0. 1 到 74 和從 SEQ ID N0. 84 到 135 的核酸分子的一部分實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補的序列。本發(fā)明也提供了檢測檢測樣品中的 目標(biāo)生物的方法，其包括以下步驟(i)在適當(dāng)?shù)臈l件下，將檢測樣品與至少一種如上所定義的寡核苷酸探針混合； 和(ii)在高度嚴(yán)格條件下，將可能存在于檢測樣品中的任何核酸與寡核苷酸雜交， 形成探針目標(biāo)雙鏈體；和(iii)確定探針目標(biāo)雙鏈體是否存在；雙鏈體的存在明確(positively)識別出 檢測樣品中目標(biāo)生物的存在。本發(fā)明的核酸分子和試劑盒可以用于診斷檢測，以檢測一種或更多種酵母和/或 真菌種類的存在、測量患者中的酵母和/或真菌滴度，或者用于評估被設(shè)計以減少患者中 的酵母和/或真菌滴度的治療方案的功效的方法中，或者用于測量環(huán)境中的酵母和/或真 菌污染物。環(huán)境可以是醫(yī)院，或者其可以是食物樣品，環(huán)境樣品例如水，工業(yè)樣品，如需要生 物負(fù)載或質(zhì)量評估的加工中樣品或終產(chǎn)品。本發(fā)明的試劑盒和核酸分子可以用于識別和/或表征一種或更多種破壞劑(disruptive agent)，所述破壞劑可以用于破壞eIF2 γ基因功能。破壞劑可以選自反義 RNA、PNA 和 siRNA。在本發(fā)明的一些實施方式中，含有種類特異性探針的核酸分子可以用于在相同屬 的種之間進(jìn)行區(qū)分。本發(fā)明的寡核苷酸可以在用于檢測酵母和真菌目標(biāo)生物的核酸的組合物中被提 供。適應(yīng)于組合物的意圖用途，這樣的組合物也可以包含緩沖液、酶、去污劑、鹽等。也考慮 的是，本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法盡管在本文中被描述為含有至少一種合成寡核苷酸， 其也可以含有具有與該合成核苷酸片段實質(zhì)上相同的序列的天然寡核苷酸，所述天然寡核 苷酸替代合成寡核苷酸或在合成寡核苷酸旁邊。本發(fā)明也提供目標(biāo)酵母和/或真菌生物的體外擴增診斷試劑盒，其包含至少一種 正向體外擴增引物和至少一種反向體外擴增引物，正向擴增引物選自也可以充當(dāng)正向擴增 引物的與其實質(zhì)上同源或互補的一條或更多條序列，而反向擴增引物選自也可以充當(dāng)反向 擴增引物的與其實質(zhì)上同源或互補的一條或更多條序列。本發(fā)明也提供用于檢測候選酵母和/或真菌種類的存在的診斷試劑盒，其包含一 條或更多條DNA探針，所述探針含有與候選酵母和/或真菌種類的eIF2 γ基因序列實質(zhì)上 互補或?qū)嵸|(zhì)上同源的序列。本發(fā)明也提供一條或更多條合成寡核苷酸，其具有與下列集合 中的一個或更多個實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補的核苷酸序列eIF2 γ基因或其mRNA轉(zhuǎn)錄物； 酵母和/或真菌eIF2Y基因或其mRNA轉(zhuǎn)錄物；酵母eIF2Y基因或其mRNA轉(zhuǎn)錄物；SEQ ID NO I-SEQ ID NO 135、優(yōu)選為從 SEQ IDN0. 1 到 74 和從 SEQ ID NO. 84 到 135 中的一個或更 多個。核苷酸可以包括DNA。核苷酸可以包括RNA。核苷酸可以包括DNA、RNA和PNA的 混合物。核苷酸可以包括合成核苷酸。本發(fā)明的序列(以及與本發(fā)明的方法、試劑盒、組合 物和分析有關(guān)的序列)可以被選擇，以便與eIF2 γ基因編碼區(qū)的一部分實質(zhì)上同源?；?可以是來自目標(biāo)酵母或真菌生物的基因。本發(fā)明的序列優(yōu)選為足夠的，以便能夠?qū)υ撔蛄?部分形成探針目標(biāo)雙鏈體。本發(fā)明也提供目標(biāo)酵母或真菌生物的診斷試劑盒，其含有寡核苷酸探針，所述探 針與本發(fā)明的寡核苷酸(其可以是合成的)實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補。應(yīng)該理解，適合用作 體外擴增引物的序列也可以適合用作寡核苷酸探針，盡管優(yōu)選擴增引物可以具有約15個 核苷酸到約30個核苷酸(更優(yōu)選為約15到約23、最優(yōu)選為約20到約23)之間的互補部 分，本發(fā)明的寡核苷酸探針可以是任何適合的長度。技術(shù)人員應(yīng)該理解，取決于選擇的寡核 苷酸探針的長度、性質(zhì)和結(jié)構(gòu)(例如，用于LightCycler的雜交探針對、Taqman 5’外切核 酸酶探針、發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)等)以及序列，將要求不同的雜交和/或退火條件。本發(fā)明的試劑盒和分析也可以被這樣提供，其中，寡核苷酸探針被固定于表面上。 這樣的表面可以是珠子、膜、柱、浸染棒(dipstick)、納米顆粒、反應(yīng)室的內(nèi)表面，如診斷平 板的孔或反應(yīng)管的內(nèi)部、毛細(xì)管或管(vessel)或類似物。目標(biāo)酵母或真菌生物可以選自白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑 念珠菌、熱帶念珠菌、都柏林念珠菌、吉利蒙念珠菌(C. guilliermondii)、挪威念珠菌 (C. norvegiensis)、無名念珠菌(C. famata)、C. haemuloni、乳酒念珠菌(C. kefyr)、產(chǎn)朊念 珠菌(C. utilis)、維斯念珠菌(C. viswanathii)、葡萄牙念珠菌(C. Iusitaniae)和西弗念珠菌(C. cifferii)、煙曲霉、費希新薩托菌(N. fischeri)、棒曲霉(A. clavatus)、黑曲霉、 土曲霉、黃曲霉、雜色曲霉(A. versicolor)和構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)。目標(biāo)酵母生物可以是針對已經(jīng)被試驗證明了的給定引物組的念珠菌屬種類，并且 更優(yōu)選地，選自白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌和熱 帶念珠菌、吉利蒙念珠菌、挪威念珠菌、無名念珠菌、C. haemuloni、乳酒念珠菌、產(chǎn)朊念珠 菌、維斯念珠菌、葡萄牙念珠菌和西弗念珠菌。在這些情況下，本發(fā)明的擴增引物和寡核苷酸探針可以針對基因特異性或?qū)偬禺?性區(qū)域來設(shè)計，以便能夠鑒定目標(biāo)酵母生物群體中的一個或更多個、或大部分、或幾乎全部 的期望生物。目標(biāo)真菌生物可以是針對已經(jīng)被試驗證明了的給定引物組的曲霉屬種類，并且更 優(yōu)選地，選自煙曲霉、費希新薩托菌、棒曲霉、黑曲霉、土曲霉、黃曲霉、雜色曲霉和構(gòu)巢曲
毒ο檢測樣品可以包括目標(biāo)酵母和/或真菌生物的細(xì)胞。方法也可包括從可能存在于 所述檢測樣品中的目標(biāo)酵母或真菌生物的任何細(xì)胞中釋放核酸的步驟。理想的是，檢測樣 品是從患者中獲得的樣品(如拭子或血液、尿、唾液、支氣管灌洗液、牙齒樣本、皮膚樣本、 頭皮樣本、移植器官活組織檢查、糞便、粘液或排出物樣品)的溶解產(chǎn)物。檢測樣品可以是 食物樣品、水樣品、環(huán)境樣品、終產(chǎn)物、終產(chǎn)品或加工中的工業(yè)樣品。本發(fā)明也提供了SEQ ID NO. 1 到 SEQ ID NO. 135、優(yōu)選為 SEQ ID NO. 1 到 74和 SEQ ID N0. 84到135中任一種在一種或更多種酵母或真菌種類的存在情況的診斷檢測中的應(yīng) 用。所述種類可以選自白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、 都柏林念珠菌、吉利蒙念珠菌、挪威念珠菌、無名念珠菌、C. haemuloni、乳酒念珠菌、產(chǎn)朊念 珠菌、維斯念珠菌、葡萄牙念珠菌、西弗念珠菌、煙曲霉、費希新薩托菌、棒曲霉、黑曲霉、土 曲霉、黃曲霉、雜色曲霉和構(gòu)巢曲霉。本發(fā)明也提供用于治療診斷學(xué)、食品安全診斷學(xué)、工業(yè)微生物診斷學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、 獸醫(yī)診斷學(xué)、生物恐怖主義診斷學(xué)的試劑盒，其含有一種或更多種本發(fā)明的合成寡核苷酸。 該試劑盒也可以包含選自下列的一種或更多種物品合適的樣品收集儀器、試劑容器、緩沖 液、標(biāo)記部分、溶液、去污劑和補充溶液。本發(fā)明也提供本發(fā)明的序列、組合物、核苷酸片段、 分析和試劑盒在臨床診斷學(xué)、治療診斷學(xué)、食品安全診斷學(xué)、工業(yè)微生物診斷學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、 獸醫(yī)診斷學(xué)、生物恐怖主義診斷學(xué)中的應(yīng)用。核酸分子、組合物、試劑盒或方法可以用于基于診斷核酸的分析中，以便檢測酵母 和/或真菌種類。核酸分子、組合物、試劑盒或方法可以用于診斷分析中，以檢測患者中的酵母和/ 或真菌滴度。滴度可以在體外測量。核酸分子、組合物、試劑盒或方法可以用于評估被設(shè)計以減少患者中酵母和/或 真菌滴度的治療方案的功效的方法中，其包括評估在治療方案的一個或更多個關(guān)鍵時期患 者中的酵母和/或真菌滴度(通過體內(nèi)方法或體外方法)。適當(dāng)?shù)年P(guān)鍵時期可以包括治 療前、治療過程中和治療后。治療方案可以包含抗真菌劑，如藥物。核酸分子、組合物、試劑盒或方法可以用于診斷分析中，以測量潛在的酵母和/或 真菌污染物，例如，在醫(yī)院中。
核酸分子、組合物、試劑盒或方法可以用于識別和/或表征一種或更多種破壞劑， 所述破壞劑可以用于破壞eIF2 γ基因功能。合適的破壞劑可以選自反義RNA、PNA、siRNA。本發(fā)明現(xiàn)將參考附圖進(jìn)行描述。應(yīng)該理解，下列詳細(xì)描述和附圖僅是示范性的和 說明性的，并且意圖提供如要求保護的本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不意圖以任何方式限制本 發(fā)明的范圍。附圖簡述

圖1 白色念珠菌(XM_715569. l)eIF2y中的引物結(jié)合部位(灰色突出部分)和 探針(粗體部分)。感興趣的擴增區(qū)域加有下劃線。(感興趣區(qū)域的位置718-1040)。圖2 煙曲霉(XM_746974. 2)eIF2Y中的引物結(jié)合部位(灰色突出部分)和探針 (粗體部分)。感興趣的擴增區(qū)域加有下劃線。(感興趣區(qū)域的位置121-374)。圖3 用TaqMan探針Pl_CaneIF2、基于eIF2Y基因的白色念珠菌實時PCR分析的 擴增圖。用來自4個其它念珠菌屬種類和煙曲霉的一組DNA來檢測分析的特異性。被測試 的3個白色念珠菌菌株被檢測到，并且沒有發(fā)現(xiàn)與來自其它念珠菌屬種類和煙曲霉的DNA 的交叉反應(yīng)。圖4 用TaqMan探針Pl_AspeIF2、基于eIF2 γ基因的煙曲霉實時PCR分析的擴 增圖。針對來自6個近緣曲霉屬種類和白色念珠菌的一組DNA來檢測分析的特異性。3個 煙曲霉菌株被檢測到，并且沒有發(fā)現(xiàn)與來自其它曲霉屬菌種和白色念珠菌的DNA的交叉反應(yīng)。圖5 (SEQ ID NO 99)白色念珠菌(XM_715569. l)eIF2 γ中的引物結(jié)合部位(灰 色突出部分)和探針(粗體部分)。感興趣的擴增區(qū)域加有下劃線。(感興趣區(qū)域的位置 664-1040)。圖6 :(SEQ ID NO 100)光滑念珠菌(XM_447610. l)eIF2y中的引物結(jié)合部位(灰 色突出部分)和探針(粗體部分)。感興趣的擴增區(qū)域加有下劃線。(感興趣區(qū)域的位置 872-972)。圖7 (SEQ ID NO 101)近平滑念珠菌(CBS 604生成的序列)eIF2 γ中的引物結(jié) 合部位(灰色突出部分)和探針(粗體部分)。感興趣的擴增區(qū)域加有下劃線。(感興趣 區(qū)域的位置151-274)。圖8 (SEQ ID NO 102)熱帶念珠菌(CBS 94生成的序列)eIF2 γ中的引物結(jié)合部 位(灰色突出部分)和探針(粗體部分)。感興趣的擴增區(qū)域加有下劃線。(感興趣區(qū)域 的位置140-270)圖9 (SEQ ID NO 103)克柔念珠菌(CBS 573生成的序列)eIF2 γ中的引物結(jié)合 部位(灰色突出部分)和探針(粗體部分)。感興趣的擴增區(qū)域加有下劃線。(感興趣區(qū) 域的位置115-224)。圖10 用TaqMan探針ALEF2、基于eIF2Y基因的白色念珠菌實時PCR分析的擴 增圖。用來自14個白色念珠菌菌株和19個其它念珠菌屬種類的一組DNA來檢測分析的 特異性。(a)被測試的14個白色念珠菌菌株被檢測到。(b)沒有發(fā)現(xiàn)與來自19個其它念 珠菌屬種類的DNA的交叉反應(yīng)。信號僅在(+)對照中獲得。(c)用來自白色念珠菌的模 板DNA的各種供給(input)來測試分析的靈敏性。發(fā)現(xiàn)分析的LOD在1_5細(xì)胞當(dāng)量(cell equivalent)之間。
圖11 用TaqMan探針GlabA、基于eIF2Y基因的光滑念珠菌實時PCR分析 的擴增圖。用來自10個光滑念珠菌菌株、19個其它念珠菌屬種類、煙曲霉和釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的一組DNA來檢測分析的特異性。(a) 10個被測試的光滑念 珠菌菌株被檢測到。(b)沒有發(fā)現(xiàn)與來自19個其它念珠菌屬種類的DNA、或與煙曲霉或釀 酒酵母的交叉反應(yīng)。信號僅在(+)對照中獲得。(c)發(fā)現(xiàn)分析的LOD為約2細(xì)胞當(dāng)量。圖12 用TaqMan探針ParA、基于eIF2 γ基因的近平滑念珠菌實時PCR分析的擴 增圖。用來自12個近平滑念珠菌菌株、19個其它念珠菌屬種類、煙曲霉和釀酒酵母的一組 DNA來檢測分析的特異性。(a)被測試的12個近平滑念珠菌菌株被檢測到。(b)沒有發(fā)現(xiàn) 與來自其它19個念珠菌屬種類的DNA、或與煙曲霉或釀酒酵母的交叉反應(yīng)。信號僅在(+) 對照中獲得。(c)發(fā)現(xiàn)分析的LOD為約10細(xì)胞當(dāng)量。圖13 用TaqMan探針TropicA、基于eIF2Y基因的熱帶念珠菌實時PCR分析的 擴增圖。用來自12個熱帶念珠菌菌株、19個其它念珠菌屬種類、煙曲霉和釀酒酵母的一組 DNA來檢測分析的特異性。(a)被測試的12個熱帶念珠菌菌株被檢測到。(b)沒有發(fā)現(xiàn)與 來自其它19個念珠菌屬種類的DNA、或與煙曲霉或釀酒酵母的交叉反應(yīng)。信號僅在(+)對 照中獲得。(c)發(fā)現(xiàn)分析的LOD為約20細(xì)胞當(dāng)量。圖14 用taqMan探針KrusA、基于eIF2 γ基因的克柔念珠菌實時PCR分析的擴增 圖。用來自9個克柔念珠菌菌株、19個其它念珠菌屬種類、煙曲霉和釀酒酵母的一組DNA來 檢測分析的特異性。(a)被測試的9個克柔念珠菌菌株被檢測到。(b)沒有發(fā)現(xiàn)與來自其 它19個念珠菌屬種類的DNA、或與煙曲霉或釀酒酵母的交叉反應(yīng)。信號僅在(+)對照中獲 得。(c)發(fā)現(xiàn)分析的LOD為約2細(xì)胞當(dāng)量。圖15 (SEQ ID NO 50)煙曲霉(7273生成的序列)eIF2 γ中的引物結(jié)合部位(灰 色突出部分)和探針(粗體部分)。感興趣的擴增區(qū)域加有下劃線。(相應(yīng)于公開序列的 堿基對位置164-261)。圖16: (SEQ ID NO 122)黃曲霉(117. 62生成的序列)eIF2 γ中的引物結(jié)合部位 (灰色突出部分)和探針(粗體部分)。感興趣的擴增區(qū)域加有下劃線。(相應(yīng)于公開序列 的堿基對位置155-252)。圖17 (SEQ ID NO 58)黑曲霉(6727生成的序列)eIF2 γ中的引物結(jié)合部位(灰 色突出部分)和探針(粗體部分)。感興趣的擴增區(qū)域加有下劃線。(相應(yīng)于公開序列的 堿基對位置92-189)。圖18 (SEQ ID NO 64) 土曲霉(5677生成的序列)eIF2 γ中的引物結(jié)合部位(灰 色突出部分)和探針(粗體部分)。感興趣的擴增區(qū)域加有下劃線。(相應(yīng)于公開序列的 堿基對位置149-246)。發(fā)明詳述材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)臨床相關(guān)的念珠菌屬種類的地理上不同的菌株的收集得自許多培養(yǎng)物保藏中心。 念珠菌屬種類在沙氏肉湯(Sabouraud broth) (4% wt/vol (重量/體積)的葡萄糖、
vol的蛋白胨、1.5%的瓊脂)中于37°C在振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。曲霉屬種類(煙曲 霉、黃曲霉、黑曲霉和A. terruous、以及其它近緣種類)在沙氏肉湯(4% wt/vol的葡萄糖、1% wt/vol的蛋白胨、1.5%的瓊脂)或瓊脂中于25°C培養(yǎng)3-4天。DNA 提取在DNA分離前，用溶細(xì)胞酶或消解酶預(yù)處理念珠菌屬和曲霉屬菌種的細(xì)胞。用 MagNA 純化體系(MagNA Pure System) (Roche Molecular Systems)聯(lián)合MagNA 純化酵母和 細(xì)菌分離試劑盒III或聯(lián)合Qiagen植物試劑盒(Qiagen Plant kit)，根據(jù)廠商指示，從念 珠菌屬和曲霉屬菌種分離DNA。念珠菌屬和曲霉屬種類eIF2Y基因的測序念珠菌屬或曲霉屬種類eIF2基因的可公開得到的序列從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得，并用 Clustal W 比對。PCR引物組CaneIF2-F/CaneIF2-R被設(shè)計，以擴增念珠菌屬菌種中的eIF2 γ基 因區(qū)域，所述區(qū)域相當(dāng)于白色念珠菌(ΧΜ_715569. 1)中核苷酸位置718到核苷酸位置 1040 (表1，圖1)。PCR引物組AspeIF2-F/AspeIF2-R被設(shè)計，以擴增曲霉屬種類中的eIF2 γ 基因區(qū)域，所述區(qū)域相當(dāng)于煙曲霉(ΧΜ_746974. 2)中核苷酸位置121到核苷酸位置374(表 1)。在一系列念珠菌屬和曲霉屬菌種中，通過常規(guī)PCR，使用表2所列出的試劑和表3所描 述的熱循環(huán)條件，在iCycler BioRad PCR儀或PTC200Peltier熱循環(huán)儀(MJ Research)上 擴增eIF2基因區(qū)域。為了產(chǎn)生序列信息，通過常規(guī)PCR，用該引物組在iCycler BioRad PCR 儀上測試代表20個念珠菌屬種類的總共72個菌株的擴增。對于15個念珠菌屬種類白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、 熱帶念珠菌、都柏林念珠菌、吉利蒙念珠菌、挪威念珠菌、無名念珠菌、C. haemuloni、乳酒念 珠菌、產(chǎn)朊念珠菌、維斯念珠菌、葡萄牙念珠菌和西弗念珠菌，以及7個曲霉屬種類(煙曲 霉、棒曲霉、黑曲霉、土曲霉、黃曲霉、雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉)和費希新薩托菌)，產(chǎn)生了 PCR 產(chǎn)物。用羅氏高純度PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Roche High Pure PCR Product Purification kit)或ExoSAP-IT試劑盒(ExoSAP-ITkit) (USB)，根據(jù)廠商指示，純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物，并隨 后通過Sequiserve用正向擴增引物CaneIF2_F或AspeIF2_F進(jìn)行測序。對于15個念珠菌屬種類(白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、 熱帶念珠菌、都柏林念珠菌、吉利蒙念珠菌、挪威念珠菌、無名念珠菌、C. haemuloni、乳酒念 珠菌、產(chǎn)朊念珠菌、維斯念珠菌、葡萄牙念珠菌和西弗念珠菌)以及7個曲霉屬種類(煙曲 霉、棒曲霉、黑曲霉、土曲霉、黃曲霉、雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉)和費希新薩托菌(Neosartorya fischeri)，產(chǎn)生了 DNA序列信息。
權(quán)利要求
1.酵母或真菌種類的診斷試劑盒，所述試劑盒含有能夠與至少部分eIF2γ基因或其 相應(yīng)mRNA結(jié)合的至少一種寡核苷酸探針。
2.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中，所述eIF2γ基因的所述部分與白色念珠菌 (C. albicans) eIF2 γ基因的堿基對位置718到1040、白色念珠菌eIF2 γ基因的堿基對位 置790到934、光滑念珠菌(C. glabrata) eIF2 γ基因的堿基對位置872到972、近平滑念珠 菌(C. parapsilosis)eIF2y基因的堿基對位置151到274、熱帶念珠菌(C. tropicalis) eIF2 γ基因的堿基對位置140到270、克柔念珠菌(C. krusei)eIF2 γ基因的堿基對位置 115到224、煙曲霉(A. fumigatus)eIF2y基因的堿基對位置121到374、煙曲霉eIF2 γ基 因的堿基對位置164到261、黃曲霉(A. flavus)eIF2 γ基因的堿基對位置155到252、黑曲 霉(A. niger)eIF2 γ基因的堿基對位置92到189、或土曲霉(A. terreus)eIF2 γ基因的堿 基對位置149到246的基因區(qū)域的一部分相當(dāng)。
3.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述至少一種探針選自包括SEQID NO :1、2、 84、85、86、87、88、108、109、110、111、125或138的集合，或者也可以充當(dāng)探針的與其實質(zhì)上 相似或互補的序列。
4.任一前述權(quán)利要求中所述的試劑盒，還包含用于擴增至少部分所述eIF2γ基因的 至少一種引物。
5.任一前述權(quán)利要求中所述的試劑盒，包含用于至少部分所述eIF2γ基因的至少一 種正向引物和至少一種反向引物。
6.任一前述權(quán)利要求中所述的試劑盒，包含至少一種正向體外擴增引物和至少一種反 向體外擴增引物，所述正向擴增引物選自包括SEQ ID NO 3、5、89、91、93、95、97、104、105、 112、113、114、115、116、117、118、119、120、135 或 136 的集合，或者也可以充當(dāng)所述 eIF2 γ 基因的正向擴增引物的與其實質(zhì)上相似或互補的序列，以及所述反向擴增引物選自包括 SEQ ID NO 4、6、90、92、94、96、98、106、107、121、122、123、124 或 137 的集合，或者也可以充 當(dāng)所述eIF2Y基因的反向擴增引物的與其實質(zhì)上相似或互補的序列。
7.權(quán)利要求6所述的診斷試劑盒，其基于直接核酸檢測技術(shù)、信號擴增核酸檢測技術(shù)， 并且核酸體外擴增技術(shù)選自下列一種或更多種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (LCR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、鏈置換擴增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、分支DNA 技術(shù)(bDNA)以及滾環(huán)擴增技術(shù)(RCAT)或其它基于酶體外擴增的技術(shù)。
8.核酸分子，其選自SEQID NO 1至Ij SEQ ID NO 73禾口 SEQ ID NO. 84到138，以及與 其或其部分實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補且在基于所述eIF2 γ基因的診斷學(xué)中具有功能的序 列。
9.核酸分子，其含有寡核苷酸，所述寡核苷酸具與權(quán)利要求10所述的核酸分子的一部 分實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補的序列。
10.檢測檢測樣品中的目標(biāo)生物的方法，包括以下步驟(i)在適當(dāng)?shù)臈l件下，將所述檢測樣品與能夠與至少部分eIF2 γ基因或其相應(yīng)mRNA結(jié) 合的至少一種寡核苷酸探針混合；( )在高度嚴(yán)格條件下，將可能存在于所述檢測樣品中的任何核酸與所述寡核苷酸雜 交，形成探針目標(biāo)雙鏈體；和(iii)確定探針目標(biāo)雙鏈體是否存在，所述雙鏈體的存在明確識別出所述檢測樣品中所述目標(biāo)生物的存在。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述探針選自包括SEQID N0:l、2、84、85、86、87、 88、108、109、110、111、125或138的集合，或者也可以充當(dāng)所述eIF2Y基因的探針的與其實 質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補的序列。
12.權(quán)利要求8或9中任意一項所述的核酸分子在檢測酵母和/或真菌種類中一種或 更多種的存在情況的診斷分析中的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求1至7中任意一項所述的試劑盒或權(quán)利要求8或9中任意一項所述的核 酸分子在測量患者中酵母和/或真菌滴度的診斷分析中的應(yīng)用。
14.評估被設(shè)計以減少患者中酵母和/或真菌滴度的治療方案的功效的方法，其包括 在所述治療方案的一個或更多個關(guān)鍵時期應(yīng)用權(quán)利要求1至7中任意一項所述的試劑盒或 權(quán)利要求8或9中任意一項所述的核酸分子。
15.權(quán)利要求1至7中任意一項所述的試劑盒或權(quán)利要求8或9中任意一項所述的核 酸分子在測量環(huán)境中酵母和/或真菌污染物的診斷分析中的應(yīng)用。
16.權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其中，所述環(huán)境是醫(yī)院；食物樣品；環(huán)境樣品，例如水； 工業(yè)樣品，如需要生物負(fù)載或質(zhì)量評估的加工中樣品或終產(chǎn)品。
17.權(quán)利要求1至7中任意一項所述的試劑盒或權(quán)利要求8或9中任意一項所述的 核酸分子在識別和/或表征一種或更多種破壞劑中的應(yīng)用，所述破壞劑可以用于破壞所述 eIF2y基因功能。
18.權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中，所述破壞劑選自反義RNA、PNA、siRNA。
19.試劑盒，其實質(zhì)上如本文中參考附圖所述。
20.核酸，其實質(zhì)上如本文中參考附圖所述。
21.方法，其實質(zhì)上如本文中參考附圖所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及酵母或真菌種類的診斷試劑盒，所述試劑盒含有至少一種寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針能夠與至少部分EIF2γ基因或其相應(yīng)mRNA結(jié)合。
文檔編號C12Q1/68GK102105601SQ200980129410
公開日2011年6月22日 申請日期2009年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日
發(fā)明者J·馬塞尹, L·奧’考納爾, M·馬赫, N·圖伊特, S·拉黑夫, T·G·巴里, T·J·史密斯 申請人:愛爾蘭國立高威大學(xué)