專利名稱：從溶液中提取疏水蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從溶液中提取疏水蛋白的方法，具體涉及一種提取發(fā)酵過程中的疏水蛋白的方法。
背景技術(shù)：
起泡是需氧深層發(fā)酵中的常見問題。起泡是由將氣體噴入發(fā)酵培養(yǎng)基而引起，將氣體噴入發(fā)酵培養(yǎng)基的目的是為被培養(yǎng)的需氧有機(jī)體(例如細(xì)菌、酵母、真菌、藻類、細(xì)胞培養(yǎng)物)的生長提供氧氣。若發(fā)酵培養(yǎng)基含有表面活性組分例如蛋白質(zhì)、多糖或脂肪酸，則當(dāng)噴入的氣泡脫離液體時，可在培養(yǎng)基的表面上形成泡沫。起泡導(dǎo)致很多問題，包括不合需要地將產(chǎn)物、營養(yǎng)物和細(xì)胞帶入泡沫，并且可使工藝控制變得困難。已知控制起泡的方法是使用消泡劑，其中幾類是常用的基于硅氧烷的消泡劑(例如聚二甲基硅氧烷)、聚亞烷基二醇(例如聚丙二醇)、脂肪酸、聚酯和天然油(例如亞麻籽油、大豆油)。消泡劑代替氣泡表面上的起泡組分，導(dǎo)致泡沫因氣泡并和而破滅。消泡劑在發(fā)酵開始和/或期間加入。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)物意在用于食品、個人用品或藥品時，非常希望通過生產(chǎn)有機(jī)體將所述產(chǎn)物分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中(即細(xì)胞外而非細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn))。這樣不需要通過物理或化學(xué)方法破壞細(xì)胞，以便釋放供回收的產(chǎn)物。通過保持細(xì)胞完整，可容易地將細(xì)胞材料與產(chǎn)物分離， 以致產(chǎn)物不含細(xì)胞內(nèi)材料和遺傳材料，它們通常被視為不需要的污染物。當(dāng)生產(chǎn)有機(jī)體已經(jīng)過基因修飾(genetically modified)時，這樣做可能尤其重要。然而，細(xì)胞外制備可加強(qiáng)發(fā)酵罐中的起泡程度，如果產(chǎn)物促進(jìn)泡沫形成或增強(qiáng)泡沫穩(wěn)定性則尤其如此，例如生物表面活性劑或疏水蛋白。在此類起泡劑的細(xì)胞外生產(chǎn)中使用消泡劑存在特殊問題，原因有二第一，因起泡劑本身促進(jìn)了發(fā)酵罐中的起泡而需要增加消泡劑的量。第二，由于消泡劑以低濃度存在不影響產(chǎn)物的功能，不必從大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物中除去消泡劑。然而，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)物是起泡劑時，必須基本上去除消泡劑，因為產(chǎn)物中消泡劑的存在將削弱該產(chǎn)物的功能。Bailey 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol.(應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù))58(2002)第721-727頁公開了通過里氏木霉(Trichoderma reesei)轉(zhuǎn)化株的發(fā)酵來制備疏水蛋白HFB I和HFB II。使用消泡劑(Struktol J633)來防止起泡，并使用含水雙相萃取提純疏水蛋白。然而，例如含水雙相萃取或色譜方法的分離方法昂貴，且可能需要與食品不相容的化學(xué)物質(zhì)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可以從溶液中除去疏水蛋白而不是除去消泡劑。測試和定義疏水蛋白疏水蛋白可以通過培養(yǎng)絲狀真菌而獲得，例如絲狀菌類(例如木霉菌)、擔(dān)子菌類和子囊菌類。特別優(yōu)選的宿主是食品級生物，例如分泌被稱為cryparin的疏水蛋白的板栗疫病毒(Cryphonectria parasitica) (MacCabe 禾口 Van Alfen, 1999, App. Environ. Microbiol(應(yīng)用環(huán)境和微生物學(xué))65 =5431-5435) 與此類似，表面活性素(surfactin) 可以從枯草桿菌獲得，糖脂可以從例如綠膿桿菌O^eudomanas aeruginosa)、紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、木干-M 和(Torulopsis bomb i col a) ψ
(Desai 和Banat，Microbiology and Molecular Biology Reviews (微生物學(xué)禾口分子生物學(xué)綜述)，1997，3 月，47-64 頁)。我們之前在EP 1 623 631中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，疏水蛋白允許產(chǎn)生對歧化和并和具有極好穩(wěn)定性的水性泡沫。由于疏水蛋白是非常有效的起泡劑，在發(fā)酵培養(yǎng)基中他們的存在對于泡沫控制極具挑戰(zhàn)。疏水蛋白是一類定義明確的蛋白質(zhì)(ffessels, 1997, Adv. Microb. Physio. 38 1-45 ；ffosten,2001, Annu Rev. Microbiol. 55 :625-646)，在疏水 / 親水界面具有自組裝能力，并且具有保守序列Xn-C-X5_9-C-C-Xn_39-C-X8_23-C-X5_9-C-C-X6_18-C-Xm(SEQ ID No. 1)其中X代表任何氨基酸，并且η和m獨(dú)立地代表整數(shù)。通常，疏水蛋白有最多125 個氨基酸長度。在保守序列中半胱氨酸殘基(C)是二硫橋的一部分。在本發(fā)明的情況下， 術(shù)語疏水蛋白具有更廣泛的含義，包括功能等價的蛋白質(zhì)，在疏水/親水界面其仍然顯示自組裝特性而形成蛋白薄膜，例如包括以下序列的蛋白質(zhì)Xn-C-XHQ-C-XH-C-XHQQ-C-XHQQ-C-XHQ-C-XH-C-X^-C-XJSEQ ID No. 2)或者在疏水/親水界面其部分仍然顯示自組裝特性而形成蛋白薄膜。根據(jù)本發(fā)明的定義，自組裝可通過將該蛋白吸附于特氟隆并用圓二色譜檢測，以確定存在的次級結(jié)構(gòu) (一般為 α 螺旋)(De Vocht 等人，1998，Biophys. J. 74 =2059-68)。薄膜的形成可以通過將特氟隆片材在蛋白質(zhì)溶液中孵化，隨后用水或緩沖液至少洗3遍來確定(Wosten等人，1994，Embo. J. 13 :5848-54)。蛋白質(zhì)薄膜可用任何合適的方法來顯示，如用熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，或者使用熒光抗體，這在本領(lǐng)域是已經(jīng)確定的。m和η 通常具有從O至2000范圍的數(shù)值，但更通常地m和η的和小于100或200。在本發(fā)明的情況下，疏水蛋白的定義包括疏水蛋白與另一種多肽的融和蛋白，以及疏水蛋白與其他分子如多糖的綴合物。目前為止得到鑒定的疏水蛋白一般可分為I類和II類。這兩種類型均已在真菌中鑒定為分泌蛋白，其在疏水界面自組裝成兩性膜。I類疏水蛋白的組裝物相對不可溶，而 II類疏水蛋白的組裝物則容易溶解于各種溶劑中。優(yōu)選地該疏水蛋白可溶于水，其意味著至少0. 可溶于水，優(yōu)選地至少0. 5%。至少0. 可溶意味著當(dāng)99. 9mL水中的0. Ig疏水蛋白在20°C經(jīng)過30，000克離心30分鐘時沒有疏水蛋白沉淀。在絲狀細(xì)菌例如放線菌和鏈霉菌中也鑒定出了疏水蛋白樣蛋白質(zhì)(例如 "chaplins") (W001/74864, Talbot, 2003, Curr. Biol, 13 :R696_R698)。這些細(xì)菌蛋白質(zhì)與真菌疏水蛋白相比，最多只能形成一個二硫橋，因為它們只有兩個半胱氨酸殘基。這種蛋白質(zhì)是具有SEQ ID No. 1和2所示共有序列的疏水蛋白的功能等價物的實例，落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。已經(jīng)克隆了超過34個編碼疏水蛋白的基因，這些基因來自16種以上的真菌(參見例如W096/41882，該專利給出了在雙孢蘑菇(agaricus bisporus)中鑒定出的疏水蛋白的序列；和Wosten，2001，Annu Rev. Microbiol. 55 :625-646)。對于本發(fā)明的目的，在氨基酸水平具有與天然存在的疏水蛋白至少80 %同源的疏水蛋白也包括在術(shù)語“疏水蛋白”中。消泡劑
術(shù)語“消泡劑”包括通常在起泡發(fā)生前加入和通常在泡沫已經(jīng)形成時加入(有時稱為泡沫消除劑)的消泡劑。用于本發(fā)明的消泡劑的定義可在‘Toam and its mitigation in fermentation systems (ψ^ ^ ) ""Beth Junker-Biotechnology Progress (生物技術(shù)進(jìn)展)，2007，23，768-784中找到。發(fā)酵工藝產(chǎn)生疏水蛋白的發(fā)酵通過在生物反應(yīng)器(例如工業(yè)發(fā)酵罐)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞進(jìn)行。培養(yǎng)基組成(例如營養(yǎng)物，碳源等)，溫度和PH值的選擇為培養(yǎng)生長和/或產(chǎn)生起泡劑提供適合的條件。通常向培養(yǎng)基中噴入空氣或者富氧空氣為培養(yǎng)呼吸提供氧氣。消泡劑可以包括在初始培養(yǎng)基組成中和/或根據(jù)需要在整個發(fā)酵期間加入。使用泡沫檢測法是一種慣例，例如電導(dǎo)率探針，其自動觸發(fā)加入消泡劑。在本發(fā)明中，消泡劑優(yōu)選地以從0. 1到20克/L，更優(yōu)選地從1到10克/L的終濃度存在。步驟i)期間，即發(fā)酵期間發(fā)酵罐的溫度可高于或低于消泡劑的濁點(diǎn)。優(yōu)選地發(fā)酵罐溫度高于消泡劑的濁點(diǎn)，因為消泡劑在其濁點(diǎn)以上最有效地引起氣泡并和和泡沫崩潰。 發(fā)酵罐溫度一般選擇為能夠獲得宿主細(xì)胞的生長和/或生產(chǎn)的最佳條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從溶液中提取疏水蛋白的方法，其中將角叉菜膠加入到該溶液中并且溶液的PH值調(diào)到3. 5以下，優(yōu)選3以下。在本發(fā)明的第一優(yōu)選實施方案中，該溶液然后經(jīng)過濾產(chǎn)生截留物和濾出液，疏水蛋白從該截留物中回收。在本發(fā)明的第二優(yōu)選實施方案中，該溶液進(jìn)行離心步驟，以產(chǎn)生上清液并去除之，留下保留相。然后疏水蛋白從保留相中分離。優(yōu)選地，該方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞的步驟，宿主細(xì)胞在其中通過細(xì)胞外分泌疏水蛋白；并且該發(fā)酵培養(yǎng)基包含消泡劑。更優(yōu)選地，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中噴入空氣或者富氧空氣進(jìn)行充氣。優(yōu)選地，疏水蛋白是來自里氏木霉的HFB I或者HFB II。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是基因修飾的真菌，更優(yōu)選是酵母，最優(yōu)選是啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0優(yōu)選地，該溶液的離子強(qiáng)度低于0. 5，優(yōu)選低于0. 4，更優(yōu)選低于0. 3，更優(yōu)選低于 0. 2。優(yōu)選地，角叉菜膠是κ或者t角叉菜膠，更優(yōu)選t角叉菜膠。優(yōu)選地，角叉菜膠/疏水蛋白比(w/w)為1 10和10 1之間，優(yōu)選1 5以上， 更優(yōu)選1 1以上。
具體實施例方式本發(fā)明將在下列實施例中進(jìn)一步描述，其中疏水蛋白都是HFB II。實施例1 (對比)在4. 5cm3的25mM檸檬酸溶液中疏水蛋白的初始濃度為145. 4 μ g/cm3。該溶液過濾后得9cm3濃度為67. 9 μ g/cm3的濾出液。
這里93%的起始疏水蛋白被濾過。實施例2 (對比)在4. 5cm3的25mM檸檬酸鈉溶液中疏水蛋白的初始濃度為146. 3 μ g/cm3。該溶液過濾后得9cm3濃度為68. 0 μ g/cm3的濾出液。因此也有93%的起始疏水蛋白被濾過。實施例3 (本發(fā)明) 在4. 5cm3的25mM檸檬酸溶液+1 %的κ角叉菜膠剪切凝膠中的疏水蛋白的初始濃度為 145. 9μ g/cm3。該溶液過濾后得9cm3疏水蛋白濃度為3. 8 μ g/cm3的濾出液。因此只有5%的疏水蛋白濾過。然后將9cm3的pH值為8的25mM檸檬酸鈉通過過濾器。濾出液的濃度是40. 9 μ g/ ml，因此通過此方式56%的起始疏水蛋白被回收。實施例4 (對比)在4. 5cm3的25mM檸檬酸溶液+1 %的κ角叉菜膠剪切凝膠中的疏水蛋白的初始濃度為 145. 9μ g/cm3。然后加入0. 325cm3的NaOH (達(dá)到pH 7. 0)并過濾。濾出液的濃度=9cm3中的75. 6 μ g/cm3這里，盡管使用角叉菜膠，100%的疏水蛋白結(jié)果都在濾出液中，顯示出pH值的重要性。實施例5 (本發(fā)明) 在4. 5cm3的25mM檸檬酸溶液+1 %的κ角叉菜膠剪切凝膠中的疏水蛋白的初始濃度為 145. 9μ g/cm3。然后加入固體NaCl得到0. 5M NaCl的濃度并過濾。9cm3濾出液的濃度是50. 9 μ g/ cm3。因此，盡管在合適的pH值并使用的κ角叉菜膠剪切凝膠，大約70%的起始量的疏水蛋白被濾過。然后將pH值為8的25mM檸檬酸鈉9cm3通過過濾器，產(chǎn)生濃度為13. 8 μ g/cm3的濾出液。因此該方法中只有19%的疏水蛋白被回收，顯示出離子強(qiáng)度對整個方法的影響。 離子強(qiáng)度越高，回收率越低，其他的都相等。實施例6. a (本發(fā)明)在4.5cm3的25mM檸檬酸溶液+0.025%的t角叉菜膠中的疏水蛋白的初始濃度為 145. 9μ g/cm3。9cm3濾出液的濃度是1. 6 μ g/cm3,只有2%的初始疏水蛋白通過。然后將pH值為8的25mM檸檬酸鈉9cm3通過過濾器，導(dǎo)致濾出液的濃度= 29.5 μ g/cm3。超過40%的疏水蛋白被回收。實施例6. b(本發(fā)明)在4. 5cm3的25mM檸檬酸溶液+0. 025 %的κ角叉菜膠中的疏水蛋白的初始濃度為 145. 9μ g/cm3。9cm3濾出液的濃度是觀.4 μ g/cm3，39%的疏水蛋白通過。
這個實施例顯示當(dāng)保留疏水蛋白時，t角叉菜膠比κ角叉菜膠更好。實施例7 (對比)在4. 5cm3的25mM檸檬酸溶液+1 %剪切果膠中的疏水蛋白的初始濃度為 145. 9 μ g/cm3。9cm3濾出液中的濃度是57. 3μ g/cm3，占起始疏水蛋白的79%，顯示果膠不起作用。實施例8 (對比)在4. 5cm3的25mM檸檬酸溶液和1 % N creamer 46中的疏水蛋白的初始濃度為 145. 9 μ g/cm3。9cm3濾出液中的濃度是64. 2μ g/cm3，占起始疏水蛋白的88%，顯示疏水性淀粉不起作用。
權(quán)利要求
1.一種從溶液中提取疏水蛋白的方法，其中將角叉菜膠加入到所述溶液中，并且將所述溶液的PH直調(diào)到3. 5以下，優(yōu)選3以下。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述溶液然后經(jīng)過濾產(chǎn)生截留物和濾出液，從所述截留物中回收疏水蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述溶液進(jìn)行離心步驟，產(chǎn)生上清液并去除之，留下保留相，然后疏水蛋白從所述保留相中分離。
4.根據(jù)任一項上述權(quán)利要求的方法，其包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞的步驟，其中所述宿主細(xì)胞通過細(xì)胞外分泌疏水蛋白；并且所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含消泡劑。
5.根據(jù)任一項上述權(quán)利要求的方法，其中所述疏水蛋白是來自里氏木霉的HFBI或者 HFB II。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述宿主細(xì)胞是基因修飾的真菌，更優(yōu)選是酵母，最優(yōu)選是啤酒酵母。
7.根據(jù)任一項上述權(quán)利要求的方法，其中所述溶液的離子強(qiáng)度低于0.5，優(yōu)選低于 0. 4，更優(yōu)選低于0. 3，更優(yōu)選低于0. 2。
8.根據(jù)任一項上述權(quán)利要求的方法，其中角叉菜膠是κ或者^角叉菜膠，更優(yōu)選^ 角叉菜膠。
9.根據(jù)任一項上述權(quán)利要求的方法，其中所述角叉菜膠/疏水蛋白比(w/w)為1 10 和10 1之間，優(yōu)選1 5以上，更優(yōu)選1 1以上。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從溶液中提取疏水蛋白的方法，其中將角叉菜膠加入到所述溶液中，并且將所述溶液的pH值調(diào)到3.5以下，所述溶液的離子強(qiáng)度低于0.5。
文檔編號C07K14/375GK102245628SQ200980150600
公開日2011年11月16日 申請日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月16日
發(fā)明者N·D·赫奇斯 申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司