專利名稱：評價致病兩期細(xì)菌的毒力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測定環(huán)境系統(tǒng)中的致病兩期細(xì)菌(biphasicbacteria)的方法， 更準(zhǔn)確地說，涉及用于評價環(huán)境系統(tǒng)中的致病兩期細(xì)菌的毒力的方法。
背景技術(shù)：
在水、食物、健康保健或制藥行業(yè)的環(huán)境或臨床樣品中致病細(xì)菌的存在可能引起 嚴(yán)重的健康顧慮。評價致病細(xì)菌以確定其毒力對評價這些樣品的相對風(fēng)險十分關(guān)鍵?？?以采用常規(guī)測定法，例如基于培養(yǎng)的方法或基于雜交的方法，來測定微生物病原體的濃度。 然而，基于培養(yǎng)的方法需要漫長的孵育時間，而且該方法容易產(chǎn)生錯誤結(jié)果，因為野外樣品 (field sample)可能干擾該方法。同樣，用基于雜交的方法很難精確地檢測低水平的致病 細(xì)菌。更重要的是，兩種方法的輸出結(jié)果僅僅是細(xì)菌濃度，而非是公眾和業(yè)界更加關(guān)注的致 病毒力。因此，存在對用于快速準(zhǔn)確地測定兩期致病細(xì)菌的相對毒力并提供低水平檢測的 改進方法和系統(tǒng)的需要。發(fā)明概述在一個實施方案中，用于評價環(huán)境系統(tǒng)中的兩期細(xì)菌的相對致病毒力的方法包括 測定細(xì)菌的DNA濃度、測定細(xì)菌的RNA濃度、求出RNA濃度與DNA濃度的比率并將濃度比與 相對致病性水平相關(guān)聯(lián)。各個實施方案提供在早期發(fā)作當(dāng)病原體處于低濃度時用于檢測和測定兩期致病 細(xì)菌相對毒力的快速、準(zhǔn)確和低成本方法。附圖簡述

圖1圖示嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)的平板計數(shù)。該曲線圖是CFU/ ml的對數(shù)與時間(小時)的函數(shù)。圖2圖示通過實時PCR測定的嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)的DNA拷貝 數(shù)。該曲線圖是DNA(GU)的對數(shù)與時間(小時)的函數(shù)。圖3圖示通過實時TMA測定的嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)的rRNA拷 貝數(shù)。該曲線圖是rRNA拷貝數(shù)的對數(shù)與時間(小時)的函數(shù)。圖4圖示嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)的rRNA/DNA的比率。該曲線圖 是rRNA/DNA比率的對數(shù)與嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)生長期(Lpn期)的函數(shù)。發(fā)明詳述單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)對象，除非文中有明確規(guī)定。陳述同一特征的所有范圍的端點 可獨立組合并包括所述端點。所有參考文獻都通過引用結(jié)合到本文中。與數(shù)量聯(lián)用的修飾語“約/大約”包括所述值并具有文中規(guī)定的含意(例如包括 與特定數(shù)量測量值有關(guān)的公差范圍)?！叭芜x的”或“任選”是指隨后描述的事件或情況可能發(fā)生或者可能不發(fā)生，或者隨 后指定的材料可能存在或可能不存在，且該描述包括其中事件或情況發(fā)生或者其中材料存 在的情形，以及其中事件或情況不發(fā)生或者材料不存在的情形。
在一個實施方案中，用于評價環(huán)境系統(tǒng)中的兩期細(xì)菌的相對致病毒力的方法包括 測定細(xì)菌的DNA濃度、測定細(xì)菌的RNA濃度、求出RNA濃度與DNA濃度的比率并將濃度比與 相對致病性水平相關(guān)聯(lián)。
環(huán)境系統(tǒng)中的致病兩期細(xì)菌可能引起健康問題。這些病原體已產(chǎn)生對付不同環(huán)境 應(yīng)激條件的特殊策略。細(xì)菌經(jīng)歷4個不同的時期。起始期為延遲期，其中細(xì)菌成熟，但不能 分裂。指數(shù)期是其中細(xì)胞繁殖的時期。在進入宿主細(xì)胞時，基因表達將改變以允許增殖。當(dāng) 環(huán)境中有大量營養(yǎng)物時，細(xì)菌停留在指數(shù)期。當(dāng)營養(yǎng)物變得有限或開始缺乏時，細(xì)菌開始轉(zhuǎn) 入靜止期(亦稱后指數(shù)期)，其中生長速率接近或等于死亡速率。在靜止期間，病原體從代 謝轉(zhuǎn)變到提高感染性。當(dāng)進入宿主細(xì)胞時，基因表達將改變以允許增殖。靜止期是最強毒 力期，因為它允許細(xì)菌加強感染。在靜止期后是死亡期，其中營養(yǎng)物耗盡，細(xì)菌死亡。細(xì)菌群可以是單一生長期的單一物類，或不同生長期的混合群，或4個時期的任 何組合。在實驗室生長培養(yǎng)物中也觀察到這4個時期。兩期致病細(xì)菌是可以轉(zhuǎn)變其代謝過程并改變其細(xì)胞表達和胞外活性使得病原體 尋找可以提供復(fù)制的基本生長條件的宿主的任何病原體類型。在一個實施方案中，兩期致 病細(xì)菌包括但不限于嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)或李其j 特菌屬(Lysteria)。環(huán)境系統(tǒng)可以是其中兩期致病細(xì)菌可侵入的任何類型的環(huán)境。在一個實施方案 中，環(huán)境系統(tǒng)可以是液體、固體或空氣。在一個實施方案中，環(huán)境系統(tǒng)可以是土壤、含有可攜 帶致病細(xì)菌的宿主細(xì)胞的霧化流體或水性介質(zhì)。在一個實施方案中，水性介質(zhì)可以是水、血 液、尿液、痰、體液或前述的任何組合。在另一個實施方案中，液體介質(zhì)可以是冷卻塔水、廢 水或者從水、食品、醫(yī)療保健或制藥行業(yè)得到的其它工業(yè)液體?？捎萌魏魏线m的方法測定兩期細(xì)菌的DNA濃度。在一個實施方案中，可以通過對 從兩期細(xì)菌提取的DNA進行實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來測定DNA濃度。在另一個實施方 案中，可以使用巨噬細(xì)胞感染性增強蛋白(mip)基因靶向引物、探針和熱穩(wěn)定酶對從兩期 細(xì)菌提取的DNA進行實時PCR來測定DNA濃度。使用引物和熱穩(wěn)定酶按指數(shù)擴增DNA以用于測定。引物為短的DNA片段，其與待 測定的DNA相匹配，熱穩(wěn)定酶將引物裝配到新的DNA鏈上。熱穩(wěn)定酶可以是Taq聚合酶，例 如Taqman 探針。探針含有DNA模板和熒光標(biāo)記。DNA模板是底物上的特異性DNA序列，允許探針 只靶向或測定與DNA模板匹配的DNA。將熒光標(biāo)記與DNA連接以檢測擴增的DNA。熒光標(biāo) 記可以是在DNA存在時改變其熒光信號的任何類型的熒光染料或指示劑。在一個實施方案 中，熒光染料是熒光染料或熒光團，其是與核酸結(jié)合的微生物染料。在一個實施方案中，熒 光團可以是5-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)。可通過任何類型的熒光檢測器檢測熒光。在一個實施方案中，熒光信號通過熒光 光譜法、熒光顯微鏡檢術(shù)、熒光二極管陣列檢測、微量培養(yǎng)板熒光讀數(shù)或流式細(xì)胞術(shù)測定?？捎萌魏魏线m的方法測定兩期細(xì)菌的RNA濃度。選定的RNA可以是信使RNA (mRNA) 或核糖體RNA(rRNA)。在一個實施方案中，RNA可從兩期細(xì)菌中提取，并通過包括但不限于 以下的方法測定RNA印跡法、核糖核酸酶保護測定、原位雜交、實時轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA) 或反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶(reverse transcriptase polymerase)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。RNA印跡法應(yīng)用根據(jù)大小分離RNA樣品的電泳和與靶RNA序列的至少一部分互補的雜交探針以檢測RNA。雜 交信號用X光片檢測，并通過光密度測定法定量。原位雜交采用含有互補RNA鏈以檢測靶 RNA的標(biāo)記探針?？赏ㄟ^測定熒光、射線照相法或免疫組織化學(xué)來定量測定RNA。在反轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA鏈反轉(zhuǎn)錄至其DNA互補鏈中，使所得到的互補DNA 擴增，并采用如上所述的實時PCR進行測定。TMA是核酸擴增試驗，可通過商業(yè)途徑購自 Gen—Probe， Inc0可通過任何合適的方法提取兩期細(xì)菌細(xì)胞的核酸(DNA和RNA)，在一個實施方案 中，可通過裂解細(xì)胞來提取致病細(xì)胞的核酸?？刹捎脵C械、化學(xué)、物理、電學(xué)、超聲或微波方 法或這些方法的任何組合進行裂解。機械裂解物理性地破壞細(xì)胞屏障，例如通過剪切、振動或外力。機械方法的實例包 括但不限于壓力驅(qū)動細(xì)胞流過過濾器樣結(jié)構(gòu)或流體通道中的小規(guī)模擋板(bar)、用快速擴 散混合的低離子強度水滲透性地給細(xì)胞施壓、在進入具有尖窄的小規(guī)模結(jié)構(gòu)的特定區(qū)域的 同時使細(xì)胞遭受剪切力、用微珠打珠機或珠磨機破壞細(xì)胞屏障或者向水性介質(zhì)中的細(xì)胞施 加超聲能。當(dāng)使用化學(xué)試劑破壞細(xì)胞屏障并使胞內(nèi)內(nèi)含物釋放出來時便會發(fā)生化學(xué)裂解?？?以使用可破壞細(xì)胞屏障的任何化學(xué)試劑。在一個實施方案中，可以使用洗滌劑、酶、抽提 溶劑或裂解緩沖液。洗滌劑包括但不限于十二烷基硫酸鹽、3_[ (3-膽酰氨基丙基)二甲 基氨基(amm0ni0)]-l-丙磺酸、TWEEN 20洗滌劑、TRITON X系列洗滌劑、膽酸鈉、脫氧 膽酸鈉、氯化孤。酶包括但不限于溶菌酶、變?nèi)芫?、labiase、溶葡萄球菌素、溶細(xì)胞酶、 蛋白酶K、內(nèi)溶素或消色肽酶。抽提溶劑包括但不限于聚乙烯聚吡咯烷酮、苯酚、三氯三氟 乙烷或苯酚和硫氰酸孤或氯化孤的混合物。裂解緩沖液包括但不限于氯化銨、季銨化合 物、十六烷基三甲基溴化銨、鯨蠟基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉、六偏磷酸鹽、焦磷酸 鈉、Swab Transfer Medium(STM)(—種可通過商業(yè)途徑購自Gen-Probe、Inc.的裂解溶 液)、Zap-o-globin ( —種可通過商業(yè)途徑購自Coulter Diagnostics的裂解緩沖液)或 CyQUANT 細(xì)胞裂解緩沖液(可通過商業(yè)途徑購自MolecularProbes)。試劑可以任何適于裂解微生物物質(zhì)的量加入，并且可以過量加入。在一個實施方 案中，以約Iml-約10，OOOml/毫升水性介質(zhì)的量加入試劑。在另一個實施方案中，以約 Iml-約1000ml/毫升水性介質(zhì)的量加入試劑。在另一個實施方案中，以約Iml-約50ml/毫 升水性介質(zhì)的量加入試劑。物理裂解可以熱的方式或通過凍融而發(fā)生。通過例如用加熱塊或加熱板加熱水性 介質(zhì)而以熱的方式完成細(xì)胞裂解。在一個實施方案中，將水性介質(zhì)加熱至約40°C-約100°C 的溫度。在另一個實施方案中，溫度為約40°C -約60°C。在一個實施方案中，將水性介質(zhì) 加熱約1分鐘_約1小時。在另一個實施方案中，將水性介質(zhì)加熱約1分鐘_約30分鐘， 包括約1分鐘_約15分鐘，在另一個實施方案中，將水性介質(zhì)加熱約1分鐘_約3分鐘。在凍融的一個實例中，將水性介質(zhì)例如在乙醇_干冰浴凍結(jié)，然后融化。 可以通過擴散混合和介電泳捕集(dielectrophoretic trapping)或通過微波輻 射，用一系列的電脈沖以電的方式裂解細(xì)胞。自由基也可用于細(xì)胞裂解。該方法包括將電 場應(yīng)用于水性介質(zhì)中的金屬離子、過氧化物和微生物物質(zhì)的混合物中以產(chǎn)生可攻擊細(xì)胞屏 障的自由基。
在一個實施方案中，可以純化由細(xì)胞裂解物中提取的核酸以得到特定的靶DNA和 特定的靶RNA。在一個實施方案中，可經(jīng)化學(xué)沉淀與溶解、磁珠或與樹脂的親和力通過非特 異性吸附或者通過與互補引物連接，來純化核酸。在一個實施方案中，在化學(xué)沉淀期間，可 將溶劑加入細(xì)胞裂解物中以制備溶液，并可將沉淀溶劑與提取的核酸混合以沉淀出特定的 靶核酸后，隨溶劑一起除去雜質(zhì)。在一個實施方案中，沉淀溶劑包括但不限于乙醇和異丙 醇。在溶解期間，加入溶解溶劑以重新溶解沉淀后的核酸。水溶性雜質(zhì)在溶解溶劑中溶解 有限，并且不會重新溶解。溶解溶劑可包括氯化鋰、氯化孤或醇與一價陽離子的組合。
在另一個實施方案中，可以用磁珠通過結(jié)合-洗滌-洗脫步驟對核酸進行純 化。在一個實施方案中，磁珠可以是可通過商業(yè)途徑購自Promega Corporation的
Promega MagneSil Red 或可通過商業(yè)途徑購自 Seradyn Inc 的;Seradyn 珠。在互補引物方法中與樹脂的親和力中，使用DNA模板來選擇靶DNA。DNA模板是底 物上的互補寡核苷酸序列。在一個實施方案中，提取的核酸的純化可以是自動化的。在另一個實施方案中，可 以使用可通過商業(yè)途徑購自Thermo ElectronCorporation的KingFisher 儀器進行自動純化。求出RNA濃度與DNA濃度的比率。該比率表明兩期細(xì)菌存在于特定生長期的可能 性，并提供用于評價致病細(xì)菌的相對毒力的參數(shù)。兩期細(xì)菌含有處于延遲期、指數(shù)生長期 (其中細(xì)胞類似于發(fā)生改變以允許增殖的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞)和后指數(shù)期(其中細(xì)胞類似于細(xì)胞 外細(xì)胞并具有增強的毒力)的細(xì)胞?？蓪NA與DNA的濃度比等同于相對致病性水平。在一個實施方案中，通過將該 濃度比與參比曲線相比較，將該濃度比等同于相對致病性水平。在一個實施方案中，可繪制 各個目標(biāo)病原體的參比曲線。在另一個實施方案中，通過監(jiān)測整個不同生長期的DNA和RNA 濃度來繪制參比曲線。在一個實施方案中，采用基于培養(yǎng)的平板計數(shù)方法來測定病原體的 生長期。為了本領(lǐng)域技術(shù)人員可更好地實施本申請的公開內(nèi)容，以舉例方式而非限制方式 給出下列實施例。
實施例實施例1繪制用于測定嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)的毒力的參比曲線。從之前繁殖的培養(yǎng)基板中取出3-5個嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)菌 落，在液體培養(yǎng)基生長48-72小時，加至40ml新鮮滅菌的液體培養(yǎng)基以制成樣品。將樣品 于36°C振蕩(175rpm)24小時。以1 40體積比將嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)樣品加入另一新鮮滅 菌的液體培養(yǎng)基中以制備參比樣品。將樣品于36°C振蕩(175rpm)24小時。在以下不同的時間點測定參比樣品以確定嗜肺軍團菌(Legionel lapneumophi la) 的各生長期及DNA和RNA的濃度1. 5小時(為延遲期)、6小時、9小時(為指數(shù)期)、26小 時、28小時、30小時、32小時、34小時、48小時、51. 5小時、73. 5小時和77小時(為后指數(shù)期)。在各個時間點進行平板計數(shù)試驗以測定嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila) 的生長期。采用遵循測試標(biāo)準(zhǔn)AFNOR 90-431或IS011731的標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)方法。在各個時 間點進行3次重復(fù)，結(jié)果為3次重復(fù)的平均值。平板計數(shù)試驗用大約10天完成，數(shù)據(jù)見圖1。在各時間點進行實時PCR和實時轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)試驗以分別測定嗜肺軍 團菌(Legionella pneumophila)的DNA和RNA濃度。最初，從嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)提取細(xì)胞核材料。每次取出Iml的起始樣品，在離心機中以3000g離心2分 鐘。取出上清液后棄去。加入Iml無菌page鹽(0.012% (w/v)氯化鈉、0. 0004% (w/v)硫 酸鎂五水合物、0.0004% (w/v)氯化鈣脫水物、0.0. 142% (w/v)磷酸氫二鈉、0. 0136% (w/ ν)磷酸二氫鉀(136mg/L))使樣品重新懸浮。取出100μ 1重新懸浮的樣品，用3ml化學(xué)裂 解緩沖液STM裂解至少3小時。實時PCR試驗采用珠粒型DNA純化方法。500 μ 1裂解物用Promega MagneSil Red(可通過商業(yè)途徑購自Promega Corporation)純化。引物(mip6和mip8)擴增mip基 因的ι ο-bp片段，擴增用TaqMan 探針TQ-mip (用5 ‘ -fam/3 ‘ -tamra標(biāo)記)檢測。數(shù) 據(jù)見圖2。實時TMA試驗是基于轉(zhuǎn)錄的檢測RNA的方法。將500 μ 1裂解物用Seradyn 珠粒 純化，使嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila) 23SrRNA的區(qū)域擴增。擴增產(chǎn)物用5-羧基 四甲基羅丹明(TAMRA)熒光團標(biāo)記的火炬型(torch)探針檢測。數(shù)據(jù)見圖3。在得到所有結(jié)果后進行數(shù)據(jù)分析。rRNA/DNA比率=用TMA測定的rRNA拷貝數(shù)/用實時PCR測定的DNA基因組單位 (genomic unit, GU)。rRNA拷貝/CFU =用TMA測定的rRNA拷貝數(shù)/用平板計數(shù)方法測定的菌落形成單 位(CFU)。指數(shù)期的平均RNA/DNA比率為22，542，靜止期的平均值為6685。參比曲線用該數(shù) 據(jù)繪制并見圖4?；诎蠷NA/DNA比率的方法鑒定出特定的兩期病原體生長期，并在3小時以內(nèi)評 價其相對毒力。實施例2通過過濾型濃縮(filtration-based concentration)從不同的50ml冷卻塔 水樣品中獲得浮游的嗜肺軍團菌細(xì)胞(Legionella pneumophila)。將樣品通過聚醚砜 (PES) 0. 45 μ m膜過濾。將細(xì)胞在該膜上用3ml化學(xué)裂解緩沖液STM裂解過夜，將裂解物通 過PES 0. 22 μ m膜過濾除去細(xì)胞碎片。按照實施例1所述方法定量測定裂解物中的DNA和rRNA。如表1所示，這些野外樣品的大部分的rRNA/DNA比率所在范圍為300-9000，這表 明嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)的生長期為后指數(shù)期。表 權(quán)利要求
1.一種用于評價環(huán)境系統(tǒng)中的兩期細(xì)菌的相對細(xì)菌毒力的方法，所述方法包括測定細(xì) 菌的DNA濃度、測定細(xì)菌的RNA濃度、求出RNA的濃度與DNA的濃度比率并將RNA與DNA之 比與相對致病性水平相關(guān)聯(lián)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述兩期致病細(xì)菌選自嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)禾口李斯特菌屬(Lysteria)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述環(huán)境系統(tǒng)是液體、固體或空氣。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述環(huán)境系統(tǒng)選自土壤、霧化流體和水性介質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述水性介質(zhì)選自水、廢水、血液、尿液、痰、體液和前述的 任何組合。
6.權(quán)利要求1的方法，其中對從兩期細(xì)菌中提取的DNA進行實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以測 定DNA濃度。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用巨噬細(xì)胞感染性增強蛋白 (mip)基因靶向引物、探針和熱穩(wěn)定酶。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述探針含有DNA模板和熒光標(biāo)記。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述熒光標(biāo)記是熒光染料或熒光團。
10.權(quán)利要求8的方法，其中通過選自以下的熒光檢測法來測定所述熒光標(biāo)記的熒光 信號熒光光譜法、熒光顯微鏡檢術(shù)、熒光二極管陣列檢測、微量培養(yǎng)板熒光讀數(shù)和流式細(xì) 胞術(shù)。
11.權(quán)利要求1的方法，其中通過選自以下的方法來測定從兩期細(xì)菌中提取的RNA的 RNA濃度RNA印跡法、核糖核酸酶保護測定、原位雜交、實時轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增和反轉(zhuǎn)錄酶聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
12.權(quán)利要求6的方法，其中所述DNA通過裂解細(xì)胞而從兩期細(xì)菌中提取。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述細(xì)胞通過選自以下的裂解方法裂解機械、化學(xué)、物 理、電學(xué)、超聲、微波方法和前述方法的任何組合。
14.權(quán)利要求13的方法，其中對所述提取的DNA進行純化以得到特定的靶DNA。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述提取的DNA通過選自以下的方法純化化學(xué)沉淀與 溶解、磁珠和與樹脂的親和力。
16.權(quán)利要求11的方法，其中所述RNA通過裂解細(xì)胞而從兩期細(xì)菌中提取。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述細(xì)胞通過選自以下的裂解方法裂解機械、化學(xué)、物 理、電學(xué)、超聲、微波方法和前述方法的任何組合。
18.權(quán)利要求11的方法，其中對所述提取的RNA進行純化以得到特定的靶RNA。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述提取的RNA通過選自以下的方法純化化學(xué)沉淀與 溶解、磁珠和與樹脂的親和力。
20.權(quán)利要求1的方法，其中通過將所述比率與參比曲線相比較而使所述比率等同于 相對致病性水平。
21.權(quán)利要求20的方法，其中通過用基于培養(yǎng)的平板計數(shù)方法在整個不同的生長期監(jiān) 測DNA和RNA的濃度而繪制所述參比曲線。
全文摘要
一種用于評價環(huán)境系統(tǒng)中兩期細(xì)菌的相對細(xì)菌毒力的方法，所述方法包括測定細(xì)菌的DNA濃度、測定細(xì)菌的RNA濃度、求出RNA濃度與DNA濃度的比率并將濃度比與相對致病性水平相關(guān)聯(lián)，其中所述細(xì)菌優(yōu)選為嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和李斯特菌屬(Lysteria)。
文檔編號C12Q1/68GK102105602SQ200980130497
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月30日
發(fā)明者K·楊, S·M·博伊特, 徐韡卿, 李潔, 陳靜 申請人:通用電氣公司