專利名稱：能夠與金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白結(jié)合的小分子多肽及其醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組小分子肽，具體涉及一組能夠與金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白TRAP(Target of RNAIII activating protein)結(jié)合的小分子肽，該結(jié)合肽能特異抑制金葡菌的毒素產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及這些小分子多肽在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(金葡菌)是一類常見的革蘭氏陽性致病菌，是引起燒傷及戰(zhàn)傷感染、肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、中毒性休克等致命性疾病的主要微生物之一。每年僅醫(yī)院內(nèi)感染金葡菌的人數(shù)就超過數(shù)百萬。目前臨床上對金葡菌的治療多采用聯(lián)合使用抗生素的辦法，但是效果并不理想。由于金葡菌極易產(chǎn)生耐藥性且無好的解決方法，常用的許多抗生素對之無效，控制金葡菌感染是臨床醫(yī)學(xué)殛待解決的問題之一。
金葡菌的主要致病物質(zhì)是毒素，包括溶血毒素、殺白細(xì)胞素、腸毒素等。最新研究表明，金葡菌這些毒力因子的合成是受一種可調(diào)節(jié)RNA分子，及RNAIII控制的。RNAIII激活毒力因子的基因轉(zhuǎn)錄，通過堿基互補(bǔ)調(diào)節(jié)毒力因子的翻譯。在細(xì)菌生長的對數(shù)早期其RNAIII水平低，但到對數(shù)晚期RNAIII水平會增加40倍，而RNAIII的水平是由金葡菌自身分泌的蛋白RAP(RNAIIIactivating protein)即RNAIII激活蛋白調(diào)節(jié)的，故因子RAP又稱為金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持續(xù)分泌RAP，在RAP達(dá)到一定濃度后才有激活毒力因子產(chǎn)生的作用。沒有RAP產(chǎn)生的金葡菌本身并不致病。最新研究發(fā)現(xiàn)，RAP激活RNAIII的轉(zhuǎn)錄是通過一個21KD的蛋白TRAP(Target of RNAIIIactivating protein)介導(dǎo)的，當(dāng)TRAP蛋白的編碼基因被突變失活后，RAP不能夠激活RNAIII的轉(zhuǎn)錄。TRAP由167個氨基酸組成，具有His激酶活性。TRAP蛋白在金葡菌生長的早期開始磷酸化，在對數(shù)生長中期達(dá)到最大水平。在RAP作用后，通過自身磷酸化來進(jìn)行信號傳導(dǎo)，從而介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)RNAIII水平上升，加速金葡菌外毒素的分泌(Naomi B，et al，J.Biol.Chem 2001，2762658-2667)。2001的研究發(fā)現(xiàn)TRAP的抗體可以有效的降低金葡菌外毒素的分泌(Oleny V.et al.Peptides 2001，221621-1627)。由此可見TRAP蛋白在金葡菌的毒素表達(dá)調(diào)控也起著關(guān)鍵性的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一組能夠與金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白TRAP(Targetof RNAIII activating protein)結(jié)合的小分子肽，該結(jié)合肽能特異抑制金葡菌的毒素產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一目的是提供這些小分子多肽在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個目的，我們根據(jù)文獻(xiàn)報道的TRAP基因序列設(shè)計了特異性引物，從金葡菌菌株RN6390B中釣取了TRAP蛋白的編碼基因，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對TRAP進(jìn)行了表達(dá)。并以純化的TRAP蛋白為靶標(biāo)，利用噬菌體展示技術(shù)從隨機(jī)十二肽庫中篩選出能特異與TRAP蛋白結(jié)合的小分子多肽。本發(fā)明的多肽無論從來源還是從結(jié)構(gòu)上都是全新的，未見任何文獻(xiàn)報道。
本發(fā)明的能夠與金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白TRAP(Target of RNAIIIactivating protein)結(jié)合的小分子肽是具有以下氨基酸序列的多肽ATWSHHLSSAGLHWDPFSLSAYFP
ASTAHRHAFYWVSAFHHYSALADLATSHLHVRLPSKWHNEWWSPFPMDSHPWNAQRELSVDRMLLPFNLLALFAPWDTASFMLG其中大寫英文字母分別代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體的一種，即A代表丙氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，N代表天冬酰胺殘基，D代表天冬氨酸殘基，Q代表谷氨酰胺殘基，E代表谷氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，W代表色氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，F(xiàn)代表苯丙氨酸殘基，T代表蘇氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，G代表甘氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基，M代表甲硫氨酸殘基。
序列中的有些氨基酸可以根據(jù)氨基酸的相似性進(jìn)行相互替代，其中谷氨酰胺殘基(Q)，谷氨酸殘基(E)，天冬氨酸殘基(D)或天冬酰胺殘基(N)之間可以相互替代；色氨酸殘基(W)，酪氨酸殘基(Y)或苯丙氨酸殘基(F)之間可以相互替代；賴氨酸殘基(K)和精氨酸殘基(R)之間可以相互替代；絲氨酸殘基(S)和蘇氨酸殘基(T)之間可以相互替代；丙氨酸殘基(A)和甘氨酸殘基(G)之間可以相互替代；亮氨酸殘基(L)和甲硫氨酸殘基(M)之間可以相互替代。
具有上述結(jié)構(gòu)模式的多肽能夠與金葡菌毒力刺激因子RAP的結(jié)合蛋白TRAP特異結(jié)合，并抑制其活性。具體表現(xiàn)為，在體外具有上述結(jié)構(gòu)模式的多肽無論是以何種形式如展示在噬菌體或其他微生物上、或體外化學(xué)合成、或用基因工程方法重組表達(dá)，都能夠與TRAP特異結(jié)合，并抑制TRAP的磷酸化，降低金葡菌毒素的產(chǎn)生。
本發(fā)明的小分子多肽可通過現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)合成或用基因工程重組表達(dá)的方法制得。
傳統(tǒng)抗生素治療產(chǎn)生抗藥性的原因主要是用藥后細(xì)菌在生存壓力下產(chǎn)生分解抗生素中有效基團(tuán)的誘導(dǎo)酶。本發(fā)明利用特異抑制TRAP活性的多肽建立的治療金葡菌感染方案，由于不殺滅細(xì)菌而使細(xì)菌的致病性喪失，所以不會象傳統(tǒng)抗生素治療那樣對細(xì)菌產(chǎn)生選擇壓力而產(chǎn)生抗藥株，這就為一直困擾臨床的抗藥性金葡菌感染這一常見、多發(fā)且有致命性的疾病的治療找到新的出路。


圖1為純化的TRAP蛋白SDS-PAGE電泳2為Western Blot鑒定TRAP蛋白圖3為不同滴度的序列1噬菌體對RN6390B菌株TRAP蛋白的磷酸化水平的影響圖4為不同滴度的序列1噬菌體作用后的金葡菌上清對MDBK生長影通過體內(nèi)磷酸化水平的檢測，發(fā)現(xiàn)這些小分子多肽可以有效地降低TRAP在RN6390B中的磷酸化水平，同時通過MDBK細(xì)胞模型檢測發(fā)現(xiàn)所篩選獲得的小分子多肽可以有效的降低金葡菌外毒素的分泌水平，為治療金葡菌感染開辟了新的途徑，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個目的。本發(fā)明對研制新型抗金葡菌感染的小分子多肽藥物具有重要意義，并具有廣泛的應(yīng)用價值及廣闊的市場前景。
具體實(shí)施例方式
下面以序列1為實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實(shí)施例1.TRAP蛋白的基因工程表達(dá)及分離純化將鑒定正確的大腸桿菌TRAP基因連接至表達(dá)載體，在大腸桿菌中獲得表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定發(fā)現(xiàn)在上清和包涵體中都有目的蛋白的條帶，其中上清中的目的蛋白占總量的50％以上。將帶有His標(biāo)簽的目的蛋白通過金屬螯合柱純化，SDS-PAGE檢測，分子量約23kD，純度＞90％。用凝血酶將His標(biāo)簽切割下來，純化的TRAP蛋白分子量約21kD，純度＞95％。(見附圖1，圖中1表示分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2表示純化的TRAP蛋白)。
實(shí)施例2.純化的TRAP蛋白的鑒定通過WESTEN BLOT檢測我們純化的TRAP蛋白能與TRAP蛋白多抗發(fā)生特異性的反應(yīng)(附圖2)實(shí)施例3.TRAP結(jié)合肽的篩選首先用100μl純化的TRAP蛋白包被于酶聯(lián)板，置4℃過夜。經(jīng)過2％的明膠封閉1h后，加入噬菌體十二肽庫，室溫孵育1h，用TBST(50mmol/LTris-HCl，0.1％TWEEN20，pH7.5)洗滌非特異結(jié)合的噬菌體，再用0.2mmol/L甘氨酸-HCl pH2.2洗脫特異結(jié)合的噬菌體，洗脫液用1mmol/L Tris-HCl pH9.0中和。按照試劑盒提供的方法，測定洗脫液中的噬菌體的滴度，以未包被的靶蛋白的洗脫噬菌體的滴度作為對照，測定投入產(chǎn)出比。同時將洗脫的與TRAP結(jié)合的噬菌體擴(kuò)增，并測定其下滴度，用于下一輪的篩選。經(jīng)過3輪篩選后，測定的投入產(chǎn)出有了明顯的提高。將富集的噬菌體克隆進(jìn)行ELISA鑒定，隨機(jī)挑取18個陽性克隆進(jìn)行測序。分析后得到包含序列1的上述9種結(jié)合肽。
實(shí)施例4.不同滴度的序列1噬菌體對RN6390B菌株TRAP蛋白磷酸化水平的影響將不同滴度的序列1噬菌體與RN6390B金葡菌共培養(yǎng)后，檢測TRAP蛋白磷酸化的水平，結(jié)果顯示序列1噬菌體能夠抑制RN6390B金葡菌TRAP磷酸化水平，隨著序列1克隆滴度的增加，TRAP蛋白的磷酸化水平降低(附圖3，圖中1表示無關(guān)噬菌體與金葡菌培養(yǎng)，2表示PBS與金葡菌培養(yǎng)，3表示1×1010序列1噬菌體和金葡菌共培養(yǎng)，4表示3×1010序列1噬菌體和金葡菌共培養(yǎng)，5表示6×1010序列1噬菌體和金葡菌共培養(yǎng))。
實(shí)施例5.利用細(xì)胞模型檢測序列1噬菌體克隆活性選擇不同滴度的序列1噬菌體克隆，利用了MDBK細(xì)胞模型測定其對金葡菌外毒素分泌水平的影響。結(jié)果顯示隨著噬菌體滴度的增加，金葡菌的培養(yǎng)上清對MDBK細(xì)胞的殺傷作用在逐漸降低，這表明該噬菌體能夠有效的抑制金葡菌外毒素的分泌(附圖4，圖中0表示正常金葡菌培養(yǎng)上清，1表示1×1010序列1噬菌體和金葡菌共培養(yǎng)上清，2表示3×1010序列1噬菌體和金葡菌共培養(yǎng)上清，3表示6×1010序列1噬菌體和金葡菌共培養(yǎng)上清)。
序列表<110> 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所海南通用同盟藥業(yè)有限公司<120> 能夠與金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白結(jié)合的小分子多肽及其醫(yī)藥用途<130>
<160> 9<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 12<212> PRT<213>
<400> 1Ala Thr Trp Ser His His Leu Ser Ser Ala Gly Leu1 5 10<210> 2<211> 12<212> PRT<213>
<400> 2His Trp Asp Pro Phe Ser Leu Ser Ala Tyr Phe Pro1 5 10<210> 3<211> 12<212> PRT<213>
<400> 3Ala Ser Thr Ala His Arg His Ala Phe Tyr Trp Val1 5 10<210> 4<211> 12<212> PRT
<213>
<400> 4Ser Ala Phe His His Tyr Ser Ala Leu Ala Asp Leu1 5 10<210> 5<211> 12<212> PRT<213>
<400> 5Ala Thr Ser His Leu His Val Arg Leu Pro Ser Lys1 5 10<210> 6<211> 12<212> PRT<213>
<400> 6Trp His Asn Glu Trp Trp Ser Pro Phe Pro Met Asp1 5 10<210> 7<211> 12<212> PRT<213>
<400> 7Ser His Pro Trp Asn Ala Gln Arg Glu Leu Ser Val1 5 10<210> 8<211> 12<212> PRT<213>
<400> 8Asp Arg Met Leu Leu Pro Phe Asn Leu Leu Ala Leu
1 5 10<210> 9<211> 12<212> PRT<213>
<400> 9Phe Ala Pro Trp Asp Thr Ala Ser Phe Met Leu Gly1 5 10
權(quán)利要求
1.能夠與金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白TRAP結(jié)合的小分子肽，具有下述(1)或(2)所述氨基酸序列(1)包含序列表所示氨基酸序列之一的氨基酸序列；(2)對(1)序列中的一個或幾個氨基酸殘基進(jìn)行替換而成的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的小分子肽，其特征在于它具有序列表所示氨基酸序列之一的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的小分子肽在制備抗金葡菌感染藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組能夠與金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白TRAP結(jié)合的小分子肽，這些小分子肽具有序列表所示氨基酸序列。本發(fā)明的多肽可用于制備新型抗金葡菌感染藥物。
文檔編號A61K38/00GK1569891SQ0315020
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月21日
發(fā)明者邵寧生, 楊光, 柳川, 高亞萍, 董潔, 丁紅梅, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 海南通用同盟藥業(yè)有限公司