專利名稱：：細(xì)胞編程和重編程的制作方法細(xì)胞編程和重編程相關(guān)串請(qǐng)本申請(qǐng)要求2008年6月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/061，525和2008年6月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/077，068的優(yōu)先權(quán)。這些申請(qǐng)的全部教導(dǎo)內(nèi)容在此引為參考。政府支持本發(fā)明全部或部分得到國(guó)立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)的資助5-R01-HD045022、5-R37-CA084198和5-R01-CA087869的支持。政府在本發(fā)明中具有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
：胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化被認(rèn)為是單方向途徑，因?yàn)樵诩?xì)胞命運(yùn)特化過程中細(xì)胞經(jīng)歷了發(fā)育潛能的逐步喪失。到目前為止，已知有兩類多能干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是直接來自于胚胎的多能干細(xì)胞。胚胎生殖細(xì)胞是直接來自于流產(chǎn)胎兒的胚胎組織的多能干細(xì)胞。為了簡(jiǎn)化，胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞在本文中將合稱為“ES”細(xì)胞。通過核移植(NT)產(chǎn)生活動(dòng)物，證實(shí)了體細(xì)胞、包括終末分化細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)是不穩(wěn)定的，并且可以被重置成能夠指導(dǎo)新生物體發(fā)育的胚胎狀態(tài)。核克隆技術(shù)對(duì)于移植醫(yī)學(xué)具有潛在價(jià)值，但是任何醫(yī)學(xué)應(yīng)用均受到克隆過程的低效率、對(duì)根本機(jī)制缺乏了解和倫理學(xué)擔(dān)憂的阻礙。解決這些問題的一個(gè)重要突破是Yamanaka通過異位表達(dá)四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子0ct4、SOX2、c-myc和Klf4(在后文中稱為“重編程因子”或“因子”)，體外衍生了重編程的體細(xì)胞(被命名為“誘導(dǎo)的多能干”細(xì)胞或“iPS”細(xì)胞)(Takahashi和Yamanaka，Cell126:663-676(2006))。通過建立用于重編程人類體細(xì)胞的穩(wěn)固方法并確定用于操作人類ES和iPS細(xì)胞的有效方案，將推動(dòng)重編程領(lǐng)域的進(jìn)一步進(jìn)步。發(fā)明概要總的來說，本發(fā)明涉及使分化的體細(xì)胞去分化；產(chǎn)生次級(jí)iPS細(xì)胞的方法和通過所述方法產(chǎn)生的次級(jí)iPS細(xì)胞；從所述次級(jí)iPS細(xì)胞產(chǎn)生的嵌合動(dòng)物例如小鼠；以及利用次級(jí)iPS細(xì)胞和嵌合動(dòng)物篩選重編程劑的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使分化的體細(xì)胞重編程到多能狀態(tài)的方法，所述方法包括下列步驟將分化的體細(xì)胞與至少一種有助于所述細(xì)胞重編程到多能狀態(tài)的重編程劑相接觸；將所述細(xì)胞在適合于細(xì)胞增殖和至少一種重編程劑的活性的條件下維持足以開始細(xì)胞的重編程的一段時(shí)間；以及功能性失活所述至少一種重編程劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使分化的體細(xì)胞重編程到多能狀態(tài)的方法，所述方法包括下列步驟提供含有至少一種外源導(dǎo)入的、有助于所述細(xì)胞重編程到多能狀態(tài)的因子的分化的體細(xì)胞；將所述細(xì)胞在適合于細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；以及功能性失活所述至少一種外源導(dǎo)入因子。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及篩選已被重編程到多能狀態(tài)的分化的體細(xì)胞的方法，所述方法包含下列步驟提供含有至少一種外源導(dǎo)入的、有助于細(xì)胞重編程到多能狀態(tài)的因子的分化的體細(xì)胞；將所述細(xì)胞在適合于細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；功能性失活所述至少一種外源導(dǎo)入因子；以及區(qū)分或辨別表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞和不表現(xiàn)它們的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，區(qū)分或辨別表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞和不表現(xiàn)它們的細(xì)胞，包含選擇或富集表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞，和/或選擇掉不表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，分化的體細(xì)胞是部分分化的。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，分化的體細(xì)胞是完全分化的。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，分化的體細(xì)胞是造血譜系的細(xì)胞或是間充質(zhì)干細(xì)胞；在某些實(shí)施方案中，分化的體細(xì)胞從外周血獲得。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，分化的體細(xì)胞是免疫系統(tǒng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，分化的體細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，分化的體細(xì)胞是淋巴樣細(xì)胞。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，分化的體細(xì)胞是B細(xì)胞，例如未成熟的(例如B-細(xì)胞原或前B-細(xì)胞)或成熟的(例如接觸過抗原的)B-細(xì)胞。在還有的其他實(shí)施方案中，分化的細(xì)胞是神經(jīng)祖細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞、角化細(xì)胞、肌肉細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述至少一種外源導(dǎo)入因子是多核苷酸。在其他實(shí)施方案中，所述至少一種外源導(dǎo)入因子是多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種外源導(dǎo)入因子選自0ct4、Sox2、Klf-4、Nanog、Lin28、c-Myc及其組合。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，分化的體細(xì)胞包含外源導(dǎo)入的0ct4、Sox2和Klf-4外源導(dǎo)入的0ct4、Sox2、Klf-4和c_Myc。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,所述至少一種外源導(dǎo)入因子選自0ct4、Sox2、Klf_4、c-Myc及其組合，并且分化的體細(xì)胞還包含至少一種能夠誘導(dǎo)分化的體細(xì)胞去分化的外源導(dǎo)入因子(例如多核苷酸或多肽)。在某些實(shí)施方案中，能夠誘導(dǎo)所述分化的體細(xì)胞去分化的因子選自至少一種下調(diào)B細(xì)胞晚期特異性標(biāo)志物的多核苷酸、至少一種抑制Pax5表達(dá)的多核苷酸、至少一種下調(diào)B細(xì)胞晚期特異性標(biāo)志物的多肽、至少一種抑制Pax5表達(dá)的多肽，及其組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，能夠誘導(dǎo)所述分化的體細(xì)胞去分化的因子是C/EBPa或C/EBPa的人類同系物。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，使用載體例如誘導(dǎo)型載體或條件表達(dá)型載體導(dǎo)入所述至少一種外源導(dǎo)入因子。在一種情況下，使用不進(jìn)行甲基化介導(dǎo)的沉默的載體導(dǎo)入所述至少一種外源導(dǎo)入因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用病毒載體例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體導(dǎo)入所述至少一種外源導(dǎo)入因子。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生克隆動(dòng)物的方法。在該方法中，從具有所需特征的動(dòng)物分離體細(xì)胞，并使用本發(fā)明的方法重編程以產(chǎn)生一種或多種重編程的多能體細(xì)胞(“RPSC”)。然后將RPSC插入到受體胚胎中，并將得到的胚胎培養(yǎng)以產(chǎn)生大小適合于移植到雌性受體中的胚胎，然后將其轉(zhuǎn)移到雌性受體中以產(chǎn)生懷孕的雌性。將懷孕的雌性維持在適合將胚胎懷到足月的條件下，以產(chǎn)生嵌合動(dòng)物后代。根據(jù)需要，嵌合動(dòng)物可以進(jìn)一步與野生型動(dòng)物交配。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的嵌合動(dòng)物，例如嵌合小鼠。本發(fā)明還涉及通過下述方法產(chǎn)生的分離的多能細(xì)胞，所述方法包含(a)提供分化的體細(xì)胞，所述細(xì)胞含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程到多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子；(b)將所述細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；(c)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活；以及(d)將表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞與不表現(xiàn)標(biāo)志物的細(xì)胞區(qū)分開。本發(fā)明還涉及純化的體細(xì)胞群，其包含至少70%的源自下述方法產(chǎn)生的重編程的分化體細(xì)胞的多能細(xì)胞，所述方法包含(a)提供分化的體細(xì)胞，所述細(xì)胞含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程到多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子；(b)將所述細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以開始所述細(xì)胞的重編程或活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；(c)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活；以及(d)將表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞與不表現(xiàn)標(biāo)志物的細(xì)胞區(qū)分開。另一方面，本發(fā)明涉及從體細(xì)胞生產(chǎn)多能細(xì)胞的方法，所述方法包含下列步驟(a)提供一種或多種體細(xì)胞，其各自含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程到多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子，其中所述外源導(dǎo)入因子使用不進(jìn)行甲基化誘導(dǎo)的沉默的誘導(dǎo)型載體導(dǎo)入；(b)將所述一種或多種細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以開始所述細(xì)胞的重編程或活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；(C)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活；(d)篩選表現(xiàn)出多能性標(biāo)志物的一種或多種細(xì)胞；(e)利用表現(xiàn)出多能性標(biāo)志物的所述一種或多種細(xì)胞產(chǎn)生嵌合胚胎；(f)從所述嵌合胚胎獲得一種或多種體細(xì)胞；(g)將所述一種或多種體細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以開始所述細(xì)胞的重編程或活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；以及(h)將表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞與不表現(xiàn)標(biāo)志物的細(xì)胞區(qū)分開。在具體實(shí)施方案中，方法產(chǎn)生了純化的體細(xì)胞群，其包含至少70%的源自于重編程的分化體細(xì)胞的多能細(xì)胞。本發(fā)明還涉及通過下述方法產(chǎn)生的分離的多能細(xì)胞(a)提供一種或多種體細(xì)胞，其各自含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程到多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子，其中所述外源導(dǎo)入因子使用不進(jìn)行甲基化誘導(dǎo)的沉默的誘導(dǎo)型載體導(dǎo)入；(b)將所述一種或多種細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以開始所述細(xì)胞的重編程或活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；(C)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活；(d)篩選表現(xiàn)出多能性的標(biāo)志物的一種或多種細(xì)胞；(e)利用表現(xiàn)出多能性的標(biāo)志物的所述一種或多種細(xì)胞產(chǎn)生嵌合胚胎；(f)從所述嵌合胚胎獲得一種或多種體細(xì)胞；(g)將所述一種或多種體細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；以及(h)將表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞與不表現(xiàn)標(biāo)志物的細(xì)胞區(qū)分開。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，方法產(chǎn)生了純化的體細(xì)胞群，其包含至少70%(例如70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%)的源自于重編程的分化體細(xì)胞的多能細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，多能細(xì)胞是遺傳上同質(zhì)的。本發(fā)明還涉及鑒定重編程劑的方法，所述方法包含(a)提供一種或多種體細(xì)胞，其各自含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程到多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子，其中每種所述外源導(dǎo)入因子的每一種都使用不進(jìn)行甲基化誘導(dǎo)的沉默并且其表達(dá)受到由不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的調(diào)控元件控制的誘導(dǎo)型載體導(dǎo)入；(b)將所述一種或多種細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以使所述細(xì)胞進(jìn)行重編程或活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；(C)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活；(d)篩選表現(xiàn)出多能性的標(biāo)志物的一種或多種細(xì)胞；(e)利用表現(xiàn)出多能性的標(biāo)志物的所述一種或多種細(xì)胞產(chǎn)生嵌合胚胎；(f)從所述嵌合胚胎獲得一種或多種體細(xì)胞；(g)將所述一種或多種體細(xì)胞維持在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下，其中所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性本身不足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因；(h)將(g)的體細(xì)胞與一種或多種候選重編程劑接觸；以及(i)鑒定與所述一種或多種候選重編程劑接觸過的、表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞，其中誘導(dǎo)(g)的體細(xì)胞表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的候選重編程劑，被鑒定為重編程劑。本發(fā)明還涉及利用已知的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)的方法。作為一個(gè)實(shí)例，包涵了誘導(dǎo)型載體，例如DOX和三苯氧胺誘導(dǎo)型慢病毒載體。DOX誘導(dǎo)型反轉(zhuǎn)錄病毒載體，對(duì)于確定小鼠體細(xì)胞重編程過程中多能性標(biāo)志物的順序活化和載體表達(dá)的最少時(shí)間是重要的。正如本文所述，我們產(chǎn)生了允許重編程因子的暫時(shí)受限表達(dá)的誘導(dǎo)型慢病毒載體。按照與用于鼠類基因相同的策略，我們產(chǎn)生了組成型或在DOX誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制之下轉(zhuǎn)導(dǎo)人類0CT4、S0X2、KLF4和C-MYCc-DNA的慢病毒載體。為了產(chǎn)生DOX誘導(dǎo)型系統(tǒng)，我們用帶有rtTA反式激活子的慢病毒載體感染人類成纖維細(xì)胞。為了獲得載體的獨(dú)立的誘導(dǎo)型控制，我們還通過將因子與雌激素配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，產(chǎn)生了0CT4、S0X2和C-MYC雌激素受體(ER)融合構(gòu)建物，以允許三苯氧胺依賴性表達(dá)。向轉(zhuǎn)導(dǎo)有S0X2-ER融合構(gòu)建物的細(xì)胞添加三苯氧胺，導(dǎo)致S0X2蛋白從細(xì)胞質(zhì)移位到核中，正如對(duì)于藥物誘導(dǎo)的活化所預(yù)期的。這些結(jié)果顯示DOX和ER融合誘導(dǎo)型系統(tǒng)可用于獨(dú)立地控制被轉(zhuǎn)導(dǎo)的因子的表達(dá)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及多個(gè)、例如兩個(gè)不同的可調(diào)控系統(tǒng)的應(yīng)用，每個(gè)系統(tǒng)控制部分因子的表達(dá)。例如，人們可以將3種因子置于第一個(gè)誘導(dǎo)型(例如dox誘導(dǎo)型)啟動(dòng)子的控制之下，并將第四個(gè)因子置于第二個(gè)誘導(dǎo)型(例如三苯氧胺誘導(dǎo)型)啟動(dòng)子的控制之下。然后，人們可以通過從這兩個(gè)啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)來產(chǎn)生iPS細(xì)胞，從該iPS細(xì)胞產(chǎn)生小鼠，并從小鼠分離成纖維細(xì)胞(或任何其他細(xì)胞類型)。這些成纖維細(xì)胞將是遺傳上同質(zhì)的，并且不需要病毒感染即可重編程。然后人們可以嘗試在只有第一個(gè)啟動(dòng)子有活性的條件下，在可能能夠代替第四種因子的不同小分子的存在下，重編程成纖維細(xì)胞，以便鑒定小分子“重編程劑”，或優(yōu)化瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或其他用于導(dǎo)入第四種因子的方案。許多變化形式是可能的；例如，人們可以穩(wěn)定地誘導(dǎo)3種因子的表達(dá)，并瞬時(shí)誘導(dǎo)第四種因子的表達(dá)等。使用所述方法可以評(píng)估因子的任何組合。此外，人們可以通過使用不同濃度的誘導(dǎo)劑調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平。另一種途徑是將編碼一種因子的基因置于重組酶位點(diǎn)之間，然后誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)以關(guān)閉該因子的表達(dá)。例如，可以將異源序列放置在啟動(dòng)子與編碼序列之間，其中異源序列位于重組酶位點(diǎn)之間；異源序列阻止表達(dá)。將重組酶導(dǎo)入細(xì)胞(例如通過導(dǎo)入編碼重組酶的表達(dá)載體，例如腺病毒-Cre)，引起異源序列的切除，從而允許轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。此外，轉(zhuǎn)基因可以整合在各種不同的非必需基因座中(例如其破壞不顯著影響發(fā)育的基因座，例如膠原蛋白I或Rosa26基因座)。這些系統(tǒng)可用于例如鑒定重編程劑以及研究在重編程中的必要條件和發(fā)生的事件(包括發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類型特異性差異)。附圖簡(jiǎn)沭圖1A-1D顯不了用于表觀遺傳重編程的遺傳同質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)生。圖IA顯示了用編碼4種重編程因子的dox誘導(dǎo)型慢病毒感染嘌呤霉素抗性的、表達(dá)反四環(huán)素反式激活因子(M2rtTA)的Nanog-GFP或Nanog-neo初級(jí)MEF，然后誘導(dǎo)重編程、進(jìn)行初級(jí)iPS集落篩選、dox撤回、嵌合體形成以及用嘌呤霉素篩選iPS衍生的次級(jí)體細(xì)胞的方案。圖IB示出了從經(jīng)歷了完全表觀遺傳重編程的嵌合體分離NNeo次級(jí)MEF。不依賴于Dox的培養(yǎng)物表達(dá)與多能性相關(guān)的基因堿性磷酸酶、SSEAl和Nanog。圖IC顯示了MEF衍生的NNeo和NGFP2次級(jí)iPS細(xì)胞在畸胎瘤形成分析中產(chǎn)生所有三個(gè)胚層的細(xì)胞，并且當(dāng)被注射到囊胚中時(shí)，有助于嵌合體形成，正如在黑色背景上存在iPS衍生的深淺環(huán)紋毛皮顏色所顯示的(圖1D)。圖2A-2E顯示了在來自不同iPS細(xì)胞系的MEF之間重編程動(dòng)力學(xué)和效率的變化。正如圖2A中所示，將來自三種“初級(jí)”iPS細(xì)胞系的次級(jí)MEF用dox處理，并目測(cè)監(jiān)測(cè)重編程。在dox給藥后6天，不同MEF群表現(xiàn)出形態(tài)差異，但是在12天內(nèi)都形成具有ES細(xì)胞形態(tài)的集落(箭號(hào))。圖2B顯示了當(dāng)早在dox誘導(dǎo)后第4天向培養(yǎng)基加入藥物時(shí)，在NNeo培養(yǎng)物中出現(xiàn)新霉素抗性和堿性磷酸酶陽性的集落。圖2C顯示了在18天的dox培養(yǎng)過程中，SSEAl和Nanog-GFP報(bào)告等位基因(在NGFP2和NGFP3細(xì)胞系中)的重新活化的流式細(xì)胞術(shù)分析。如圖2D中所示，將次級(jí)NGFP2MEF以0.025-500個(gè)細(xì)胞/mm2的不同密度鋪板，然后添加dox。在4周后對(duì)GFP+集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。正如在圖2E中所示，將單一次級(jí)MEF鋪在含有Y-射線輻照過的MEF飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板中，然后進(jìn)行dox誘導(dǎo)。在4周后對(duì)能夠增殖到足以在MEF飼養(yǎng)細(xì)胞層上形成可見集落的單細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(淺灰色條)以及能夠形成GFP+或Neo抗性的次級(jí)iPS集落的單細(xì)胞的百分率(深灰色條)進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖3A-3F顯示了4種因子的轉(zhuǎn)基因在次級(jí)MEF中的必要條件和表達(dá)。圖3A顯示了定量RT-PCR，檢測(cè)了相對(duì)于Gapdh的水平，4種重編程因子對(duì)72小時(shí)的dox處理做出響應(yīng)而表達(dá)的誘導(dǎo)。圖3B顯示了dox誘導(dǎo)后72小時(shí)在次級(jí)MEF培養(yǎng)物中0ct4和Sox2的免疫熒光檢測(cè)。正如圖3C中所示，將NGFP2次級(jí)MEF在dox存在下培養(yǎng)指定時(shí)間(5_22天，紅色條)，然后撤回dox。每日監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物以發(fā)現(xiàn)GFP活化的第一次出現(xiàn)(綠色條)。藍(lán)色條顯示了在dox處理過程中出現(xiàn)GFP+集落的時(shí)間段。圖3D顯示了將NGFP2MEF在dox存在下培養(yǎng)10-15天，在這時(shí)撤回dox，并在第34天對(duì)GFP+集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。正如在圖3E中所示，將NGFP2MEF在dox存在下培養(yǎng)9天(藍(lán)色線)或22天(紅色線)，并且每天對(duì)GFP+集落的出現(xiàn)進(jìn)行計(jì)數(shù)直到第29天。注意到GFP陽性集落遲至dox撤回后15天才出現(xiàn)(藍(lán)色線)。正如圖3F中所示，將NGFP3次級(jí)MEF在存在或不存在dox、dox+5-Aza或dox+TSA的情況下培養(yǎng)，在3周后對(duì)GFP+集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖4A-4N顯示了腸上皮細(xì)胞的重編程。如圖4A中所示，從嵌合體分離NNeo次級(jí)腸上皮隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)，并且在存在dox下培養(yǎng)24小時(shí)后，在懸液中開始出現(xiàn)球狀體(圖4B，插圖)。圖4C顯示了在dox培養(yǎng)72小時(shí)內(nèi)，懸浮的球狀體附著于Y-射線輻照過的飼養(yǎng)細(xì)胞層，并呈現(xiàn)出ES樣形態(tài)。如圖4D中所示，在兩周的dox處理過程中集落繼續(xù)生長(zhǎng)，但是在dox撤回后分化并變得不可與飼養(yǎng)細(xì)胞層區(qū)分(圖4E)。圖4F顯示了在dox給藥、后兩周，SOX依賴性的腸上皮集落是新霉素抗性的。圖4G顯示了在用Sox2和Klf4病毒感染后，在新鮮分離的NNeo次級(jí)腸上皮、部分重編程的dox依賴性細(xì)胞、完全重編程的NNeoiPS細(xì)胞中進(jìn)行的內(nèi)源0ct4和Nanog啟動(dòng)子的亞硫酸氫鹽測(cè)序。如圖4H中所示，4種因子和Nanog的表達(dá)的qRT-PCR分析顯示，dox依賴性NNeo腸上皮集落與ES細(xì)胞相比表達(dá)高水平的0ct4和cMyc，但是表達(dá)非常少量的Sox2和Klf4。圖41顯示了在添加dox的24小時(shí)內(nèi)，NGFP2次級(jí)腸上皮細(xì)胞在懸液中形成球狀體，并在72小時(shí)內(nèi)呈現(xiàn)出ES樣形態(tài)(圖4J)。圖4K和4L顯示NGFP2腸上皮產(chǎn)生dox不依賴性的次級(jí)iPS集落，其從內(nèi)源Nanog基因座表達(dá)GFP。如圖4M中所示，基于EDTA-DTT將腸絨毛分級(jí)成從末梢的分化細(xì)胞(級(jí)份I)到隱窩的祖細(xì)胞(級(jí)份7)28，然后進(jìn)行4天的dox誘導(dǎo)，證明了NNeo和NGFP2次級(jí)細(xì)胞系二者中的隱窩級(jí)份在初始集落形成中更加有效。如圖4N中所示，qRT-PCR分析顯示除了Klf4之外，其他轉(zhuǎn)基因在NNeo和NGFP2腸上皮細(xì)胞的級(jí)份7(隱窩)中比在級(jí)份I(絨毛尖端)中被更有效地誘導(dǎo)。圖5A-5L顯示了其他體細(xì)胞類型的重編程。圖5A和5B顯示了在dox給藥三周之前和之后的NNeo間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。圖5C和顯示了dox處理之前的NGFP2MSC和處理10天之后形成ES樣集落。圖5E和5F顯示出NGFP2MSC產(chǎn)生dox不依賴性iPS集落，其從內(nèi)源Nanog基因座表達(dá)GFP。如圖5G中所示，來自具有典型上皮形態(tài)的NNeo嵌合體的皮膚角化細(xì)胞的集落(插圖)在dox處理12天內(nèi)開始表現(xiàn)出ES細(xì)胞的形態(tài)(圖5H)。這些細(xì)胞被完全重編程以形成新霉素抗性的次級(jí)iPS集落(圖51)。如圖5J中所示，在無血清培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，鋪板的NNeo衍生的神經(jīng)球容易對(duì)含dox和血清的ES細(xì)胞培養(yǎng)基做出響應(yīng)分化成星型細(xì)胞。當(dāng)將鋪板的神經(jīng)球細(xì)胞在粘附條件下用EGF和FGF2繼續(xù)擴(kuò)增3周并然后暴露于含dox的培養(yǎng)基時(shí)，在ES細(xì)胞(圖5K)和無血清培養(yǎng)基(圖5L)中都出現(xiàn)了iPS細(xì)胞樣集落。圖6顯示了完全重編程的NGFP2次級(jí)MEF重新活化內(nèi)源Nanog基因座，表達(dá)0ct4、AP和SSEAl，并且能夠在不存在dox下維持。圖7A-7C顯示了附加分析。圖7A顯示了在對(duì)dox處理做出響應(yīng)進(jìn)行重編程的時(shí)間過程中，NGFP2MEF中內(nèi)源性0ct4、Sox2、Klf4和c_Myc轉(zhuǎn)錄本的qRT-PCR分析。還顯示了在兩個(gè)ES細(xì)胞RNA制備物(V6.5系)和NGFP2iPS細(xì)胞系中的表達(dá)水平。圖7B顯示了直接感染和次級(jí)系統(tǒng)之間iPS集落形成效率的實(shí)驗(yàn)間變異性的比較。在IOcm平板上，將3xl05個(gè)0ct4_neoMEF1用由基于Moloney的反轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼的4種因子進(jìn)行感染，在第6天時(shí)開始新霉素篩選，并在第20天對(duì)抗性集落進(jìn)行計(jì)數(shù)(左側(cè)-直接感染)。將3xl04個(gè)次級(jí)NGFP2MEF鋪板在6孔皿中，暴露于含dox的培養(yǎng)基，并在3周后對(duì)GFP陽性集落進(jìn)行計(jì)數(shù)(右側(cè)-次級(jí)系統(tǒng))。條顯示了4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的每個(gè)中的集落數(shù)量。圖7C顯示了用Klf4、c-Myc、Sox2和0ct4cDNA探針對(duì)次級(jí)iPS細(xì)胞系NGFP3、NGFP2和NNeo進(jìn)行的Southern分析。內(nèi)源條帶用箭號(hào)標(biāo)出，原病毒插入片段用箭頭標(biāo)出，只有NNeo細(xì)胞系中的0ct4例外，其是靶向膠原蛋白I基因座的轉(zhuǎn)基因。圖8A-8D顯示圖8A顯示了NGFP2次級(jí)尾梢成纖維細(xì)胞成功地重編程成dox不依賴性的GFP+iPS細(xì)胞。圖8B顯示出源自于NGFP2次級(jí)腸上皮的iPS細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性Nanog和SSEA1。圖8C顯示出源自于NGFP2次級(jí)間充質(zhì)干細(xì)胞的iPS細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性Nanog和SSEAl0如圖8D中所示，將帶有位于Rosa26基因座處的反四環(huán)素反式激活子和Tet-操縱子16控制下的0ct4編碼序列的初級(jí)間充質(zhì)干細(xì)胞用編碼Sox2、c-Myc和Klf4的病毒感染。向被感染的MSC添加dox，產(chǎn)生了完全重編程的、dox不依賴性的、表達(dá)內(nèi)源Nanog蛋白(免疫熒光)的iPS細(xì)胞。圖9A-9G顯示了源自于NNeo次級(jí)嵌合體的腎上腺(圖9A)、腎臟(圖9B)、肌肉(圖9C)、角化細(xì)胞(圖9D)和神經(jīng)球(圖9E)的細(xì)胞培養(yǎng)物的成功重編程，重編程的成功由dox不依賴性、新霉素抗性和Nanog表達(dá)(紅色，免疫熒光)所確定。圖9F顯示了從NNeo嵌合體分離并在dox存在下培養(yǎng)8、10或12天并對(duì)堿性磷酸酶活性進(jìn)行染色的次級(jí)腸上皮。如圖9G中所示，在用附加的Sox2和Klf4病毒感染后，NNeo次級(jí)腸上皮細(xì)胞變成了dox不依賴性的iPS細(xì)胞。免疫熒光分析(紅色，上排)顯示了0ct4、Sox2、Nanog和SSEAl在完全重編程的細(xì)胞中的表達(dá)(藍(lán)色，下排表示核DAPI染色)。圖10A-10D顯示了GFP同源插入到0CT4基因座中。如圖IOA所示，將H9huES細(xì)胞用靶向0CT4基因座的3'UTR的GFP-puroR基因捕獲載體進(jìn)行電穿孔。通過Southern分析(圖10B)所鑒定到的正確靶向克隆對(duì)GFP染色，在非分化時(shí)是puix)抗性的(圖10C、10D)，但是當(dāng)分化時(shí)標(biāo)志物和藥物抗性基因被沉默(未顯示)。圖11A-11B顯示了可用DOX和三苯氧胺誘導(dǎo)的因子表達(dá)。正如圖IlA中所示，將人類成纖維細(xì)胞用帶有可用DOX誘導(dǎo)的因子的慢病毒載體感染(Brambrink等，CellStemCell,Feb7,2(2):151-159(2008))。當(dāng)向培養(yǎng)物加入DOX時(shí)，通過qPCR進(jìn)行的分析檢測(cè)到了強(qiáng)的因子表達(dá)，而在不存在DOX的情況下如果有的話也只能看到很少的轉(zhuǎn)錄本。此外，源自于被感染的成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞也顯示出DOX依賴性表達(dá)(右邊的兩個(gè)圖塊)。正如在圖IlB中所示，將成纖維細(xì)胞用含有S0X2-ER融合構(gòu)建物的載體進(jìn)行感染。向培養(yǎng)基添加三苯氧胺導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)蛋白向核移位，顯示出藥物依賴性的蛋白活化。圖12A-12C顯示了從人類成纖維細(xì)胞產(chǎn)生iPS細(xì)胞。如圖12A中所示，通過qPCR對(duì)0CT4和NANOG表達(dá)進(jìn)行定量，并顯示出它們?cè)谂c對(duì)照huES細(xì)胞中的類似范圍內(nèi)。圖12B顯示了從成年人類成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的iPS細(xì)胞的實(shí)例。人類iPS細(xì)胞形成緊密集落，并對(duì)SSEA4.TRA160和0CT4進(jìn)行染色。圖12C顯示了在將iPS細(xì)胞注射到SCID小鼠中以后形成的具有分化的細(xì)胞類型的畸胎瘤。圖13A-13C顯示了在通過多順反子反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)四種因子后，小鼠成纖維細(xì)胞的重編程。圖13A顯示了載體的示意圖，所述載體帶有各自被2A序列分離開的四種轉(zhuǎn)錄因子Sox2、0ct4、Klf4和c-myc，或3種或2種因子的各種不同組合。如圖13B中所示，將成纖維細(xì)胞用圖塊上部顯示的4因子多順反子載體和單一0ct4病毒共感染。重編程的iPS細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶(AP),SSEAUNanog和0ct4。圖13C顯示了對(duì)3個(gè)獨(dú)立的iPS系的原病毒整合的Southern印跡分析的結(jié)果。將DNA用在載體的PBS中切開一次(每個(gè)原病毒給出I條帶)的Spel消化,并用Sox2、Klf4、c-myc和0ct4探針相繼探測(cè)印跡。細(xì)胞系4F0#5和#9帶有一個(gè)、細(xì)胞系4F0#14帶有兩個(gè)多順反子載體(后者中的一個(gè)是截短的并已失去5'cMYC序列)。但是，使用0ct4探針的雜交顯示出8到11個(gè)另外的0ct4原病毒。圖14A-14E顯示了使用單個(gè)4F2A多順反子病毒產(chǎn)生鼠類iPS細(xì)胞。圖14A顯示了通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測(cè)試的FUW慢病毒構(gòu)建物(也在前面的圖中顯示過)?？偣彩褂昧?個(gè)2A肽(F2A、T2A、E2A和P2A)。圖14B顯示了293細(xì)胞用FUW2A慢病毒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在48小時(shí)后收獲細(xì)胞，并通過western印跡(WB)進(jìn)行分析。在所有測(cè)試的構(gòu)建物中觀察到了有效的蛋白表達(dá)，表明四個(gè)獨(dú)特的2A肽支持強(qiáng)有力的蛋白表達(dá)。注意在ES細(xì)胞中沒有檢測(cè)到Sox2蛋白，這是因?yàn)橹皇褂昧硕瘫┞丁D14C顯示了包含3種類型的2A肽(P2A、T2A和E2A)的4F2ADOX-誘導(dǎo)型慢病毒的示意圖。鼠類的0ct4、Sox2、Klf4和c_Myc的cDNA。因子和2A肽的這種特定序列在后文中被稱為“4F2A”。圖14D顯示了在用OSKM4F2A+rtTA轉(zhuǎn)導(dǎo)3天的細(xì)胞中mRNA誘導(dǎo)的RT-PCR分析?？偟?ct4或Sox2誘導(dǎo)被用于測(cè)試與ES細(xì)胞相比的4F2A誘導(dǎo)水平。使用E2A-cMyc引物檢測(cè)病毒特異性轉(zhuǎn)錄本。誤差線表示三份平行反應(yīng)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖14E顯示了用4F2A+rtTA轉(zhuǎn)導(dǎo)3天的MEF的Western印跡分析結(jié)果。用4F2ADOX誘導(dǎo)型慢病毒+rtTA感染的細(xì)胞在添加強(qiáng)力霉素DOX后產(chǎn)生所有四種重編程因子。圖15A-15C顯示了4F2AiPS細(xì)胞表達(dá)多能性標(biāo)志物。如圖15A中所示，0ct4蛋白的免疫染色表明使用4F2A能夠?qū)崿F(xiàn)高滴度的感染。在用4F2A+rtTA轉(zhuǎn)導(dǎo)后，將MEF在DOX培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。圖15B顯示了用4F2A+rtTA轉(zhuǎn)導(dǎo)的NanogGFP-MEF在ES培養(yǎng)基+DOX中培養(yǎng)的形態(tài)變化。與用單一病毒感染的細(xì)胞相似，集落在8天時(shí)出現(xiàn)。在第20天時(shí)除去DOX培養(yǎng)基后，到第25天時(shí)觀察到NanogGFP+集落。兩個(gè)列顯示了在平板上觀察到的典型集落。圖15C顯示了從Nanog-GFPMEF或14周的尾梢成纖維細(xì)胞(TTF)產(chǎn)生的4F2AiPS細(xì)胞系，其對(duì)多能性標(biāo)志物AP、SSEAl、0ct4染色陽性，并已經(jīng)重新活化了內(nèi)源Nanog基因座(對(duì)于MEF來說GFP+，對(duì)于TTF來說通過免疫染色)。圖16A-16C顯示了4F2AiPS細(xì)胞是多能的，并包含1_3個(gè)原病毒整合。圖16A顯示了4F2AMEF-iPS細(xì)胞系#1、2和4的體內(nèi)分化。在皮下注射到SCID小鼠后誘導(dǎo)的畸胎瘤的組織學(xué)分析表明，iPS細(xì)胞系對(duì)所有三個(gè)胚層都有貢獻(xiàn)。圖16B顯示了對(duì)出生后嵌合小鼠的中度到高度的貢獻(xiàn)，正如通過來自4F2AiPS細(xì)胞系M的深淺環(huán)紋毛皮顏色所檢測(cè)到的。圖16C顯示了MEF-iPS細(xì)胞系#1-4中4F2A原病毒整合的Southern印跡分析的結(jié)果。將iPS細(xì)胞DNA用BamHI消化。使用所有四種探針對(duì)同樣分子量片段的雜交表明存在4F2A原病毒。紅色箭號(hào)突出了含有4F2A的一個(gè)原病毒拷貝的iPS細(xì)胞株#4。*表示內(nèi)源等位基因。圖17A-17E顯示了使用單個(gè)4F2A多順反子病毒產(chǎn)生人類iPS細(xì)胞系。圖17A顯示了用4F2A(帶有小鼠cDNA)+rtTA轉(zhuǎn)導(dǎo)的新生人類包皮角化細(xì)胞(NHFK)。在第22天，挑出單個(gè)集落并擴(kuò)增，產(chǎn)生類似hES集落的集落。將這些集落挑出并建立起穩(wěn)定的hiPS細(xì)胞系。圖17B顯示了對(duì)多能性標(biāo)志物AP、0ct4、Nanog、SSEA-4、Tral-60和Tral-81免疫染色的KerhiPS#l.I。DAPI染色在下方圖塊中。圖17C顯示出KerhiPS#l.I的核型是正常的46XY。圖17D顯示了KerhiPS#l.I的體內(nèi)分化。由KerhiPS#l.I產(chǎn)生的畸胎瘤切片的蘇木精和曙紅染色。圖17E顯示了KerhiPS#l.I的體外分化。(左圖)源自于Ker_iPS#l.I的神經(jīng)元前體暴露于分化條件下6天產(chǎn)生了終末分化的神經(jīng)元,正如通過抗Tujl抗體免疫染色(綠色)所檢測(cè)到的。(右圖)Ker-iPS#l.I神經(jīng)元前體(NP)經(jīng)歷了自發(fā)分化。NP通過抗Nestin抗體免疫染色檢測(cè)，分化的神經(jīng)元通過抗Tujl抗體(紅色)檢測(cè)。在兩張照片中DNA的DAPI染色都是藍(lán)色。圖18A-18B顯示了源自于MEF的iPS細(xì)胞系的Southern印跡和dox撤回，表明8天對(duì)于產(chǎn)生iPS細(xì)胞系是足夠的。圖18A顯示了4F2AMEFiPS細(xì)胞系的Southern印跡分析。進(jìn)行了第二次消化(XbaI)以證實(shí)原病毒的拷貝數(shù)。在該消化中，iPS細(xì)胞系#2和#4顯示了I個(gè)原病毒拷貝，但是只有#4在兩種消化中都具有I個(gè)原病毒拷貝。圖18B顯示了在將NanogGFPMEF用rtTA+OSKM感染后8天后撤回Dox，產(chǎn)生了兩種iPS細(xì)胞系。這兩種在1-2次傳代后都產(chǎn)生穩(wěn)定的iPS細(xì)胞系。圖19顯示了在MEF中使用4F2A重編程的相對(duì)效率。將NanogGFPMEF用4F2A+rtTA感染，并在ES培養(yǎng)基(+/-D0X)中培養(yǎng)48小時(shí)。將細(xì)胞固定，并對(duì)0ct4蛋白進(jìn)行染色。估算的感染效率是70%。也使用同樣的病毒感染0.25xl06個(gè)NanogGFPMEF，并將細(xì)胞在DOX上培養(yǎng)20天。在第20天撤回DOX后，在第25天對(duì)GFP+集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，在三個(gè)板中觀察到10、10和17個(gè)GFP+集落。圖20A-20B顯示了源自于角化細(xì)胞的人類iPS細(xì)胞系的感染效率和多能性分析。圖20A顯示了在用4F2A+rtTA感染并在hES培養(yǎng)基+DOX中培養(yǎng)48小時(shí)的角化細(xì)胞中通過0ct4免疫染色檢測(cè)到的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的感染效率?；?ct4蛋白陽性的細(xì)胞分?jǐn)?shù)，感染的效率為10-20%。圖20B顯示了對(duì)hES細(xì)胞中表達(dá)的多能性標(biāo)志物染色陽性的人類iPS細(xì)胞系(顯示的是KeriPS#3)。圖21A-21B顯示了源自于角化細(xì)胞的人類iPS細(xì)胞系的原病毒拷貝數(shù)。圖21A顯示了Ker-iPS細(xì)胞系的Southern印跡分析。收獲IOmg基因組DNA并用XbaI消化。相同分子量片段的雜交表明存在4F2A原病毒。針對(duì)Sox2、Klf4和c-Myc的探針表明2個(gè)(#1.I)和I個(gè)(#3)原病毒拷貝。在兩個(gè)iPS細(xì)胞系之間觀察到的共同條帶不是病毒整合，因?yàn)樗鼈冊(cè)醋杂讵?dú)立的感染。圖21B顯示了Ker-iPS細(xì)胞系的Southern印跡分析。收獲IOmg基因組DNA并用BamHI消化。相同分子量片段的雜交表明存在4F2A原病毒。針對(duì)0ct4和c-Myc的探針表明3個(gè)(#1.I)和2個(gè)(#3)原病毒拷貝。圖22顯示了用于在確定的基因組位置處產(chǎn)生帶有單一多順反子構(gòu)建物的iPS細(xì)胞的策略。圖23A-23B顯示了攜帶DOX誘導(dǎo)型載體、不需病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)即可重編程的次級(jí)成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生。如圖23A中所示，使用DOX誘導(dǎo)型載體以及帶有tetrtTA反式激活子的載體將用所有四種因子轉(zhuǎn)導(dǎo)在0CT4基因座中帶有GFP的“初級(jí)”成纖維細(xì)胞，在DOX誘導(dǎo)后產(chǎn)生了“初級(jí)”iPS細(xì)胞。細(xì)胞在不存在DOX的情況下分化成“次級(jí)”成纖維細(xì)胞，其帶有與允許初級(jí)iPS細(xì)胞產(chǎn)生的相同的載體組合。如圖23B中所示，將次級(jí)成纖維細(xì)胞重編程到次級(jí)iPS細(xì)胞，只需要用DOX誘導(dǎo)原病毒而不需要用新的病毒進(jìn)行感染。圖24顯示了不需載體介導(dǎo)的因子轉(zhuǎn)導(dǎo)即可進(jìn)行的重編程。初級(jí)成纖維細(xì)胞從huES細(xì)胞產(chǎn)生，后者帶有0CT4-GFP標(biāo)志物、tet反式激活子M2rtTA和圖13中描述的插入到COLlAl基因座中表達(dá)三種重編程因子(在本例中是0CT4、S0X2、cMYC)的DOX誘導(dǎo)型多順反子構(gòu)建物。將細(xì)胞用兩側(cè)具有2Lox位點(diǎn)(Ventura等,ProcNatlAcadSciUSA,Jull3；101(28):10380-5(2004))的帶有KF4cDNA的載體感染。DOX處理將產(chǎn)生初級(jí)iPS細(xì)胞，其在Cre表達(dá)后將刪除KLF4載體。產(chǎn)生次級(jí)成纖維細(xì)胞，其在DOX處理后將允許篩選代替被缺失的KLF4因子的小分子。圖25顯示了通過測(cè)試不同標(biāo)志物對(duì)重編程效率進(jìn)行定量的方案。將在0CT4基因座中帶有GFP和puix)標(biāo)志物的細(xì)胞用3或4種因子轉(zhuǎn)導(dǎo)。在感染后的不同時(shí)間，確定細(xì)胞群中藥物抗性或GFP陽性集落的比例和對(duì)堿性磷酸酶(AP)、SSEA4、TRA61或Nanog染色的細(xì)胞的外觀。圖26顯示了使用具有可以被獨(dú)立誘導(dǎo)的因子的次級(jí)成纖維細(xì)胞篩選小分子。將帶有病毒M2rtTA和0CT4-GFP標(biāo)志物的初級(jí)成纖維細(xì)胞使用轉(zhuǎn)導(dǎo)3種因子的三苯氧胺誘導(dǎo)型載體和轉(zhuǎn)導(dǎo)第四種因子(在這種情況下是cMYC)的DOX誘導(dǎo)型載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過在三苯氧胺和DOX中培養(yǎng)將產(chǎn)生初級(jí)iPS細(xì)胞，并將產(chǎn)生次級(jí)成纖維細(xì)胞。這些細(xì)胞當(dāng)在三苯氧胺中培養(yǎng)時(shí)，可以篩選代替cMYC用于重編程到次級(jí)iPS細(xì)胞的小分子。圖27A-27C顯示了從來自患者的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的DOX誘導(dǎo)型hiPSC的表征。圖27A顯示了hiPSC細(xì)胞系M3f-I(非PDhiPSC)、PDA3f-I、PDB3F_5、PDC3f-I,PDD3f-I和PDE3F-3的相差照片和對(duì)多能性標(biāo)志物SSEA4、Tra-l-60、0CT4、S0X2和NANOG的免疫熒光染色。圖28A顯示了在獨(dú)立的hiPSC細(xì)胞系、hESC和初級(jí)成纖維細(xì)胞中，內(nèi)源多能性相關(guān)基因NANOG、0CT4和S0X2的重新活化的定量RT-PCR。將相對(duì)表達(dá)水平相對(duì)于這些基因在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行歸一化。圖28C顯示了0CT4啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化分析。淺灰色方塊標(biāo)出hiPSCs和親代初級(jí)成纖維細(xì)胞的0CT4啟動(dòng)子中未甲基化的CpG，黑色方塊標(biāo)出甲基化的CpG。圖28A-28C顯示了源自于患者的hiPSC帶有低拷貝數(shù)的病毒整合。圖28A顯示了從hiPSC細(xì)胞系A(chǔ)6(非PDhiPSC)、PDA3f-I、PDB3f-I、PDC3F_1，PDD3f-I和PDE3F_3產(chǎn)生的畸胎瘤切片的蘇木精和曙紅染色，顯示了最上一排圖著色的神經(jīng)上皮；第二行圖神經(jīng)菊形團(tuán)；第三行圖腸上皮；第四行圖骨/軟骨；最下一行圖平滑肌。圖28B顯示了hESC細(xì)胞系BGOl、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)細(xì)胞和所標(biāo)出的源自患者的hiPSC(和非PDhiPSC細(xì)胞系M3f-I)對(duì)于XbaI消化的基因組DNA的原病毒整合的Southern印跡分析結(jié)果，使用了針對(duì)0CT4、KLF4、S0X2和c_MYC的32P-標(biāo)記的DNA探針。圖28C是一張表，概括了基于圖28B中顯示的Southern印跡分析，在hiPSC中四種重編程因子的原病毒整合的大概數(shù)量。圖29A-29C顯示了使用IoxP可切除重編程因子產(chǎn)生源自于I3D患者的hiPSC。圖29A是DOX誘導(dǎo)型慢病毒構(gòu)建物FUW-tetO-loxP、原病毒整合后的基因組座位(21ox)和Cre重組酶介導(dǎo)的切除后的基因組座位(Ilox)的示意圖。FUW-TetO-IoxP載體含有位于最小的CMV啟動(dòng)子的5’端的四環(huán)素響應(yīng)元件(TRE)和用于診斷性Southern印跡消化的獨(dú)特MfeI位點(diǎn)。重編程因子兩側(cè)帶有EcoRI限制性位點(diǎn)。該慢病毒載體的3'LTR含有單一IoxP位點(diǎn)，其在原病毒復(fù)制過程中復(fù)制到5'LTR中。該復(fù)制在原病毒的基因組整合后產(chǎn)生了兩側(cè)帶有2個(gè)IoxP位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因(21ox)。這允許使用Cre-重組酶切除與完整的啟動(dòng)子序列組合的轉(zhuǎn)基因(Ilox)。(WRE=Woodchuck響應(yīng)元件)。圖29B顯示了hiPSC細(xì)胞系PDB21°X_17和TOB-21的相差照片和對(duì)多能性標(biāo)志物SSEA4、Tra-1-60、0CT4、S0X2和NANOG的免疫熒光染色。PDB21°x-17和PDB21°x-21通過從圖A中顯示的FUW-tetO-loxP病毒表達(dá)三種重編程因子0CT4、S0X2和KLF4來衍生。在這些細(xì)胞中，所有三種重編程因子在它們的基因組整合位點(diǎn)的兩側(cè)帶有IoxP位點(diǎn)。圖29C顯示了從帶有可切除的重編程因子的roB21°x-17和PDB21ox-2I細(xì)胞產(chǎn)生的畸胎瘤切片的蘇木精和曙紅染色。圖30A-30D顯示了不含重編程因子的hiPSC的產(chǎn)生和表征。圖30A是Cre介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因切除以產(chǎn)生不含重編程因子的hiPSC的示意性綱要。使用轉(zhuǎn)導(dǎo)3種重編程因子0CT4、KLF4和S0X2的FUW-tetO-loxP慢病毒載體產(chǎn)生了IPSPDB21ox細(xì)胞。圖30B顯示了在Cre重組酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因切除后，親代成纖維細(xì)胞(PDB)、攜帶原病毒的TOB21t5x克隆(PDB21°x-17和roB21°x-21)和所標(biāo)出的TOB11t5x克隆的原病毒整合的Southern印跡分析。Pirn)指示了PDBllox克隆，其通過嘌呤霉素篩選而分離；GFP指示了通過對(duì)EGFP的FACS分揀而分離到的PDBllox克隆(如30A中所示)。將基因組DNA用XbaI消化，并使用針對(duì)0CT4、KLF4和S0X2的32P-標(biāo)記的DNA探針探測(cè)原病毒整合。因?yàn)楦鶕?jù)圖34中顯示的MfeI消化，用藍(lán)色標(biāo)出的PDBllox克隆仍有轉(zhuǎn)基因整合，因此將其忽略。圖30C顯示了hiPSC細(xì)胞系roB^-nPuro-S的細(xì)胞遺傳學(xué)分析，并且TOB11t5xHPuro-U在Cre介導(dǎo)的轉(zhuǎn)入基因切除后顯示出正常核型。圖30D概括了不含因子的hiPSC的產(chǎn)生。圖31A-31E顯示了不含重編程因子的hiPSC的表征。圖31A顯示了不含重編程因子的hiPSC細(xì)胞系roBik-nPuro-S和TOBllraiHPuro-U的相差照片和對(duì)多能性標(biāo)志物SSEA4、Tra-1-60、0CT4、S0X2和NANOG的免疫熒光染色。圖31B顯示了在hESC、成纖維細(xì)胞(I3DB)、帶有原病毒的I3DB21rai克隆(PDB21°x-17和PDB21°X_21)和所指示的PDBllrai克隆中，在Cre重組酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因切除后，內(nèi)源多能性相關(guān)基因NANOG、0CT4和S0X2的重新活化的定量RT-PCR。將相對(duì)表達(dá)水平相對(duì)于這些基因在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行歸一化。圖31C顯示了從不含因子的roBmnpuro-S和TOBllraiHpuroje細(xì)胞產(chǎn)生的畸胎瘤切片的蘇木精和曙紅染色。圖31D顯示了在hESC(BGOl)、初級(jí)成纖維細(xì)胞(TOB)、被感染的初級(jí)成纖維細(xì)胞(PDD3F+/-D0X)、hiPSC(M3F3-1)、PD來源的hiPSC(PDA3f-I、PDB3F_5、PDC3f-I、PDD3f-UPDE3F-3)、帶有原病毒的I3DB21qx克隆(PDB21°X_17和PDB21°X_21)和不含重編程因子的PDBllox克隆(PDBllrai-17Puro-5、PDBllox-17Puro-31、PDBllox-21Puro-12、PDBllox-21Puro-20)中0CT4、KLF4和S0X2的殘余轉(zhuǎn)基因表達(dá)的定量RT-PCR。將相對(duì)表達(dá)水平相對(duì)于被感染的初級(jí)成纖維細(xì)胞中DOX誘導(dǎo)的表達(dá)進(jìn)行歸一化。圖31E是Venn圖，分別顯示了帶有原病毒的PDB21細(xì)胞系(PDB21ox-5,PDB21ox-17,PDB21ox-21,PDB21ox-22)之間與hESC(H9、BG01)相比，或不含重編程因子的PDB11細(xì)胞系(PDBllra￡-17Puro-5、PDBllra￡-17Puro-10、PDBllra￡-21Puro-20、PDBllox-21Puro-26)之間與hESC(H9、BG01)相比的差異表達(dá)基因的數(shù)量(p<0.05，通過適中的t-檢驗(yàn)確定，對(duì)假發(fā)現(xiàn)率進(jìn)行校正)。圖32A-32D顯示了在初次感染后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)8天足以重編程人類成纖維細(xì)胞。圖32A顯示了用4種重編程因子0CT4、KLF4、S0X2和c_MYC轉(zhuǎn)導(dǎo)的初級(jí)成纖維細(xì)胞(PDB)的免疫熒光染色。在DOX誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)后不同時(shí)間點(diǎn)(上圖在第8天；下圖在第10天)，將細(xì)胞固定并對(duì)NANOG(紅色)和Tra-1-60(綠色)的表達(dá)進(jìn)行染色。在8天以前或在沒有用DOX處理的培養(yǎng)物中沒有檢測(cè)到NAN0G/Tra-l-60陽性細(xì)胞。在所有較晚時(shí)間點(diǎn)(12、14、16、18、20天)染色的培養(yǎng)物中也可以檢測(cè)到NANOG和Tra-1-60集落。圖32B顯示了對(duì)hiPSC克隆PDB4f-I和PDB3F_12d的多能性相關(guān)標(biāo)志物SSEA4、TRA-1-60、0CT4、S0X2和NANOG的免疫熒光染色。為了確定轉(zhuǎn)基因表達(dá)的時(shí)間要求，將初級(jí)成纖維細(xì)胞(TOB)用帶有重編程因子的DOX誘導(dǎo)型慢病毒進(jìn)行感染。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)通過添加DOX進(jìn)行誘導(dǎo)。在不同時(shí)間點(diǎn)，將培養(yǎng)基改變成不含DOX的hESC培養(yǎng)基，并在最初添加DOX后24小時(shí)時(shí)分離iPSC。左圖顯示了從用四種重編程因子轉(zhuǎn)導(dǎo)并在DOX下暴露8天的培養(yǎng)物分離的hiPSC克隆H)B4F-1。右圖顯示了從用三種重編程因子轉(zhuǎn)導(dǎo)并在DOX下暴露12天的培養(yǎng)物分離的hiPSC克隆roB3F-12d。圖32C顯示了在下列細(xì)胞系中內(nèi)源多能性相關(guān)基因NANOG、0CT4和S0X2的重新活化的定量RT-PCRhiPSC細(xì)胞系PDB4f-I和H)B4F-2、D4、A6、hESC和初級(jí)成纖維細(xì)胞。將相對(duì)表達(dá)水平相對(duì)于這些基因在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行歸一化。PDB4f-I和roB4F-2iPSC在四種重編程因子0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC的轉(zhuǎn)基因表達(dá)8天后進(jìn)行分離。圖32D顯示了從hiPSC細(xì)胞系roB3F-12d和PDB4F-2產(chǎn)生的畸胎瘤切片的蘇木精和曙紅染色。roB3F-12d通過三種重編程因子0CT4、S0X2、KLF4的12天的DOX誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)而得到。PDB4F-2通過四種重編程因子0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC的8天的DOX誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)而得到。圖33顯示了帶有Cre重組酶可切除的病毒重編程因子的hiPSC的產(chǎn)生。所指示的iPSPDB21ox克隆針對(duì)XbaI消化的基因組DNA的原病毒整合的Southern印跡分析，使用了針對(duì)0CT4、KLF4和S0X2的32P-標(biāo)記的DNA探針。所有PDB21qx克隆通過用Cre重組酶可切除的慢病毒載體(FUW-tetO-loxP)對(duì)3種重編程因子0CT4、S0X2和KLF4進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)來產(chǎn)生。圖34顯示了在hiPSC中重編程因子的切除的Southern印跡分析。在Cre重組酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因切除后，對(duì)親代成纖維細(xì)胞(PDB)、攜帶原病毒的TOB21rai克隆(PDB21°X-17和PDB21ox-21)和所指示的TOB11t5x克隆的原病毒整合進(jìn)行Southern印跡分析。Pirn)表示通過嘌呤霉素篩選分離到的克??；GFP表示通過對(duì)EGFP進(jìn)行FACS分揀所分離到的克隆(如圖5A中所示)。將基因組DNA用MfeI消化，并使用針對(duì)0CT4、KLF4和S0X2的32P-標(biāo)記的DNA探針探測(cè)原病毒整合。根據(jù)該Southern印跡分析，用藍(lán)色標(biāo)出的I3DB11t5x克隆(PDBU°X-17GFP-10、PDBll0X-17GFP-18,PDBllox-21Puro35和roBllra￡-21GFP_28)被視為轉(zhuǎn)基因部分缺失或含有轉(zhuǎn)基因部分缺失的混合細(xì)胞群。圖35顯示了FUW_M2rtTA的Southern印跡分析。對(duì)親代成纖維細(xì)胞(F1DB)、攜帶原病毒的I3DB21rai克隆(PDB21°x-17和PDB21°x-21)和所指示的I3DBllrai克隆的FUW_M2rtTA原病毒整合進(jìn)行Southern印跡分析。Puro表示通過嘌呤霉素篩選分離到的克隆；GFP表示通過對(duì)EGFP進(jìn)行FACS分揀所分離到的克隆(如圖30A中所示)。將基因組DNA用MfeI消化，并使用針對(duì)FUW-M2rtTA的32P-標(biāo)記的DNA探針探測(cè)原病毒整合。表I:源自于因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的胚胎或成年人類成纖維細(xì)胞的人類iPS細(xì)胞。將成纖維細(xì)胞用轉(zhuǎn)導(dǎo)不同因子組合的組成型或DOX誘導(dǎo)型慢病毒載體感染。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中挑取50到100個(gè)克隆。對(duì)病毒整合進(jìn)行的Southern印跡顯示，iPS細(xì)胞系源自于獨(dú)立感染的成纖維細(xì)胞。(0=0CT4,S=S0X2,K=KLF4,M=C-MYC5，L=LIN28,N=NAN0G)。表2:在本方案中使用的轉(zhuǎn)基因人類ES或iPS細(xì)胞系的概括。攜帶不同因子組合的DOX誘導(dǎo)型多順反子載體將被整合到C0L1A1基因座的3'UTR中，或GFP將被插入到0CT4基因座或所指示的神經(jīng)特異性基因中。表中還指出了細(xì)胞將用于的具體目標(biāo)。發(fā)明詳述2008年4月7日提交的PCT申請(qǐng)序列號(hào)PCT/US08/004516和2004年11月24日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)10/997，146的教導(dǎo)內(nèi)容，在此以其全文引為參考?？紤]到了本文描述的發(fā)明的各種實(shí)施方案和方面可適用于本發(fā)明的所有不同方面和實(shí)施方案。還考慮到了在適當(dāng)情況下，任一實(shí)施方案或方面可以與一種或多種其他這樣的實(shí)施方案或方面自由組口o誘導(dǎo)多能性的研究由于需要使用會(huì)產(chǎn)生遺傳不同質(zhì)的細(xì)胞群的高滴度反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行感染而變得復(fù)雜。我們產(chǎn)生了攜帶由可用強(qiáng)力霉素(dox)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因所定義的重編程因子的遺傳同質(zhì)的“次級(jí)”體細(xì)胞。這些細(xì)胞通過用dox誘導(dǎo)型慢病毒感染成纖維細(xì)胞、通過添加dox進(jìn)行重編程、篩選iPS細(xì)胞和產(chǎn)生嵌合小鼠來生產(chǎn)。源自于這些嵌合體的細(xì)胞在暴露于dox后不需病毒感染即可有效地重編程。利用這種系統(tǒng)，我們證實(shí)了(i)重編程因子的各種不同誘導(dǎo)水平能夠誘導(dǎo)多能性，(ii)轉(zhuǎn)基因活性的持續(xù)時(shí)間與重編程效率直接相關(guān)，(iii)來自許多體細(xì)胞組織的細(xì)胞可以被重編程，以及(iv)不同的細(xì)胞類型需要不同的誘導(dǎo)水平。這種系統(tǒng)便于重編程的定性，并為遺傳或化學(xué)篩選以增強(qiáng)重編程或替換個(gè)體因子提供了獨(dú)特的平臺(tái)。最近已經(jīng)顯示，小鼠H和人類5_8成纖維細(xì)胞可以通過四種轉(zhuǎn)錄因子0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的導(dǎo)入而重編程到多能狀態(tài)。重編程也可以在不存在C-Myc的情況下實(shí)現(xiàn)，盡管效率降低9a°。然而，使用這些方法，只有非常少部分的被所有4種因子感染的細(xì)胞最終重新編程n。隨機(jī)的病毒感染在被感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中引起遺傳異質(zhì)性，這可能在誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞形成所觀察到的低頻率中起到重要作用。因此，必須通過內(nèi)源多能性基因的重新活化卜3、或基于形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)n’12來篩選正確地重編程的細(xì)胞。已經(jīng)顯示，重編程過程在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后需要約10到12天的持續(xù)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，隨后進(jìn)行多能性標(biāo)志物的順序活化，首先活化堿性磷酸酶和階段特異性胚胎抗原(SSEAl)，然后重新活化內(nèi)源0ct4和Nanog基因，在此之后，培養(yǎng)物能夠在不存在轉(zhuǎn)基因活性的情況下維持多能狀態(tài)13,14o隨機(jī)感染的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞和遺傳異質(zhì)性，使得探索重編程過程中發(fā)生的重要分子事件復(fù)雜化，并限制了高通量分析所需的縮放性。為了克服這些問題，我們開發(fā)了一種不使用任何進(jìn)一步的遺傳干涉來產(chǎn)生適合于重編程的遺傳一致的細(xì)胞群的系統(tǒng)。為此，使用編碼4種重編程因子的強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型慢病毒來感染初級(jí)成纖維細(xì)胞。在囊胚注射后產(chǎn)生了嵌合小鼠，其由在克隆上源自于重編程的成纖維細(xì)胞的組織類型構(gòu)成。從這些小鼠可以產(chǎn)生同質(zhì)的供體細(xì)胞群，所述細(xì)胞群帶有允許重編程的預(yù)先選擇的載體整合，允許對(duì)初級(jí)細(xì)胞類型進(jìn)行強(qiáng)有力和簡(jiǎn)單的強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的重編程，而不需要重編程因子的直接病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。該技術(shù)便于產(chǎn)生大量遺傳一致的供體細(xì)胞，代表了用于遺傳或化學(xué)篩選應(yīng)用以改進(jìn)重編程的有力平臺(tái)。此外，可以利用同樣的手段，通過在多能的、重編程的成纖維細(xì)胞中遺傳缺失一個(gè)特定因子，來篩選代替4種因子中的每種的小分子15。此外，該工具不限于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物，而是在原則上能夠同樣應(yīng)用于所有其他體細(xì)胞類型，為在難以用反轉(zhuǎn)錄病毒感染的細(xì)胞類型例如淋巴細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)基因，提供了有吸引力的方式。結(jié)果產(chǎn)生用于藥物誘導(dǎo)型重編程的遺傳同質(zhì)細(xì)胞群為了產(chǎn)生在原病毒整合的數(shù)量和位置方面同質(zhì)的細(xì)胞群，我們利用了強(qiáng)力霉素(dox)誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)16’17并構(gòu)建了編碼4種重編程因子的dox誘導(dǎo)型慢病毒載體。用4種慢病毒感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，所述細(xì)胞除了靶向內(nèi)源Nanog基因座(NGFP)的綠色熒光蛋白(GFP)之外，還含有都靶向ROSA基因座(R0SA-M2rtTA)的反四環(huán)素反式激活子和PGK啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的嘌呤霉素抗性基因。同樣地，我們用編碼Klf4、Sox2和c-Myc的dox誘導(dǎo)型慢病毒感染Rosa-M2rtTAMEF，其帶有靶向I型膠原蛋白基因座16的四環(huán)素操作子控制下的0ct4cDNA和內(nèi)源Nanog基因座I18(NNeo)中的新霉素抗性基因(圖la)。在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后，向培養(yǎng)基加入強(qiáng)力霉素以活化轉(zhuǎn)基因并啟動(dòng)重編程過程。正如預(yù)期，出現(xiàn)了Nanog-GFP陽性和Nanog-neo抗性iPS集落，并建立了克隆的iPS細(xì)胞系。所有iPS細(xì)胞系可以在缺乏dox下擴(kuò)增，表現(xiàn)出堿性磷酸酶活性，并均一地表達(dá)多能性標(biāo)志物SSEAl和Nanog(未顯示)。這表明這些“初級(jí)”iPS細(xì)胞系已經(jīng)活化了它們的內(nèi)源多能性核心轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，并且不再依賴于四種重編程因子的外源表達(dá)19。為了產(chǎn)生由帶有已知在初級(jí)成纖維細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)重編程的相同原病毒插入的遺傳同質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的體細(xì)胞組織，我們將這些克隆的初級(jí)iPS細(xì)胞系中的幾種注射到囊胚中。將得到的dox誘導(dǎo)型iPS細(xì)胞嵌合體孕育直到E13.5，在這時(shí)分離MEF。然后使用嘌呤霉素篩選對(duì)源自于宿主囊胚的細(xì)胞進(jìn)行篩選，只留下iPS衍生的細(xì)胞。我們將這樣的細(xì)胞稱為“次級(jí)”MEF，因?yàn)樗鼈冊(cè)醋杂诔跫?jí)iPS細(xì)胞，并因此帶有能夠重編程體細(xì)胞的特定原病毒插入組(圖1A)。從由三種不同的克隆的初級(jí)iPS細(xì)胞系(一種Nanog-neo和兩種Nanog-GFP細(xì)胞系)產(chǎn)生的嵌合iPS細(xì)胞胚胎分離次級(jí)MEF，并在存在dox的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，以確定整合的慢病毒載體是否在發(fā)育的胚胎中分化后保留了介導(dǎo)表觀遺傳重編程的能力。向這些培養(yǎng)物添加dox啟動(dòng)了劇烈的形態(tài)改變，并通過neo篩選或GFP表達(dá)從這些培養(yǎng)物中有效分離了“次級(jí)”iPS細(xì)胞系，然后將其在不存在dox下繁殖。免疫熒光證實(shí)，次級(jí)iPS細(xì)胞已經(jīng)重新活化ES細(xì)胞的多能性標(biāo)志物堿性磷酸酶、SSEAl和內(nèi)源Nanog基因(圖IB和圖6)。這些細(xì)胞系的多能性被它們?cè)诨チ鲂纬煞治鲋行纬蓛?nèi)胚層、外胚層和中胚層譜系的細(xì)胞的能力，以及它們?cè)谀遗咦⑸浜髮?duì)成年嵌合小鼠的貢獻(xiàn)能力所證實(shí)(圖1C，1D)。轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)水平、重編程動(dòng)力學(xué)、和在源自于不同iPS細(xì)胞系的次級(jí)MEF之間的效率變化當(dāng)源自于所有三種dox誘導(dǎo)型iPS細(xì)胞系的次級(jí)MEF經(jīng)歷重編程以形成次級(jí)iPS細(xì)胞系時(shí)，我們注意到它們?cè)赿ox處理后在形態(tài)改變和增殖速率方面的差異。開始時(shí)，來自兩個(gè)Nanog-GFP細(xì)胞系的MEF在暴露于dox后增殖形成合生的成纖維細(xì)胞單層。然后來自Nanog-GFP細(xì)胞系3(NGFP3)的細(xì)胞經(jīng)歷了強(qiáng)有力的合生后增殖，包括細(xì)胞在懸液中的生長(zhǎng)，而來自Nanog-GFP細(xì)胞系2(NGFP2)的細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，在成纖維細(xì)胞單層上形成了離散的、堿性磷酸酶陽性的ES樣集落(圖2A)。源自于Nanog-neo細(xì)胞系的成纖維細(xì)胞在添加dox后從不形成合生的單層,但是產(chǎn)生大的三維集落。在dox給藥后12天,在所有三種培養(yǎng)物中可以容易地看到具有ES細(xì)胞形態(tài)的iPS細(xì)胞集落(圖2A，箭號(hào))。為了更詳細(xì)地評(píng)估重編程動(dòng)力學(xué)，將來自三個(gè)細(xì)胞系的MEF在含有dox的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并利用流式細(xì)胞術(shù)分析監(jiān)測(cè)SSEAl和GFP的重新活化(圖2C)。所有三種次級(jí)MEF都隨著時(shí)間過程顯示出逐漸增加的SSEAl陽性細(xì)胞，但是在時(shí)間進(jìn)程上觀察到一些差另ij。NNeoMEF最早顯示出SSEAl陽性細(xì)胞的增加，在第8天到第11天之間從I.3%增加到17.8%。NGFP2MEF顯示出類似的增加，但是在時(shí)間點(diǎn)上晚得多(在第14天到第18天之間從4.4%增加到29%)。相反，來自iPS細(xì)胞系NGFP3的MEF顯示出SSEAl的較慢的、逐漸的活化，在第14天時(shí)達(dá)到約10%。最早檢測(cè)到GFP陽性細(xì)胞的時(shí)間，在NGFP2中早在第14天，在NGFP3MEF中是在第18天。為了監(jiān)測(cè)NNeo次級(jí)MEF中內(nèi)源Nanog基因座的重新活化的時(shí)間進(jìn)程，我們將細(xì)胞鋪板，并在dox處理后各種不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)開始藥物篩選。與Nanog-GFP報(bào)告基因在誘導(dǎo)后2周左右活化相反，當(dāng)neo早在第4天添加到培養(yǎng)物中時(shí)，NNeoMEF就已是新霉素抗性的(圖2B)。這可能反映出Nanog基因座的較快的重新活化，與我們?cè)谠摷?xì)胞系中對(duì)SSEAl表達(dá)所觀察到的相似(圖2C)。或者，neo抗性集落出現(xiàn)較早可能是因?yàn)榕cGFP檢測(cè)需要較高表達(dá)相反14’2°，Nanog基因的低水平活化就足以提供藥物抗性。盡管次級(jí)細(xì)胞是針對(duì)其表達(dá)能夠誘導(dǎo)初級(jí)iPS細(xì)胞系形成的特定原病毒整合組進(jìn)行篩選而產(chǎn)生的，但多能性標(biāo)志物活化的總體動(dòng)力學(xué)與在MEF的直接感染中觀察到的類似i’13’14。這支持重編程過程需要一系列順序的表觀遺傳變化的觀點(diǎn)n’2°。接下來，我們比較了各種不同次級(jí)MEF的重編程效率。為了確定最適的鋪板密度，我們將次級(jí)NGFP2MEF以0.025-500個(gè)細(xì)胞/mm2的密度在含有dox的培養(yǎng)基中鋪板，并在4周后對(duì)GFP陽性集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。如圖2D中所示，鋪板密度對(duì)于iPS形成具有顯著影響。顯然，低和高的鋪板密度完全抑制了GFP陽性克隆的形成。我們推測(cè)，為了促進(jìn)生長(zhǎng)，在開始時(shí)可能需要旁分泌因子，并且如果在轉(zhuǎn)基因活化之前細(xì)胞發(fā)生接觸抑制，則阻礙了必要的細(xì)胞增殖。為了嚴(yán)格確定次級(jí)系統(tǒng)中的重編程效率，我們將來自NNeo和NGFP2細(xì)胞系的單個(gè)成纖維細(xì)胞鋪板在含有Y-射線輻照過的MEF作為提供最適生長(zhǎng)支持的飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中。我們觀察到分別只有14%和8%的來自NNeo和NGFP2MEF的接種細(xì)胞，在dox給藥后增殖到足以形成離生的集落(圖2E中的淺灰色條)。但是，那些集落的約四分之一在培養(yǎng)4周后最終變成新霉素抗性或GFP陽性的，產(chǎn)生了對(duì)于NNeo細(xì)胞系來說4%和對(duì)于NGFP2細(xì)胞系來說2%的總體重編程效率(圖2E中的深灰色條)。這比原先報(bào)道的基于藥物抗性的iPS篩選i’12的效率高25-50倍，比在感染的初級(jí)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物中基于形態(tài)的iPS篩選11的效率高4-8倍。接下來，我們比較了使用直接感染的次級(jí)MEF系統(tǒng)的可重復(fù)性。我們用編碼4種重編程因子的基于Moloney的病毒感染0ct4_neoMEF1,并在第20天對(duì)neo抗性集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)顯示出使用這種方法時(shí)iPS形成的高度實(shí)驗(yàn)間變異性(圖7B)。相反，我們注意到，在次級(jí)系統(tǒng)中，當(dāng)我們對(duì)4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中來自強(qiáng)力霉素處理的NGFP2MEF的Nanog-GFP陽性集落進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，變異性程度要低得多。為了將三個(gè)次級(jí)MEF群的表型行為與轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)相關(guān)聯(lián)，將同等數(shù)量的次級(jí)MEF在存在或不存在dox的情況下鋪板72小時(shí)，并在此時(shí)通過定量RT-PCR測(cè)定4種因子的總轉(zhuǎn)錄水平。令人吃驚的是，兩個(gè)Nanog-GFP細(xì)胞系誘導(dǎo)的0ct4水平，與NNeo細(xì)胞系從膠原蛋白IAl基因座中的轉(zhuǎn)基因以與ES細(xì)胞相似的水平表達(dá)0ct4相比，要低得多(圖3A)。相反，在Nanog-GFP細(xì)胞系中Sox2誘導(dǎo)所達(dá)到的水平與ES細(xì)胞中內(nèi)源Sox2的水平接近得多，而NNeo對(duì)dox做出響應(yīng)表達(dá)Sox2的水平明顯更低。在未誘導(dǎo)的MEF中，與ES細(xì)胞相比c-Myc表達(dá)更高,并且添加dox在所有三種次級(jí)MEF細(xì)胞系中引起了轉(zhuǎn)錄本水平的急劇誘導(dǎo)。相反，在所有三種次級(jí)MEF群中，在轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)后，總Klf4水平與ES細(xì)胞中相似。在dox處理的NNeo次級(jí)MEF中總0ct4水平與ES細(xì)胞最為接近的這一觀察結(jié)果，可以解釋在該細(xì)胞系中觀察到的更快和更有效的重編程動(dòng)力學(xué)(參見上文)。然后我們?cè)贜GFP2MEF中測(cè)定了重編程晚期階段中的表達(dá)水平。Sox2、Klf4和c-Myc總是被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，只有很少的變動(dòng)，而0ct4的表達(dá)隨時(shí)間緩慢增加(圖7A)。這可能反映了具有較高0ct4誘導(dǎo)的細(xì)胞在培養(yǎng)物中隨時(shí)間的篩選。Southern印跡分析表明在三個(gè)被研究的細(xì)胞系中存在1_2個(gè)c-Myc,1-3個(gè)0ct4、1-3個(gè)Sox2和3-4個(gè)Klf4原病毒的基因組整合(圖7C)。盡管它們遺傳同質(zhì)，但dox誘導(dǎo)引起轉(zhuǎn)基因的活化在單細(xì)胞水平上變動(dòng)，正如通過0ct4和Sox2的免疫熒光分析所確定的(圖3B)。因?yàn)椴皇撬械拇渭?jí)MEF都對(duì)dox做、出響應(yīng)而同等地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因，因此我們不能排除重編程需要轉(zhuǎn)基因表達(dá)的特定化學(xué)計(jì)量并僅僅在一部分次級(jí)MEF中發(fā)生的可能性。轉(zhuǎn)基因表達(dá)對(duì)重編程效率和時(shí)間進(jìn)程的影響為了調(diào)查發(fā)生穩(wěn)定的重編程需要4種重編程因子表達(dá)多長(zhǎng)時(shí)間，將次級(jí)NGFP2MEF以最適密度鋪板(參見上文)，在強(qiáng)力霉素中暴露從5天到22天的各種不同時(shí)間段，并每天監(jiān)測(cè)GFP熒光。產(chǎn)生GFP+集落的最小dox暴露時(shí)間長(zhǎng)度是9天，第一個(gè)GFP+集落出現(xiàn)在除去dox后7天的第16天(圖3C)。引人注目的是，追加暴露于dox不加速GFP+集落的出現(xiàn)，不論dox給藥的長(zhǎng)度如何，GFP出現(xiàn)在第16天到18天之間。同樣地，發(fā)現(xiàn)NNeo次級(jí)MEF需要11-13天的dox暴露后才能建立穩(wěn)定的新霉素抗性的次級(jí)iPS集落。為了將轉(zhuǎn)基因表達(dá)的時(shí)間長(zhǎng)度與總體重編程效率相關(guān)聯(lián)，我們將次級(jí)NGFP2MEF暴露于強(qiáng)力霉素10-15天，并在第34天對(duì)GFP陽性集落進(jìn)行定量。我們發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)度與GFP陽性集落數(shù)量之間的顯著相關(guān)性14(圖3D)。然后我們監(jiān)測(cè)了在同一培養(yǎng)皿中新進(jìn)化的GFP陽性集落隨時(shí)間的出現(xiàn)。令人吃驚的是，僅暴露于強(qiáng)力霉素9天的MEF持續(xù)產(chǎn)生GFP陽性集落直到第25天(dox撤回后15天)(圖3E，藍(lán)色線)。dox處理22天導(dǎo)致顯著得多地增加GFP陽性集落隨時(shí)間的形成(圖3E，紅色線)。這些發(fā)現(xiàn)與重編程即使在該同質(zhì)系統(tǒng)中也是逐漸的隨機(jī)過程相符，并與以前基于初級(jí)感染的結(jié)論相一致n’13’14’2°。此外，重編程過程持續(xù)，并在4種轉(zhuǎn)基因?qū)ox撤回做出響應(yīng)被下調(diào)后長(zhǎng)時(shí)間才能結(jié)束。我們還測(cè)試了次級(jí)細(xì)胞是否可用于評(píng)估藥物對(duì)重編程效率的影響。為此，我們研究了DNA去甲基化化合物5-氮雜脫氧胞苷(5-Aza)和組蛋白脫乙酰酶抑制劑制曲古菌素A(TSA)的影響。因?yàn)樗鼈兊淖饔檬侨旧|(zhì)修飾，因此這兩種小分子都是改進(jìn)重編程效率的候選物。圖3F顯示，向培養(yǎng)基添加5-Aza增加了來自NGFP3細(xì)胞系的MEF的重編程效率，而TSA處理對(duì)集落的數(shù)量沒有明顯影響。其他細(xì)胞類型的重編程我們?cè)噲D確定適合于通過從NNeo和NGFP2細(xì)胞系產(chǎn)生的iPS細(xì)胞嵌合體中分離次級(jí)細(xì)胞進(jìn)行重編程的組織類型范圍，并檢查了從來源于這些嵌合體的多種細(xì)胞類型的重編程能力。如表I中所概括的，一些細(xì)胞類型當(dāng)從NGFP2細(xì)胞系分離時(shí)可以容易地重編程，但是從NNeo細(xì)胞系分離的同樣的細(xì)胞類型不產(chǎn)生iPS細(xì)胞，表明不同細(xì)胞類型需要不同的轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)水平，這可能是由所研究的細(xì)胞系之間的不同原病毒整合位點(diǎn)所致。表I:從來源于NNeo和NGFP嵌合體的多種組織和細(xì)胞類型產(chǎn)生次級(jí)iPS細(xì)胞的總結(jié)組織/細(xì)胞類型NNeoNGFP2神經(jīng)祖細(xì)胞+N/D腎上腺+N/D角化細(xì)胞+N/D肌肉+N/D腸上皮_+間充質(zhì)干細(xì)胞_+造血譜系_+MEF++尾梢成纖維細(xì)胞-+腸上皮細(xì)胞來自次級(jí)NGFP2和NNeo嵌合體二者的純化的腸上皮細(xì)胞對(duì)強(qiáng)力霉素處理的響應(yīng)相當(dāng)快，并在48小時(shí)內(nèi)在懸液中形成球狀體，其隨后附著于MEF飼養(yǎng)細(xì)胞層并在3-4天內(nèi)呈現(xiàn)ES樣形態(tài)(圖4A-4C和4I-4J)。但是，在用dox培養(yǎng)10-12天之前，沒有檢測(cè)到堿性磷酸酶活性(圖9F)。使用機(jī)械分級(jí)規(guī)程(參見方法)，我們發(fā)現(xiàn)從級(jí)份7(主要為隱窩衍生的細(xì)胞)形成這些集落比從較前的級(jí)份(富含絨毛末梢衍生的細(xì)胞)形成要更有效得多(圖4M)。源自于NGFP2嵌合體的細(xì)胞在dox存在下培養(yǎng)約兩周后,發(fā)育成表達(dá)內(nèi)源Nanog的dox不依賴性iPS細(xì)胞(圖4K-4L，圖8B)。相反,源自于NNeo嵌合體的細(xì)胞在dox培養(yǎng)兩周后變成neo抗性,但是在dox撤回后不穩(wěn)定并失去它們的ES樣形態(tài)(圖4D-4F)。亞硫酸氫鹽測(cè)序顯示出Nanog啟動(dòng)子的一定程度的去甲基化，但是0ct4啟動(dòng)子只有最低的去甲基化(圖4G)，并且當(dāng)注射到SCID小鼠的皮膚下之后，這些細(xì)胞不能在存在或不存在強(qiáng)力霉素的情況下產(chǎn)生畸胎瘤。定量RT-PCR顯示這些細(xì)胞不能誘導(dǎo)Nanog，并且只表達(dá)非常低水平的Sox2和Klf4，但是表達(dá)高水平的0ct4和c-Myc(圖4H)。使用Sox2和Klf4進(jìn)行附加感染導(dǎo)致產(chǎn)生完全重編程的dox不依賴性iPS細(xì)胞，其表達(dá)多能性標(biāo)志物并顯示出它們的0ct4和Nanog啟動(dòng)子完全去甲基化(圖4G和圖9G)。在dox處理后48小時(shí)，NGFP2和NNeo腸上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)水平的比較，顯示出與來自這些細(xì)胞系的次級(jí)MEF中觀察到的相似的誘導(dǎo)水平差異(圖4N，與圖3A比較)。源自于隱窩的腸上皮細(xì)胞比來自于絨毛的細(xì)胞更容易誘導(dǎo)大部分轉(zhuǎn)基因，為它們?cè)黾拥募湫纬陕侍峁┝私忉?。這些發(fā)現(xiàn)表明，NNeo細(xì)胞系中的原病毒整合位點(diǎn)，盡管允許MEF進(jìn)行重編程，但與NGFP2中呈現(xiàn)的相反，不能在腸上皮細(xì)胞中介導(dǎo)完全重編程。間充質(zhì)干細(xì)胞和尾梢成纖維細(xì)胞接下來，我們比較了從NNeo和NGFP2嵌合體分離到的源自于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)和尾梢成纖維細(xì)胞(TTF)的重編程能力。這些細(xì)胞代表了兩種適合于通過直接感染進(jìn)行重編程的間充質(zhì)群U4’12(補(bǔ)充圖8D)。與腸細(xì)胞的情況相同，次級(jí)NGFP2MSC和TTF能夠?qū)ox做出響應(yīng)產(chǎn)生iPS細(xì)胞，而源自于NNeo嵌合體的細(xì)胞則不能(圖5A-5F，圖8A，8C)。角化細(xì)胞首先將從NNeo嵌合體的表皮分離的細(xì)胞在不存在強(qiáng)力霉素的情況下、在角化細(xì)胞最適的生長(zhǎng)條件下繁殖21。獲得了同質(zhì)的上皮培養(yǎng)物(圖5G)，并向培養(yǎng)基添加強(qiáng)力霉素。上皮細(xì)胞成簇增殖并隨時(shí)間改變它們的形態(tài)。在12天后將培養(yǎng)基改變成含有強(qiáng)力霉素的ES細(xì)胞培養(yǎng)基(圖5H)，并在7天后加入新霉素。在緊密集落中生長(zhǎng)的Neo抗性細(xì)胞類似于ES細(xì)胞(圖51)，并在Y-射線輻照過的飼養(yǎng)細(xì)胞上傳代，此時(shí)將培養(yǎng)物在不存在dox下維持,并表達(dá)內(nèi)源Nanog(圖9D)。神經(jīng)祖細(xì)胞切分來自NNeo嵌合體的腦，將側(cè)腦室周圍的組織塊解離成單細(xì)胞，并鋪板在未包被的培養(yǎng)皿上含有EGF和FGF2并不含血清的存在嘌呤霉素的培養(yǎng)基(N3EF)中，以篩選次級(jí)細(xì)胞。4周后形成神經(jīng)球，隨后將它們鋪板在聚鳥氨酸/層粘連蛋白包被的培養(yǎng)皿上含有dox的ES細(xì)胞或N3EF培養(yǎng)基中，以活化慢病毒轉(zhuǎn)基因。正如對(duì)于神經(jīng)前體所預(yù)計(jì)的，暴露于含血清的ES細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞分化成扁平的星形細(xì)胞并停止分裂(圖5J)。相反，鋪板在N3EF培養(yǎng)基中的細(xì)胞繼續(xù)強(qiáng)有力地增殖，類似于未分化的神經(jīng)上皮細(xì)胞。三周后將這些增殖的細(xì)胞分開，鋪板在含有強(qiáng)力霉素的ES細(xì)胞或N3EF培養(yǎng)基中。暴露于血清的細(xì)胞大多數(shù)采取了扁平形態(tài)，而在N3EF中，細(xì)胞維持雙極形態(tài)。但是，與以前的傳代相反，在接下來的兩周中，在這兩種條件下出現(xiàn)了小的ES樣集落(圖5K，5L)。當(dāng)在Y-射線輻照過的飼養(yǎng)MEF上傳代時(shí)，容易地建立了neo抗性、dox不依賴性的表達(dá)內(nèi)源Nanog的iPS細(xì)胞系(圖9E)。其他組織此外，我們也從NNeo嵌合體的腎上腺、腎臟和肌肉移植出的細(xì)胞成功產(chǎn)生了次級(jí)iPS細(xì)胞系。將這些組織切分，在胰蛋白酶中解離并在含有強(qiáng)力霉素的ES細(xì)胞培養(yǎng)基中鋪板。在dox存在下6-12天后，出現(xiàn)具有ES細(xì)胞形態(tài)的集落，其最終變成新霉素抗性、dox不依賴性的，并具有活化的Nanog(圖9A-9C)。體細(xì)胞表觀基因組通過4種轉(zhuǎn)錄因子Klf4、Sox2、c_Myc和0ct4的異位表達(dá)向多能性胚胎狀態(tài)的重編程，是緩慢和低效的過程。當(dāng)前用于誘導(dǎo)重編程的方法是通過反轉(zhuǎn)錄病毒基因的遞送，產(chǎn)生了原病毒整合在數(shù)量和基因組位置兩方面不同的異質(zhì)細(xì)胞群，這為直接重編程的變異性和低效率提供了解釋。在本文中，我們描述了用于重編程遺傳同質(zhì)細(xì)胞群的新系統(tǒng)。使用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型慢病毒載體進(jìn)行重編程并隨后形成嵌合體，產(chǎn)生了由遺傳同質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的組織，所述細(xì)胞帶有一致的原病毒整合并在暴露于強(qiáng)力霉素后重新表達(dá)重編程因子。這種策略篩選到攜帶了在有利于藥物誘導(dǎo)的活化的基因組座位中插入正確數(shù)量的原病毒的細(xì)胞，并消除了靶細(xì)胞的重新病毒感染所固有的異質(zhì)性。出人意料的是，在該系統(tǒng)中重編程的時(shí)間進(jìn)程與直接感染的初級(jí)成纖維細(xì)胞類似。啟動(dòng)重編程所需的最短時(shí)間長(zhǎng)度是9-13天。該時(shí)間尺度與在用載體直接感染的細(xì)胞中觀察到的10-14天的時(shí)間框相符13’14。我們還觀察到，當(dāng)早在第9天從培養(yǎng)物撤回dox時(shí)，GFP+次級(jí)iPS集落在強(qiáng)力霉素不存在下在隨后的幾周中持續(xù)出現(xiàn)。這些結(jié)果支持了重編程由需要最短的轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間段的表觀遺傳修飾的隨機(jī)順序所驅(qū)動(dòng)的觀點(diǎn)。次級(jí)MEF觀察到的重編程效率高達(dá)4%，與成熟B細(xì)胞的重編程效率22相當(dāng)，大大高于使用重新感染和藥物篩選所估計(jì)的0.1%的效率，并且比使用形態(tài)選擇標(biāo)準(zhǔn)所報(bào)道的i’11’12高大約8倍。已有明確記載，源自于被感染的MEF的iPS細(xì)胞平均帶有15個(gè)不同的原病毒拷貝，表明了強(qiáng)力篩選到少部分感染細(xì)胞，它們攜帶有“正確的”原病毒數(shù)量、或以用于成功重編程的適當(dāng)化學(xué)計(jì)量表達(dá)4種因子。因此，預(yù)計(jì)次級(jí)MEF的重編程頻率較高，因?yàn)檫@些細(xì)胞在克隆上源自于帶有“正確的”原病毒組合的感染細(xì)胞。果真如此的話，為什么只有4%而不是大多數(shù)或所有dox處理的次級(jí)細(xì)胞都產(chǎn)生次級(jí)iPS細(xì)胞呢？我們考慮了幾種不互相排斥的解釋。(i)已經(jīng)確定，直接感染的MEF的遺傳一致的亞克隆在明顯不同的時(shí)間變得重編程或完全不重編程n’2°。正如前面討論的，這表明重編程涉及一系列隨機(jī)事件，使得帶有相同數(shù)量原病毒拷貝的細(xì)胞將在不同時(shí)間活化內(nèi)源多能性基因。(ii)我們的數(shù)據(jù)還顯示dox處理不在所有細(xì)胞中統(tǒng)一地活化原病毒，而是在個(gè)體細(xì)胞之間存在誘導(dǎo)水平的差異。因?yàn)檫@些多樣化的表達(dá)水平，只有一部分次級(jí)MEF可能獲得足夠高的因子表達(dá)水平或因子之間正確的相對(duì)表達(dá)水平，因此能夠產(chǎn)生次級(jí)iPS細(xì)胞。盡管重編程由4種因子的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)所誘導(dǎo)，但多能狀態(tài)的維持依賴于重新建立參與四種內(nèi)源多能性因子0ct4、NanOg、SOX2和Tcf3活化2°’23和外源因子沉默的自調(diào)控環(huán)路。同樣地，次級(jí)MEF能夠完全重編程到多能狀態(tài)，并在不存在轉(zhuǎn)基因表達(dá)的情況下維持所述多能狀態(tài)。我們還利用次級(jí)系統(tǒng)檢查幾種其他成年體細(xì)胞類型的重編程潛力?？梢酝ㄟ^dox處理從許多其他組織包括腦、表皮、腸上皮、間充質(zhì)干細(xì)胞、尾梢成纖維細(xì)胞、腎、肌肉和腎上腺產(chǎn)生iPS細(xì)胞，表明原病毒在MEF之外的細(xì)胞類型中也被適當(dāng)激活。這證實(shí)了4種重編程因子能夠在具有不同發(fā)育起源和表觀遺傳狀態(tài)的細(xì)胞中介導(dǎo)表觀遺傳重編程，并突出了次級(jí)系統(tǒng)在廣泛的細(xì)胞類型的重編程研究中的實(shí)用性。盡管采取了特別的小心以避免其他污染性細(xì)胞類型，但我們不能明確地證明來自這些各種組織類型的iPS細(xì)胞的起源細(xì)胞。遺傳譜系追蹤實(shí)驗(yàn)事實(shí)上證實(shí)，在用0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4轉(zhuǎn)導(dǎo)后可以從肝和胰腺細(xì)胞產(chǎn)生iPS細(xì)胞24’25。但是，不是所有的細(xì)胞類型都允許通過這四種因子進(jìn)行重編程。我們已經(jīng)顯示，成熟而不是不成熟的B細(xì)胞的重編程需要轉(zhuǎn)導(dǎo)附加的因子(c/EBP-a)或抑制B細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Pax522。為了重編程某些細(xì)胞類型，可能需要附加的以及尚不知道的因子。本文描述的系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)用優(yōu)點(diǎn)在于，可以研究各種細(xì)胞類型，包括可以耐受離體(exvivo)培養(yǎng)和反轉(zhuǎn)錄病毒感染的細(xì)胞類型,例如腸上皮細(xì)胞。本文描述的可藥物誘導(dǎo)的系統(tǒng)代表了一種具有可預(yù)測(cè)和高度可重復(fù)的動(dòng)力學(xué)和效率的新的重編程平臺(tái)(參見補(bǔ)充圖7B)，其將促進(jìn)引起表觀遺傳重編程的早期分子事件的研究。此外，次級(jí)細(xì)胞類型的遺傳同質(zhì)性為提高重編程效率的化學(xué)和遺傳篩選方法提供了可行性。作為一個(gè)實(shí)例，我們證明了DNA去甲基化劑5-氮雜脫氧胞苷顯著增加重編程效率。此外，這樣的篩選也適用于鑒定代替原來的重編程因子的化合物。因?yàn)橹鼐幊虪顟B(tài)不依賴于外源因子，因此可以將轉(zhuǎn)基因遺傳切除并通過形成缺少特定重編程因子的嵌合體產(chǎn)生次級(jí)細(xì)胞15。實(shí)施例所有本文引用的參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)內(nèi)容在此以其全文引為參考。實(shí)施例I病毒制備和感染含有四環(huán)素操作子控制下的Klf4、Sox2、0ct4和c_Myc以及最小CMV啟動(dòng)子的慢病毒載體的構(gòu)建以前已被描述14。將不能復(fù)制的慢病毒粒子在293T細(xì)胞中用VSV-G外殼包裝，并用于感染在R26基因座處含有M2rtTA和PGK-Puro抗性基因17、并含有靶向內(nèi)源Nanog基因座的新霉素抗性或GFP等位基因^的MEF。將來自包裝4種病毒的每種的培養(yǎng)物的病毒上清液合并，通過0.45iim濾膜過濾，并以I:I與ES細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM中添加有w/10%FBS(Hyclone，Logan,UT)、白血病抑制因子、￠-巰基乙醇(SIGMA-Aldrich)、青霉素/鏈霉素、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸(都來自Invitrogen,Carlsbad,CA)混合,然后施加到MEF。初級(jí)iPS分離，畸胎瘤和嵌合體形成在添加dox(Sigma-AldrichSt.LouisMO.2Ug/mL)后約3周,分離GFP+或新霉素抗性iPS集落，并在不存在dox的情況下擴(kuò)增。從與NanogGFPl細(xì)胞系(在22中描述為MEF-iPS#I細(xì)胞系)同樣的平板挑取NanogGFP2iPS細(xì)胞系，而細(xì)胞系NanogGFP3源自于獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。將iPS細(xì)胞系注入C57/B6xDBA/1F1囊胚。將囊胚置于礦物油下的一滴含有15%FBS的DMEM中。使用Piezo顯微操作器，使用內(nèi)徑為12_15_的平頭顯微注射移液器進(jìn)行iPS細(xì)胞注射。將約10個(gè)iPS細(xì)胞注入囊胚腔，并將囊胚置于KSOM(SpecialtyMedia,Phillipsburg，NJ)中，在37°C下溫育，直到將其轉(zhuǎn)移到雌性受體中。將15個(gè)注入的囊胚轉(zhuǎn)移到交配后2.5天假孕的C57/B6XDBA/1Fl雌性的子宮角。對(duì)于畸胎瘤的產(chǎn)生來說，將2xl06個(gè)細(xì)胞皮下注射到受體SCID小鼠的脅肋，并在3-6周后分離腫瘤進(jìn)行組織學(xué)分析。所有動(dòng)物按照IA⑶C學(xué)術(shù)管理準(zhǔn)則進(jìn)行處理。次級(jí)體細(xì)胞分離和培養(yǎng)對(duì)于MEF分離來說，在E13.5時(shí)分離嵌合胚胎，并除去頭部和內(nèi)部(包括生殖)器官。將剩余組織物理解離，并在37°C下在胰蛋白酶中溫育20分鐘，然后將細(xì)胞重懸浮在含有嘌呤霉素(2ug/mL)的MEF培養(yǎng)基中，并傳代兩次進(jìn)行擴(kuò)增，然后冷凍。將用于所述實(shí)驗(yàn)的次級(jí)MEF融化，并在融化后將實(shí)驗(yàn)鋪板1-2代。通過在6孔板中每孔鋪板4xl04個(gè)次級(jí)MEF，并在指定時(shí)間對(duì)板進(jìn)行染色或分析，進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)(圖2)。細(xì)胞密度實(shí)驗(yàn)在12孔板中進(jìn)行，并在dox誘導(dǎo)后4周，對(duì)GFP+iPS集落計(jì)數(shù)。通過將單個(gè)次級(jí)MEF鋪在96孔板中野生型MEF飼養(yǎng)細(xì)胞層上，然后進(jìn)行dox誘導(dǎo)(使用有限稀釋法，其在沒有MEF飼養(yǎng)細(xì)胞的平行樣板中通過目測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證)，來進(jìn)行單細(xì)胞效率實(shí)驗(yàn)。在4周后對(duì)iPS形成計(jì)數(shù)。顯示了來自2-3個(gè)生物平行樣品的代表性實(shí)驗(yàn)。對(duì)于5-Aza和TSA實(shí)驗(yàn)來說，將IxlO6個(gè)次級(jí)MEF鋪于6孔板中(約100個(gè)細(xì)胞/mm2)，并用含有5_Aza(lyM)或TSA(IuM)的ES細(xì)胞培養(yǎng)基預(yù)處理48小時(shí)。48小時(shí)后，將次級(jí)MEF在添加dox但缺乏5_Aza或TSA的ES細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在誘導(dǎo)后第8-10天之間，將MEF暴露于5-Aza或TSA中再48小時(shí)的時(shí)間，然后僅使用dox培養(yǎng)，直到在第21天對(duì)GFP+集落計(jì)數(shù)。從3到4月齡的嵌合體分離體器官。表皮角化細(xì)胞的分離和培養(yǎng)如前所述21’26。神經(jīng)祖細(xì)胞的分離和培養(yǎng)如前所述27。將全部腸上皮使用含有3mMEDTA和0.05mMDTT的PBS溶液在室溫下解離30分鐘。棄去肌肉組織，并將純化的隱窩/絨毛鋪板于dox存在下的Y-射線輻照過的MEF飼養(yǎng)細(xì)胞上。對(duì)于隱窩-絨毛的分級(jí)來說，使用同樣的EDTA-DTT溶液，但是級(jí)份按照28中所述，通過在溫育后輕柔振蕩10、6、5、5、9、10和25分鐘來收集(分別對(duì)應(yīng)于級(jí)份1-7，其中I代表絨毛末梢到7代表隱窩)。將來自每個(gè)級(jí)份的SxlO6個(gè)上皮細(xì)胞在含有2yg/mLdox的ES培養(yǎng)基中鋪板在MEF飼養(yǎng)細(xì)胞層上。在缺乏dox的培養(yǎng)物中沒有觀察到生長(zhǎng)。次級(jí)嵌合小鼠(或從用于直接感染的Colll-Tet0-0ct4、ROSa26-M2rtTA小鼠16)的股骨和脛骨在生長(zhǎng)板中移除骨節(jié)后，通過用含有DMEM+5%胎牛血清(FBS)(Hyclone,ThermoFisherScientific)的注射器和30號(hào)針頭沖洗,分離全部骨髓。通過在添加有15%FBS(HyClone)的a-MEM中在組織培養(yǎng)班上差異鋪板72小時(shí)，篩選間充質(zhì)干細(xì)胞。通過將來自新鮮分離的全骨髓的4xl06個(gè)有核細(xì)胞鋪在IOcm板上，并允許在嘌呤霉素存在下擴(kuò)增5天以消除宿主囊胚產(chǎn)生的細(xì)胞，然后導(dǎo)入dox以誘導(dǎo)重編程，來進(jìn)行MSC在培養(yǎng)物中的集落形成。將源自于腎上腺、肌肉和腎臟的培養(yǎng)物切分，機(jī)械解離，并在胰蛋白酶中在37°C下消化20分鐘，然后鋪板在帶有含dox的ES培養(yǎng)基的明膠包被的培養(yǎng)皿上。抗體為了進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，我們使用了APC偶聯(lián)的抗小鼠SSEAl抗體(R&Dsystems,Minneapolis,MN)和堿性磷酸酶底物試劑盒VectorRed底物試劑盒(VectorLaboratories,Burlingame,CA)。為了進(jìn)行免疫熒光，將細(xì)胞固定在4%多聚甲醛中，并且我們使用了針對(duì)SSEAl的小鼠單克隆抗體(DevelopmentalStudiesHybridomaBank)、山羊抗Sox2抗體(R&DSystems)、小鼠抗0ct4抗體(SantaCruz)和兔抗Nanog抗體(Bethyl)。突光團(tuán)標(biāo)記的適合的第二抗體購(gòu)自JacksonImmunoResearch。流式細(xì)胞術(shù)將細(xì)胞用胰蛋白酶處理，在PBS中清洗I次并重懸浮在FACS緩沖液中(PBS+5%胎牛血清)。將IO6個(gè)細(xì)胞用10uIAPC偶聯(lián)的抗SSEAl抗體在100UI體積中染色30分鐘，然后將細(xì)胞在PBS中清洗兩次。然后將細(xì)胞用清洗緩沖液清洗I次并重懸浮在FACS緩沖液中，用于在FACS-calibur細(xì)胞分揀器上進(jìn)行分析。亞硫酸氫鹽測(cè)序和Southern印跡分析DNA的亞硫酸氫鹽處理使用CpGenomeDNA修飾試劑盒(Chemicon,Temecula,CA),按照制造商的說明書進(jìn)行。得到的修飾DNA通過嵌套式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩個(gè)正向(F)引物和一個(gè)反向(R)引物來擴(kuò)增0ct4(Fl,GTTGTTTTGTTTTGGTTTTGGATAT；SEQIDNO:I)；(F2,ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA；SEQIDNO:2)；(R,CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC；SEQIDNO3)和Nanog(Fl，GAGGATGTTTTTTAAGTTTTTTTT，SEQIDNO4；F2,AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT,SEQIDNO5；R,CCCACACTCATATCAATATAATAAC,SEQIDNO6)。第一輪PCR如下進(jìn)行94°C4分鐘；5個(gè)循環(huán)94°C30秒、56°CI分鐘(每個(gè)循環(huán)_1°C)和72°CI分鐘；以及30個(gè)循環(huán)94°C30秒、51°C45秒和72°CI分20秒。第二輪PCR循環(huán)是94°C4分鐘；30個(gè)循環(huán)94°C30秒、53.5°CI分鐘和72°CI分20秒。將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠純化(Zymogen,ZymoResearch,Orange,CA),亞克隆到T0P0TA載體(Invitrogen)中并測(cè)序。通過將10ygDNA用SpeI消化(其在慢病毒載體骨架中切開一次)，然后用針對(duì)四種因子的隨機(jī)引發(fā)的全長(zhǎng)cDNA探針進(jìn)行雜交，來進(jìn)行基因組DNA的Southern印跡分析。定量RT-PCR使用Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)分離總RNA。使用無DNA的RNA試劑盒(ZymoResearch,Orange,CA),將5微克總RNA用DNaseI處理以除去基因組DNA的潛在污染。使用第一鏈合成試劑盒(Invitrogen)對(duì)I微克DNaseI處理過的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最終重懸浮在100水中。使用1/50的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，在ABIPrism7000(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)中，使用帶有ROX的PlatinumSYBRgreenqPCRSuperMix-UDG(Invitrogen)進(jìn)行三份重復(fù)的定量PCR分析。用于擴(kuò)增的引物如下0ct4F，5'-ACATCGCCAATCAGCTTGG-3'SEQIDNO7和R，5'-AGAACCATACTCGAACCACATCC-3'SEQIDNO8；c-mycF，5'-CCACCAGCAGCGACTCTGA-3'SEQIDNO:9和R，5'-TGCCTCTTCTCCACAGACACC-3'SEQIDNO10；Klf4F,5'-GCACACCTGCGAACTCACAC-3'SEQIDNO:II和R，5'-CCGTCCCAGTCACAGTGGTAA-3'SEQIDNOI2；Sox2F，5'-ACAGATGCAACCGATGCACC-3'SEQIDNO13和R，5'-TGGAGTTGTACTGCAGGGCG-3'SEQIDNO14；NanogF，5'-CCTCCAGCAGATGCAAGAACTC-3'SEQIDNO:15和R，5'-CTTCAACCACTGGTTTTTCTGCC-3'SEQIDNO:16。為了確保在RT反應(yīng)中cDNA的等量上樣，使用下述引物擴(kuò)增GAPDHmRNA:F，5!-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3!SEQIDNO:17;以及R，5'-CCCTTTTGGCTCCACCCT-3'SEQIDNO180從擴(kuò)增的線性范圍提取數(shù)據(jù)。顯示的qRT-PCR數(shù)據(jù)的所有圖都代表用DNase處理、反轉(zhuǎn)錄并平行擴(kuò)增的RNA樣品，以避免這些程序中固有的變動(dòng)。誤差線表示三份重復(fù)反應(yīng)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)施例I的參考文獻(xiàn)l)Wernig，M.等，成纖維細(xì)胞體外重編程到多能ES細(xì)胞樣狀態(tài)(InvitroreprogrammingoffibroblastsintoapluripotentES-cell-likestate.)Nature448,318-324(2007).2)0kita，K.，Ichisaka，T.&Yamanaka,S.具有生殖系能力的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的產(chǎn)生(Generationofgermline-competentinducedpluripotentstemcells.)Nature448，313-317(2007).3)MaheraliN.等，直接重編程的成纖維細(xì)胞顯示出整體表觀遺傳改造和廣泛的組織分布(DirectlyReprogrammedFibroblastsShowGlobalEpigeneticRemodelingandWidespreadTissueContribution.)CellStemCell1，55-70(2007)4)Takahashi,K.&Yamanaka，S.通過確定的因子從小鼠胚胎和成年成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)多會(huì)泛干細(xì)胞(Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.)Cell126，663-676(2006)5)Yu,J.等，源自于人類體細(xì)胞的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系(Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.)Science318,1917-1920(2007).6)Takahashi,K.等，通過確定的因子從成年人類成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.)Cell131，861-872(2007)7)Park,I.H.等，使用確定的因子將人類體細(xì)胞重編程為多能性(Reprogrammingofhumansomaticcellstopluripotencywithdefinedfactors.)Nature451，141-146(2008).8)Lowry,W.E.等，從皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的人類多能干細(xì)胞(Generationofhumaninducedpluripotentstemcellsfromdermalfibroblasts.)ProcNatlAcadSciUSA105,2883-2888(2008).9)Wernig,M.，Meissner，A.，Cassady，J.P.&Jaenisch，R.c_Myc對(duì)于小鼠成纖維細(xì)胞的直接重編程不是必需的(c-MycIsDispensableforDirectReprogrammingofMouseFibroblasts.)CellStemCell2，10-12(2008).10)Nakagawa,M.等，不需Myc從小鼠和人類成纖維細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(GenerationofinducedpluripotentstemcellswithoutMycfrommouseandhumanfibroblasts.)NatBiotechnol26，101-106(2008)ll)Meissner，A.，Wernig，M.&Jaenisch,R.將未遺傳修飾的成纖維細(xì)胞直接重編程成多會(huì)泛干細(xì)胞(Directreprogrammingofgeneticallyunmodifiedfibroblastsintopluripotentstemcells.)NatBiotechnol25，1177-1181(2007)12)Takahashi，K.，Okita，K.，Nakagawa,M.&Yamanaka，S.從成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)多會(huì)泛干細(xì)胞(Inductionofpluripotentstemcellsfromfibroblastcultures.)NatProtoc2,3081-3089(2007).13)Stadtfeld，M.，Maherali,N.，D.T.，B.&Hochedlinger,K.定義小鼠中成纖維細(xì)胞向iPS細(xì)胞重編程過程中的分子基石(DefiningMolecularCornerstonesduringFibroblasttoiPSCellReprogramminginMouse.)CellStemCell2，230-240(2008)14)Brambrink,T.等，小鼠體細(xì)胞的直接重編程過程中多能性標(biāo)志物的順序表達(dá)(SequentialExpressionofPluripotencyMarkersduringDirectReprogrammingofMouseSomaticCells.)CellStemCell2，151-159(2008).15)Hanna,J.等，使用從自體皮膚產(chǎn)生的iPS細(xì)胞治療鐮刀細(xì)胞貧血癥小鼠模型(TreatmentofsicklecellanemiamousemodelwithiPScellsgeneratedfromautologousskin.)Science318，1920-1923(2007)16)Hochedlinger，K.，Yamada,Y.，Beard,C.&Jaenisch，R.Oct-4的異位表達(dá)阻斷了袓細(xì)胞的細(xì)胞分化并在上皮組織中引起發(fā)育異常(EctopicexpressionofOct-4blocksprogenitor-celldifferentiationandcausesdysplasiainepithelialtissues.)17)Cell121，465-477(2005)18)Beard,C,Hochedlinger,K.，Plath，K.，Wutz，A.&Jaenisch，R.通過胚胎干細(xì)胞中的位點(diǎn)特異性整合產(chǎn)生單拷貝轉(zhuǎn)基因小鼠的有效方法(Efficientmethodtogeneratesingle-copytransgenicmicebysite-specificintegrationinembryonicstemcells.)Genesis44，23-28(2006)19)Mitsui，K.等，在小鼠外胚層和ES細(xì)胞中維持多能性需要同源異型蛋白Nanog(ThehomeoproteinNanogisrequiredformaintenanceofpluripotencyinmouseepiblastandEScells.)Cell113，631-642(2003)20)Boyer,LA.等，人類胚胎干細(xì)胞中的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控回路(Coretranscriptionalregulatorycircuitryinhumanembryonicstemcells.)Cell122，947-956(2005).21)Jaenisch，R.&Young，R.干細(xì)胞，多能性和核重編程的分子回路(Stemcells，themolecularcircuitryofpluripotencyandnuclearreprogramming.)Cell132，567-582(2008).22)Jones,P.H.&Watt，F(xiàn).M.在整合蛋白功能和表達(dá)差異的基礎(chǔ)上從短暫擴(kuò)增細(xì)胞分離人類表皮干細(xì)胞(Separationofhumanepidermalstemcellsfromtransitamplifyingcellsonthebasisofdifferencesinintegrinfunctionandexpression.)Cell73，713-724(1993)23)Hanna,J.等，終末分化的成熟B淋巴細(xì)胞直接重編程為多能性(DirectreprogrammingofterminalIydifferentiatedmatureBlymphocytestopluripotency.)Cell133，250-264(2008)24)Cole，M.F.，Johnstone，S.E.，Newman,JJ.，Kagey，M.H.&Young，R.A.Tcf3是胚胎干細(xì)胞的核心調(diào)控回路的不可分割的一部分(Tcf3isanintegralcomponentofthecoreregulatorycircuitryofembryonicstemcells.)GenesDev22，746-755(2008).25)Aoi,T.等，從成年小鼠肝臟和胃細(xì)胞產(chǎn)生多能干細(xì)胞(GenerationofPluripotentStemCellsfromAdultMouseLiverandStomachCells.)Science(2008).26)Stadtfeld,M.，Brennand,K.&Hochedlinger,K.膜腺3細(xì)胞重編程成誘導(dǎo)白勺多倉(cāng)泛干細(xì)胞(ReprogrammingofPancreaticbetaCellsintoInducedPluripotentStemCells.)CurrBiol(2008).27)Rheinwald,J.《細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂實(shí)用方法》(CellGrowthandDivisionAPracticalApproach)(R.Baserga主編),81-94(OxfordPress,Oxford；1989).28)Vescovi,A.L.,Galli,R.&Gritti,A.《神經(jīng)干細(xì)胞方法與方案》(NeuralStemCellsMethodsandProtocols.)(T.Zigova,P.R.Sanberg&J.R.Sanchez-Ramos主編)，115-123(HumanaPress,2002).29)Ferraris,R.P.，Villenas,S.A.&Diamond,J.小鼠小腸中刷狀緣酶活性和腸細(xì)胞遷移率的調(diào)控(Regulationofbrush-borderenzymeactivitiesandenterocytemigrationratesinmousesmallintestine.)AmJPhysiol262,G1047-1059(1992).實(shí)施例2I.概述A.產(chǎn)生用于人類ES和iPS細(xì)胞的遺傳操作的工具本文描述的工作提供了強(qiáng)有力的手段，用于將基因定向到huES細(xì)胞中并產(chǎn)生用于將體細(xì)胞重編程成iPS細(xì)胞的工具。更具體來說，使用同源重組將GFP插入到huES和iPS細(xì)胞的關(guān)鍵神經(jīng)譜系基因中。GFP標(biāo)志物被用于從操作的iPS細(xì)胞分離神經(jīng)元前體細(xì)胞，以評(píng)估它們的發(fā)育潛力。目前的重編程方案依賴于轉(zhuǎn)錄因子的反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在iPS細(xì)胞中產(chǎn)生多個(gè)原病毒插入。本工作描述的方法避免了使用多次病毒感染，或幾乎消除了對(duì)病毒介導(dǎo)的重編程的需要。I.DOX和三苯氧胺誘導(dǎo)型反轉(zhuǎn)錄病毒載體DOX誘導(dǎo)型反轉(zhuǎn)錄病毒載體的重要性在于限定了多能性標(biāo)志物的順序活化和小鼠體細(xì)胞重編程過程中載體表達(dá)的最短時(shí)間。我們已經(jīng)產(chǎn)生了誘導(dǎo)型慢病毒載體，其允許重編程因子的暫時(shí)受限的表達(dá)。(a)DOX誘導(dǎo)型慢病毒載體按照與用于鼠類基因相同的策略，我們產(chǎn)生了組成型或在DOX誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)導(dǎo)人類0CT4、S0X2、KLF4和C-MYCc-DNA的慢病毒載體[Brambrink,2008#6877]。為了產(chǎn)生DOX誘導(dǎo)型系統(tǒng)，我們用帶有rtTA反式激活子的慢病毒載體感染人類成纖維細(xì)胞。圖IlA顯示了在用相應(yīng)的DOX誘導(dǎo)型載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中0CT4、S0X2和KLF4的高DOX依賴性表達(dá)。同樣地，在源自于被感染的成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞中，觀察到了強(qiáng)有力的DOX依賴性轉(zhuǎn)基因表達(dá)(圖IlA的右側(cè)兩個(gè)圖塊)。(b)三苯氧胺誘導(dǎo)型慢病毒載體為了能夠?qū)d體進(jìn)行獨(dú)立的可誘導(dǎo)控制，我們還通過將因子與雌激素配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，產(chǎn)生了0CT4、S0X2和C-MYC雌激素受體(ER)融合構(gòu)建物，以允許三苯氧胺依賴性表達(dá)[Grandori，1996#6505]。如圖IlB中所示，向用S0X2-ER融合構(gòu)建物轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞添加三苯氧胺，導(dǎo)致S0X2蛋白從細(xì)胞質(zhì)向核移位，正如對(duì)于藥物誘導(dǎo)的活化所預(yù)計(jì)的。這些結(jié)果顯示，DOX和ER融合誘導(dǎo)型系統(tǒng)可用于獨(dú)立地控制被轉(zhuǎn)導(dǎo)的因子的表達(dá)。一個(gè)重要的概念是使用兩種不同的可調(diào)控系統(tǒng)，各自控制一部分因子的表達(dá)。例如，人們可以將三種因子置于第一種誘導(dǎo)型(例如dox誘導(dǎo)型)啟動(dòng)子的控制之下，并將第四種因子置于第二種誘導(dǎo)型(例如三苯氧胺誘導(dǎo)型)啟動(dòng)子的控制之下。然后，人們可以通過從這兩種啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)來產(chǎn)生iPS細(xì)胞，從該iPS細(xì)胞產(chǎn)生小鼠，并從小鼠分離成纖維細(xì)胞(或任何其他細(xì)胞類型)。這些成纖維細(xì)胞將是遺傳上同質(zhì)的，并且不需要病毒感染即可重編程。然后人們可以嘗試在只有第一個(gè)啟動(dòng)子有活性的條件下，在可能能夠代替第四種因子的不同小分子的存在下重編程成纖維細(xì)胞，以便鑒定小分子“重編程劑”，或優(yōu)化瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或其他用于導(dǎo)入第四種因子的方案。許多變化形式是可能的；例如，人們可以穩(wěn)定地誘導(dǎo)3種因子的表達(dá)，并瞬時(shí)誘導(dǎo)第四種因子的表達(dá)等。此外，人們可以通過使用不同濃度的誘導(dǎo)劑來調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平。另一種途徑是將編碼一種因子的基因置于重組酶的位點(diǎn)之間，然后誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)以關(guān)閉該因子的表達(dá)。重組酶的表達(dá)可以使用病毒載體(例如腺病毒-Cre)感染而被誘導(dǎo)。Hanna等，Science，318，1920-1923(2007)描述了一種這樣的方法，其被用于降低由于c-Myc轉(zhuǎn)基因表達(dá)所引起的腫瘤形成的潛在風(fēng)險(xiǎn)——將細(xì)胞用編碼0ct4、Sox2和Klf4因子的反轉(zhuǎn)錄病毒和編碼2-loxc-MyccDNA的慢病毒感染。從這些細(xì)胞產(chǎn)生的iPS細(xì)胞用編碼Cre重組酶的腺病毒感染，以刪除慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的C-Myc拷貝。這些系統(tǒng)可用于例如鑒定重編程劑以及研究在重編程中的必要條件和發(fā)生的事件(包括發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類型特異性差異)。2.人類iPS細(xì)胞的產(chǎn)生證實(shí)了誘導(dǎo)型系統(tǒng)正如所預(yù)期的在人類以及小鼠中起作用已經(jīng)顯示，許多不同策略已經(jīng)顯示出從小鼠或人類供體體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞，包括組成性或誘導(dǎo)性表達(dá)四種轉(zhuǎn)錄因子0ct4、Sox2、Klf4和c-myc或四種因子的一部分或可選的因子組合[Lowry,2008#6827；Park,2008#6783；Takahashi,2007#6769；Yu,2007#6793]。比較了圖IlA中描述的不同載體系統(tǒng)對(duì)人類成纖維細(xì)胞重編程的效用。表I顯示了通過轉(zhuǎn)導(dǎo)4種或3種(減去C-MYC)組成性表達(dá)因子或DOX誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子而獲得的iPS細(xì)胞。當(dāng)使用DOX誘導(dǎo)型慢病毒時(shí)，iPS克隆以與別人報(bào)道的相似的頻率和大約相同的時(shí)間后在被感染的培養(yǎng)物中出現(xiàn)[Takahashi，2007#6769]。圖12A顯示，內(nèi)源0CT4和NANOG基因在兩個(gè)iPS細(xì)胞系中的表達(dá)水平與在huES細(xì)胞中相似。重編程的iPS細(xì)胞生長(zhǎng)成具有人類ES細(xì)胞的典型形態(tài)的緊密集落，并且它們表達(dá)適合的多能性標(biāo)志物(圖12B)。為了測(cè)試多能性，將iPS細(xì)胞注射到SCID小鼠中。得到的腫瘤的組織學(xué)檢查顯示出包含多種分化的細(xì)胞類型的典型的畸胎瘤(圖12C)。B.通過多順反子反轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生小鼠和人類iPS細(xì)胞許多現(xiàn)有的產(chǎn)生iPS細(xì)胞的方案需要通過四種不同的反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)4種轉(zhuǎn)錄因子0ct4、Sox2、c-myc和Klf4。在這種方式中，重編程涉及篩選帶有多個(gè)整合的載體(多達(dá)15個(gè)或以上的原病毒)的一小部分感染的細(xì)胞，由于使用了強(qiáng)有力的癌基因和/或反轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)的插入誘變而增加了對(duì)癌癥的顧慮。為了減少重編程所需的獨(dú)立原病毒整合的數(shù)量，我們?cè)O(shè)計(jì)并使用了能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)任何因子組合的多順反子載體，其目的是減少原病毒整合的數(shù)量。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)被廣泛用于從一個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)多個(gè)基因，但是這常常引起基因的非化學(xué)計(jì)量的表達(dá)。自切割的18-22個(gè)氨基酸長(zhǎng)的2A肽介導(dǎo)脯氨酸和甘氨酸殘基之間的“核糖體跳過(ribosomalskipping)”并抑制肽鍵形成而不影響下游翻譯。這些肽允許多個(gè)蛋白被編碼成聚蛋白(polyprotein)，其在翻譯后分離成組分蛋白。術(shù)語“自切割”的使用不打算是指蛋白水解切開反應(yīng)。自切割肽在小RNA病毒科的成員中發(fā)現(xiàn)，包括口蹄疫病毒例如口蹄疫病毒(FMDV)、馬甲型鼻炎病毒(ERAV)、Thoseaasigna病毒(TaV)和豬捷申病毒_1(PTV-I)(Donnelly,ML等，J.Gen.Virol,82,1027-101(2001);Ryan,MD等，J.Gen.Virol.，72，2727-2732(2001))和心臟病毒例如泰勒病毒(Theilovirus)(例如泰勒鼠腦脊髓炎)和腦心肌炎病毒。源自FMDV、ERAV、PTV-1和TaV的2A肽在本文中有時(shí)分別稱為“F2A”、“E2A”、“P2A1P“T2A”?？谔阋卟《?A多肽典型長(zhǎng)度為18-22個(gè)氨基酸，并含有DxlEx2NPG(SEQIDNO:34)，其中xl通常為纈氨酸或異亮氨酸。正如上面提到的，據(jù)認(rèn)為2A序列介導(dǎo)脯氨酸和甘氨酸之間的“核糖體跳過”，損害P和G之間正常肽鍵的形成而不影響下游翻譯。示例性的2A序列是來自FMDV的VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQIDNO35)，其中下劃線的殘基在許多2A肽中是保守的。心臟病毒2A肽的C末端是保守的，與FMDV2A肽顯示出高度相似性，并已顯示也介導(dǎo)自切割(Donnelly,ML,等，J.Gen.Virol.，78，13-21(1997))。FDMV2A肽已顯示出介導(dǎo)人工聚蛋白的切割(Ryan,MD和Drew，J.，EMBOJ.，13，928-933(1994))。最近，使用自加工2A肽表達(dá)四種CD3蛋白，證實(shí)了在體內(nèi)從一個(gè)多順反子有效并化學(xué)計(jì)量地表達(dá)四種蛋白的能力(Szymczak等,NatureBiotech.5,589-594,2004)。其中各cDNA被2A肽分隔開的多順反子轉(zhuǎn)基因，已顯示出在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞包括huES細(xì)胞中促進(jìn)多順反子基因的表達(dá)(Hasegawa,K.等，StemCells.2007Jul；25(7):1707-12,2007)本發(fā)明提供了可用于產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞的多順反子核酸構(gòu)建物、表達(dá)盒和載體。在某些實(shí)施方案中，多順反子核酸構(gòu)建物包含編碼自切割肽的部分。本發(fā)明提供了包含至少兩個(gè)編碼區(qū)的多順反子核酸構(gòu)建物，其中編碼區(qū)各自通過編碼自切割肽的核酸相連以便形成單個(gè)開放閱讀框，并且其中編碼區(qū)編碼的第一和第二種重編程因子能夠單獨(dú)或與一種或多種附加的重編程因子組合，將哺乳動(dòng)物體細(xì)胞重編程為多能性。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物包含由自切割肽分開的兩個(gè)編碼區(qū)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物包含三個(gè)各自編碼重編程因子的編碼區(qū)，其中相鄰的編碼區(qū)由自切割肽隔開。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物包含四個(gè)各自編碼重編程因子的編碼區(qū)，其中相鄰的編碼區(qū)由自切割肽隔開。因此，本發(fā)明提供了構(gòu)建物，其編碼含有2、3或4種由自切割肽隔開的重編程因子的聚蛋白。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物包含適合于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的表達(dá)控制元件，例如啟動(dòng)子，其中構(gòu)建物編碼聚蛋白的部分與表達(dá)控制元件可操作連接。因此，本發(fā)明提供了表達(dá)盒，其包含與啟動(dòng)子(或其他適合的表達(dá)控制元件)可操作連接的、編碼含有重編程因子的聚蛋白的核酸，每個(gè)重編程因子通過自切割肽與至少一種其他重編程因子相連。啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼重編程因子的多順反子信使的轉(zhuǎn)錄，各個(gè)重編程因子通過自切割肽與至少一種其他重編程因子相連。啟動(dòng)子可以是病毒啟動(dòng)子(例如CMV啟動(dòng)子)或哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(例如PGK啟動(dòng)子)。表達(dá)盒或構(gòu)建物可以包含其他遺傳元件，例如，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)或穩(wěn)定性。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，任何上述的構(gòu)建物或表達(dá)盒還可以包含不編碼重編程因子的編碼區(qū)，其中編碼區(qū)通過自切割肽與相鄰的編碼區(qū)隔開。在某些實(shí)施方案中，附加的編碼區(qū)編碼選擇性標(biāo)志物?？梢杂啥囗樂醋訕?gòu)建物編碼的具體重編程因子包括轉(zhuǎn)錄因子0ct4、Sox2、Klf4、、c-Myc和Nanog，它們?cè)诒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的并在本文中進(jìn)一步描述。本發(fā)明涵蓋了兩種或以上上述因子的以各種可能次序的所有組合。出于簡(jiǎn)明的目的，不是所有這些組合都在本文中單獨(dú)列出。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物編碼由2A肽隔開的0ct4、Klf4和Sox2。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物不編碼c-Myc。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物含有編碼Lin28的編碼區(qū)。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物含有編碼C/EBPa的編碼區(qū)。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物包含一個(gè)或多個(gè)介導(dǎo)或便于構(gòu)建物整合到哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中的位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物包含一個(gè)或多個(gè)介導(dǎo)或便于將構(gòu)建物靶向哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中的選·定基因座的位點(diǎn)。例如，構(gòu)建物可以包含一個(gè)或多個(gè)與基因組中選定的基因座同源的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物包含在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的重組酶的位點(diǎn)，其中所述位點(diǎn)位于構(gòu)建物至少包含因子的編碼區(qū)的部分的兩側(cè)(即一個(gè)位點(diǎn)位于構(gòu)建物編碼聚蛋白的部分的5'端，第二個(gè)位點(diǎn)位于該部分的3'端)，以便在重編程后可以將編碼因子的序列從基因組切除。重組酶可以是例如Cre或FIp，其中相應(yīng)的重組酶位點(diǎn)是LoxP位點(diǎn)和Frt位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，重組酶是轉(zhuǎn)座酶。應(yīng)該理解，重組酶位點(diǎn)不必與編碼聚蛋白的區(qū)域直接相鄰，但其位置將使得需要最終從基因組移除的區(qū)域位于位點(diǎn)之間。在某些實(shí)施方案中，重組酶位點(diǎn)在表達(dá)盒的'和3'末端上。切除可以產(chǎn)生保留在基因組中的重組酶位點(diǎn)的殘留拷貝，其在某些實(shí)施方案中是由重編程過程產(chǎn)生的唯一遺傳變化。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物包含單一重組酶位點(diǎn)，其中該位點(diǎn)在構(gòu)建物插入基因組過程中被拷貝，使得構(gòu)建物的至少編碼含有因子的聚蛋白的部分(以及任選的希望需要從基因組移除的構(gòu)建物的任何其他部分)，在整合到基因組中后在兩側(cè)帶有兩個(gè)重組酶位點(diǎn)。例如，重組酶位點(diǎn)可以在反轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)載體的3'LTR中(參見例如實(shí)施例4)。在某些方面，本發(fā)明提供了包含多順反子核酸構(gòu)建物的載體。在某些實(shí)施方案中，載體是反轉(zhuǎn)錄病毒載體例如慢病毒載體。在其他實(shí)施方案中，載體是非反轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如其可以是病毒(例如腺病毒)或非病毒的。示例性的多順反子核酸構(gòu)建物、表達(dá)盒和載體描述在實(shí)施例3中。在某些方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞和細(xì)胞系(例如體細(xì)胞和細(xì)胞系例如成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞和本文中討論的其他類型的細(xì)胞)，其在基因組中整合有多順反子核酸構(gòu)建物或表達(dá)盒(例如本文描述的任何構(gòu)建物或表達(dá)盒)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，例如鼠類細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是靈長(zhǎng)動(dòng)物細(xì)胞，例如人類細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，至少構(gòu)建物的編碼聚蛋白的部分兩側(cè)帶有重組酶位點(diǎn)。在產(chǎn)生重編程細(xì)胞后，可以通過例如蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)將重組酶導(dǎo)入細(xì)胞中，或者可以使用載體例如腺病毒載體將編碼重組酶的基因?qū)氲郊?xì)胞中。重組酶從基因組切除編碼外源重編程因子的序列。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞含有編碼重組酶的誘導(dǎo)型基因，其中重組酶在誘導(dǎo)后表達(dá)并切除表達(dá)盒。在某些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)型基因被整合到基因組中。在某些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)型基因在游離基因上。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞不含編碼重組酶的誘導(dǎo)型基因。在某些實(shí)施方案中，使用例如同源重組將核酸構(gòu)建物或表達(dá)盒靶向基因組中的特定基因座。在某些實(shí)施方案中，基因座是對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)大多數(shù)或所有細(xì)胞類型的發(fā)育非必要的基因座。在某些實(shí)施方案中，基因座是其中插入不影響從基因座中含有插入的體細(xì)胞產(chǎn)生多能iPS細(xì)胞的能力的基因座。在某些實(shí)施方案中，基因座是其中插入不擾亂ES細(xì)胞的多能性的基因座。在某些實(shí)施方案中，基因座是COLlAl基因座或AAV整合基因座。在某些實(shí)施方案中，基因座包含組成型啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建物或表達(dá)盒是定向的，以便從構(gòu)建物或表達(dá)盒所定向的基因座中存在的內(nèi)源啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)編碼含有因子的聚蛋白的多順反子信使的表達(dá)。本發(fā)明還提供了從基因組中帶有核酸構(gòu)建物或表達(dá)盒的體細(xì)胞產(chǎn)生的多能重編程細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。iPS細(xì)胞可用于為多能細(xì)胞所設(shè)想的任何目的。此外還提供了源自于多能重編程細(xì)胞的分化的細(xì)胞系(例如神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、心臟細(xì)胞)。從其產(chǎn)生的示例性的體細(xì)胞和iPS細(xì)胞描述在實(shí)施例3中。本發(fā)明確定了重編程因子具有允許在2A序列位于重編程因子之間時(shí)對(duì)其進(jìn)行有效加工的先決結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，這是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)檎J(rèn)識(shí)到了切割是基于結(jié)構(gòu)的事件(Szymczak,同上)。本公開確定了在其C-末端具有附加的來自2A肽的17-21個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)錄因子保留了進(jìn)入核并執(zhí)行其功能的能力。本公開還確定了重編程因子能夠忍受保留在上游蛋白的C-末端上的來自2A肽的附加的17-21個(gè)氨基酸的存在，并在重編程中保持功能。盡管用高滴度反轉(zhuǎn)錄病毒載體感染以表達(dá)所需重編程因子的重編程是高度可重復(fù)的，但過程相對(duì)低效，并且在因子的表達(dá)時(shí)間和次序方面的精確要求以及所需的絕對(duì)和相對(duì)表達(dá)水平，還未完全了解。此外，當(dāng)在許多現(xiàn)有方案中通過用各自編碼單個(gè)因子的多個(gè)病毒感染細(xì)胞來產(chǎn)生iPS細(xì)胞時(shí)，已顯示每個(gè)病毒引起了2-6個(gè)之間的位置處的整合，導(dǎo)致整個(gè)基因組中14-20個(gè)插入事件。該過程產(chǎn)生了遺傳修飾的iPS細(xì)胞，其可能含有未知的插入產(chǎn)生的突變。此外，因?yàn)閮H有一小部分被感染的細(xì)胞變得重編程，因此使用這些多病毒方案獲得的結(jié)果沒有解決這樣一個(gè)問題，即整合的位置和/或來自轉(zhuǎn)基因的表達(dá)所發(fā)生的相對(duì)時(shí)間是否是細(xì)胞將變得重編程的一個(gè)重要決定因素。本發(fā)明確定，從多順反子轉(zhuǎn)錄本基本上同時(shí)地表達(dá)多個(gè)因子、并且相對(duì)水平依賴于2A切割事件的效率，能夠有效誘導(dǎo)重編程。此外，本發(fā)明確定，因子的單個(gè)拷貝對(duì)于重編程是足夠的。因?yàn)樵诒景l(fā)明的某些實(shí)施方案中，四種因子從確定的位置表達(dá)(例如預(yù)先選定的位置或在載體整合后決定的位置)，因此多順反子載體系統(tǒng)可以簡(jiǎn)化重編程機(jī)制的研究并便于載體的切除。在某些實(shí)施方案中，這樣的切除導(dǎo)致移除了至少編碼重編程因子的外源序列。在某些實(shí)施方案中，這樣的切除產(chǎn)生除了某些實(shí)施方案中殘留的重組酶位點(diǎn)之外不帶有遺傳修飾的iPS細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，具有不超過2、3、4或5個(gè)殘留的重組酶位點(diǎn)。不希望受到理論的限制，含有單個(gè)整合構(gòu)建物的重編程細(xì)胞將增加使用基于重組酶的手段回收不含轉(zhuǎn)基因的iPS細(xì)胞的可能性或容易度。還考慮到了編碼2、3或4種因子的多順反子載體可以與增強(qiáng)重編程和/或代替不由多順反子載體編碼的一種或多種因子的小分子、蛋白或其他藥劑組合使用。實(shí)施例4描述了使用Cre重組酶切除型病毒從患有帕金森氏病(PD)的個(gè)體的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生不含重編程因子的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)的實(shí)驗(yàn)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，不帶有編碼重編程因子的外源基因的iPS細(xì)胞，如實(shí)施例4中所述或使用類似方法產(chǎn)生，區(qū)別在于使用了包含編碼含有多個(gè)因子(2、3或4種因子)的聚蛋白的多順反子核酸構(gòu)建物的單一載體而不是編碼單個(gè)因子的多個(gè)載體。當(dāng)然，實(shí)施例4中描述的方法也可以使用編碼單個(gè)因子的多個(gè)載體，以便獲得不含編碼重編程因子的外源基因的iPS細(xì)胞，其中得到的iPS細(xì)胞僅具有少數(shù)殘留的重組酶位點(diǎn)。盡管在實(shí)施例4中使用來自患有ro的個(gè)體的成纖維細(xì)胞作為示例性細(xì)胞類型，但方法也適用于從正常體細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞或其他細(xì)胞類型例如角化細(xì)胞、腸細(xì)胞、血液細(xì)胞)或從來自患有目標(biāo)疾病的個(gè)體的體細(xì)胞產(chǎn)生具有最少遺傳改變的iPS細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，編碼反式激活子的基因也在兩側(cè)帶有重組酶位點(diǎn)，以便也將其從基因組中移除。從它們獲得的iPS細(xì)胞和分化細(xì)胞可用于研究目的(例如作為模型系統(tǒng)研究疾病和/或鑒定疾病的治療藥劑)，和/或用于開發(fā)基于細(xì)胞的療法，其在某些實(shí)施方案中是患者特異性的基于細(xì)胞的療法。C.人類iPS細(xì)胞的發(fā)育潛力以及從外周血的衍生iPS系統(tǒng)的令人激動(dòng)的潛力是產(chǎn)生患者特異性多能細(xì)胞。本文描述的工作記述了允許在體外使用患者特異性iPS細(xì)胞研究復(fù)雜的人類疾病的方案。例如，目前，患者特異性iPS細(xì)胞從深部皮膚活檢組織產(chǎn)生。在建立在臨床情況下分離iPS細(xì)胞的可能更簡(jiǎn)單的方案的嘗試中，本文描述的方法使用了外周血作為供體材料以產(chǎn)生iPS細(xì)胞。D.篩選小分子本文描述的工作提供了用于鑒定改進(jìn)重編程效率的小分子的高通量系統(tǒng)。這允許建立起不需遺傳操作或插入外源遺傳元件例如載體介導(dǎo)的癌基因如C-MYC或KLF4的轉(zhuǎn)導(dǎo)的重編程方法。II.實(shí)驗(yàn)方法在小鼠系統(tǒng)中，使用允許轉(zhuǎn)錄因子的藥物誘導(dǎo)型表達(dá)的載體，對(duì)于確定導(dǎo)致重編程的分子事件來說是關(guān)鍵的。這些實(shí)驗(yàn)表明，重編程涉及ES細(xì)胞標(biāo)志物例如堿性磷酸酶、SSEAl、0ct4和Nanog的順序活化，并且被轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子需要表達(dá)至少12天以便產(chǎn)生iPS細(xì)胞[Brambrink，2008#6877]。目標(biāo)A的主要目的是產(chǎn)生有助于體細(xì)胞的重編程并允許對(duì)人類ES和iPS細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作的工具。這些工具對(duì)于致力于人類體細(xì)胞重編程的機(jī)制的目標(biāo)B是重要的。目標(biāo)C的目的是建立實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，用于在體外以及嵌合小鼠體內(nèi)評(píng)估人類iPS細(xì)胞分化成有功能的神經(jīng)元細(xì)胞的潛力。此外，我們將設(shè)計(jì)用于從人類外周血產(chǎn)生iPS細(xì)胞的方案。最后，目標(biāo)D的焦點(diǎn)在于篩選作為可替代物通過遺傳手段活化重編程途徑的化學(xué)化合物。A.產(chǎn)生用于人類ES和iPS細(xì)胞的遺傳操作的工具通過同源重組遺傳改變內(nèi)源基因的能力已經(jīng)革新了生物學(xué)，并且與胚胎干細(xì)胞組合，為分子醫(yī)學(xué)帶來了極大希望。盡管在小鼠ES細(xì)胞中基因定向是常規(guī)步驟，但將該技術(shù)轉(zhuǎn)移到人類胚胎干細(xì)胞在以前是困難的[Giudice，2008#6863]。事實(shí)上，自從Thomson在十年前首次分離到人類ES細(xì)胞起，僅出現(xiàn)4份出版物報(bào)道了成功的內(nèi)源基因定向[Davis，2008#6860；ffon,2007#6857；Zwaka,2003#6223；Urbach,2004#6163]。為了實(shí)現(xiàn)人類ES細(xì)胞的全部潛能，需要克服遺傳修飾內(nèi)源基因的困難。本工作的焦點(diǎn)在于建立允許對(duì)人類ES和iPS細(xì)胞進(jìn)行有效遺傳操作的工具。為了產(chǎn)生在譜系特異性基因中帶有標(biāo)志物的huES細(xì)胞，我們將使用兩種不同方法，使用常規(guī)的同源重組產(chǎn)生在關(guān)鍵的發(fā)育調(diào)控子中帶有標(biāo)志物的遺傳修飾的人類ES細(xì)胞。這些插入到譜系特異性基因中的標(biāo)志物，將被用于隨后將iPS細(xì)胞分化成特異性神經(jīng)元譜系的目的。也開發(fā)了允許在缺少反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況下對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行有效重編程的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。譜系特異性基因通過同源重組的尋靶通過插入到譜系特異性內(nèi)源基因中的可用于分離所需分化細(xì)胞類型的標(biāo)志物，促進(jìn)了從未分化ES細(xì)胞產(chǎn)生分化細(xì)胞。我們的初步實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GFP或藥物抗性標(biāo)志物在0CT4以及COLlAl基因座中的定位。因此，目標(biāo)是產(chǎn)生這樣的ES和iPS細(xì)胞，即其在神經(jīng)或其他譜系的細(xì)胞所表達(dá)的基因中帶有藥物抗性標(biāo)志物和/或GFP(或其他可檢測(cè)標(biāo)志物)序列，并可用于篩選或選擇在疾病例如阿茨海默氏病和帕金森氏病中受影響的分化的細(xì)胞類型⑴神經(jīng)譜系特異性靶基因通過同源重組的基因定向與小鼠ES細(xì)胞相反，在篩選細(xì)胞克隆用于增強(qiáng)單細(xì)胞生長(zhǎng)的染色體畸變時(shí)，人類ES細(xì)胞通常僅使用有限的酶消化進(jìn)行機(jī)械傳代。這種情況以及緩慢的生長(zhǎng)，可能是在huES細(xì)胞中基因定向效率如此之低的重要原因。最近，已經(jīng)顯示向huES細(xì)胞施加ROCK抑制劑Y-27632顯著降低了解離誘導(dǎo)的凋亡并增加了克隆效率[Watanabe，2007#6549]。因此，所有實(shí)驗(yàn)將在存在這種抑制劑的情況下進(jìn)行。為了進(jìn)行同源重組，使用常規(guī)程序，從BG02或H9ES細(xì)胞的等基因的基因組DNA構(gòu)建了含有由2A序列隔開的GFP和neo抗性標(biāo)志物的定向載體。按照已發(fā)表的程序?qū)NA通過電穿孔轉(zhuǎn)入細(xì)胞[Costa，2007#6868]，并從藥物抗性集落分離DNA并分析正確的定向。我們將對(duì)在神經(jīng)分化過程中不同時(shí)間并在如下詳述的不同神經(jīng)元亞組中活化的基因進(jìn)行定向。SOXl:轉(zhuǎn)錄因子SOXl是最早了解到的專門在小鼠的神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)的基因[Aubert,2003#6841]。插入到該基因中的GFP用作篩選huES或iPS細(xì)胞衍生的神經(jīng)元前體細(xì)胞的便捷標(biāo)志物。FOXGl:該基因的表達(dá)已在增殖的端腦前體細(xì)胞和基底前腦的乙酰膽堿能神經(jīng)元[Hebert,2000#6844]、在阿茨海默氏病中受影響的細(xì)胞中得到證實(shí)。PITX3:該同源域轉(zhuǎn)錄因子在酪氨酸水解酶陽性神經(jīng)元的終末分化過程中選擇性表達(dá)，并且分揀從PITX3-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的分化的ES細(xì)胞，已被顯示富集了多巴胺能神經(jīng)元[Hedlund，2008#6845;Zhao，2004#6846]。LMXl:該同源域轉(zhuǎn)錄因子似乎是增殖的多巴胺能前體細(xì)胞的關(guān)鍵決定因素[Andersson,2006#6840]。已經(jīng)顯示，相關(guān)的譜系特異性基因被GFP的標(biāo)記幫助建立了強(qiáng)有力的分化方案，以允許分離富集的或甚至同質(zhì)的分化細(xì)胞群。在4個(gè)基因中帶有GFP的HuES細(xì)胞，允許富集前體以及與源自患有疾病例如阿茨海默氏病或帕金森氏病的患者的iPS細(xì)胞的研究相關(guān)的更分化的細(xì)胞。建立同源重組的有效方法的困難極大地阻礙了huES細(xì)胞系統(tǒng)的利用。初步數(shù)據(jù)是令人鼓舞的，并證明了兩個(gè)內(nèi)源基因座0CT4和COLlAl已經(jīng)被GFP和嘌呤霉素抗性cDNA定向(圖10)。但是，到目前為止只有在ES細(xì)胞中表達(dá)的基因(0CT4、HPRT、R0SA26[Irion，2007#6857；Zwaka,2003#6223；Urbach,2004#6163])或準(zhǔn)備表達(dá)的基因例如MOXLl[Davis，2008#6860]，已經(jīng)在人類ES細(xì)胞中定向。此外，在小鼠細(xì)胞中COLlAl基因座是高度誘重組性的[Beard，2006#6199]，并且該基因座的定向可能對(duì)于其他非表達(dá)基因來說不是代表性的。因此，因?yàn)槲覀兊哪康氖峭ㄟ^同源重組定向非表達(dá)基因，因此這種目的提出了挑戰(zhàn)。帶有不同重編程因子組合的“次級(jí)”iPS細(xì)胞我們已經(jīng)顯示，小鼠iPS細(xì)胞可帶有15個(gè)或以上的原病毒插入[Wernig，2007#6641]，提示對(duì)少部分具有每種載體多個(gè)拷貝的細(xì)胞進(jìn)行強(qiáng)力選擇，以獲得啟動(dòng)重編程過程所需的因子的高水平或某種化學(xué)計(jì)量的表達(dá)。本文描述的是回避了對(duì)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的需求、從而消除了對(duì)選擇少部分帶有原病毒的“正確”組合的細(xì)胞的必要性的系統(tǒng)。事實(shí)上，以克隆手段從“初級(jí)”iPS細(xì)胞產(chǎn)生并帶有適合數(shù)量的DOX誘導(dǎo)型原病毒、一開始已實(shí)現(xiàn)重編程的“次級(jí)”成纖維細(xì)胞，允許我們將成熟的B細(xì)胞重編程到多能狀態(tài)[Hanna，2008#6842]。這種方法適合于人類細(xì)胞，并且其產(chǎn)生的次級(jí)成纖維細(xì)胞攜帶的重編程因子(i)作為原病毒載體整合到預(yù)先選擇的染色體位置中或(ii)通過同源重組插入到基因組表達(dá)基因座中。該系統(tǒng)可用于確定重編程的機(jī)制，并用于篩選增強(qiáng)重編程或代替任一種因子的小分子。(i).帶有預(yù)先選定的原病毒的次級(jí)成纖維細(xì)胞為了預(yù)先選擇帶有“正確的”反轉(zhuǎn)錄病毒拷貝的組合和數(shù)量的細(xì)胞，可以利用兩步方案。圖23A-23B概括了這種方法，其依照與用于將小鼠B細(xì)胞重編程成iPS細(xì)胞相同的邏輯[Hanna，2008#6842]。首先，將在0CT4基因中帶有GFP標(biāo)志物以及慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的tetrtTA反式激活子的ES或iPS細(xì)胞分化成成纖維細(xì)胞。這些“初級(jí)”成纖維細(xì)胞將使用DOX誘導(dǎo)型載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所有4種因子，并在DOX存在下培養(yǎng)和篩選0CT4的活化，以分離重編程的“初級(jí)”iPS細(xì)胞。這些iPS細(xì)胞將在不存在DOX下分化，產(chǎn)生“次級(jí)”成纖維細(xì)胞(圖23A)。這種方法的根本原理在于，由于次級(jí)成纖維細(xì)胞在第一步中作為“初級(jí)”iPS細(xì)胞篩選，因此它們帶有“正確的”載體拷貝的組合。這些次級(jí)成纖維細(xì)胞是遺傳同質(zhì)的，因?yàn)樗鼈儚膯我籭PS集落產(chǎn)生。在向這樣的培養(yǎng)物添加DOX后，整合的載體將被重新活化，導(dǎo)致一致地產(chǎn)生“次級(jí)”iPS細(xì)胞，而不需要新的因子轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖23B)。這可以用于產(chǎn)生人類次級(jí)iPS細(xì)胞(或小鼠、猴等)，而不用經(jīng)過從初級(jí)iPS細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)物的過程?？蛇x地，DOX誘導(dǎo)型多順反子載體(圖13A-13C)可用于代替單因子載體，用于產(chǎn)生初級(jí)iPS細(xì)胞。(ii).在COLlAl基因座中帶有重編程因子的次級(jí)成纖維細(xì)胞為了努力避免所有的反轉(zhuǎn)錄病毒感染，產(chǎn)生了在COLlAl基因座或其他非必需基因座例如R0SA26或AAVSI基因座(其中整合了腺相關(guān)病毒(AAV)的特定基因座)中帶有所有重編程因子的次級(jí)成纖維細(xì)胞。在小鼠ES細(xì)胞中，我們已經(jīng)顯示ColIal基因座可以被有效定向，以產(chǎn)生被插入的轉(zhuǎn)基因的可重復(fù)的遍在表達(dá)或誘導(dǎo)型表達(dá)[Beard，2006#6199;Hochedlinger，2005#5758]。構(gòu)建了報(bào)告細(xì)胞，其除了Dox誘導(dǎo)型rtTA反式激活子和0CT4GFP報(bào)告基因之外，還含有插入到COLlA基因座中編碼在tet操作子控制下的所有或一部分重編程因子的多順反子載體(圖24)。在該圖中，0CT4、S0X2和cMYC已被插入到COLlAl基因座中。初級(jí)成纖維細(xì)胞將在體外產(chǎn)生，并用兩側(cè)帶有兩個(gè)Lox位點(diǎn)的KLF4病毒感染。如上所述篩選具有由DOX誘導(dǎo)的三種因子的初級(jí)iPS細(xì)胞，并通過Cre轉(zhuǎn)導(dǎo)刪除KLF4病毒[Hanna，2007#6781]，并通過體外分化產(chǎn)生缺乏VKLF4的次級(jí)成纖維細(xì)胞。這些細(xì)胞可用于篩選在重編程中代替對(duì)KLF4的需要的小分子(參見后文目標(biāo)D)或用于精簡(jiǎn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方案(目標(biāo)B.2，4)。重編程篩選了小部分帶有高的原病毒插入數(shù)量的iPS細(xì)胞。在本目標(biāo)中提出的實(shí)驗(yàn)力圖建立允許更有效和可重復(fù)地重編程的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，同時(shí)過程將不依賴于篩選稀少的iPS細(xì)胞的隨機(jī)原病毒插入。目的是產(chǎn)生攜帶2或3種DOX誘導(dǎo)型因子的任何組合的次級(jí)成纖維細(xì)胞，因此將允許篩選代替失去的因子的小分子，用于我們篩選能夠增強(qiáng)或誘導(dǎo)重編程的小分子的目標(biāo)(目標(biāo)D)。此外，本系統(tǒng)對(duì)于研究重編程的分子機(jī)制也是重要的(目標(biāo)B.4)。B.人類體細(xì)胞的體外重編程DOX誘導(dǎo)型慢病毒系統(tǒng)已被用于確定小鼠成纖維細(xì)胞的重編程動(dòng)力學(xué)。本文描述的工作使用了上面描述的工具來確定人類體細(xì)胞重編程的動(dòng)力學(xué)和最低載體表達(dá)。此外，我們將開發(fā)最小化或避開遺傳改變的重編程方法，并且我們將使用插入誘變來分離增強(qiáng)重編程的其他基因。最后，我們將確定iPS細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)以及重編程的中間階段。C.發(fā)育潛力和從血液供體細(xì)胞的衍生患者特異性iPS細(xì)胞的最重要應(yīng)用是它們?cè)谠嚬苤醒芯繌?fù)雜人類疾病的潛力。對(duì)于這種應(yīng)用來說，需要在該技術(shù)可用于臨床情況下之前，建立起穩(wěn)固的實(shí)驗(yàn)方法。本文描述的工作建立了允許iPS和huES細(xì)胞的可重復(fù)的體外分化和iPS細(xì)胞的體內(nèi)潛力評(píng)估的程序。也可以進(jìn)行從人類外周血樣品分離iPS細(xì)胞。3.B細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作為供體將從外周血樣品獲得的細(xì)胞代替來自深層皮膚活檢組織的細(xì)胞進(jìn)行直接重編程是有利的，因?yàn)檫@將便于在臨床環(huán)境下產(chǎn)生患者特異性iPS細(xì)胞。最近，我們顯示了不成熟和成熟的小鼠B細(xì)胞能夠有效地重編程成多能iPS細(xì)胞，并且這些細(xì)胞帶有供體細(xì)胞特異性的免疫球蛋白基因座的基因重排[Hanna，2008#6842]。令人吃驚的是，重編程成熟小鼠B細(xì)胞的效率是3%，其顯著高于成人成纖維細(xì)胞或MEF的效率。本目標(biāo)將力圖使得用于小鼠類淋巴細(xì)胞的重編程方法適合于人類外周血樣品。供體細(xì)胞需要用c/EBPa轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，以賦予成熟的小鼠B細(xì)胞對(duì)四種重編程因子的作用的易感性[Hanna，2008#6842]。我們將從人類外周血分離各種不同細(xì)胞群，并測(cè)試它們對(duì)重編程的易感性。(i)B和T細(xì)胞為了試圖改造用于小鼠B細(xì)胞重編程的方案，我們將使用已建立的程序來刺激B和T細(xì)胞的增殖[Mercier-Letondal，2008#6855]，并用轉(zhuǎn)導(dǎo)c/EBPa和tetrtTA反式激活子的載體感染細(xì)胞。在細(xì)胞因子中培養(yǎng)幾天后，將細(xì)胞用四種DOX誘導(dǎo)型重編程因子0CT4、S0X2、C-MYC和KLF4轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過形態(tài)和對(duì)多能性標(biāo)志物例如TRA160、SSEA3/4、NANOG和0CT4的表達(dá)進(jìn)行測(cè)試，分離重編程的集落。為了驗(yàn)證iPS細(xì)胞的供體細(xì)胞來源，我們將分析基因組DNA中Ig或TCR重排的存在。(ii)單核細(xì)胞我們使用小鼠的結(jié)果表明，成熟B細(xì)胞重編程中的中間步驟可能是巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞[Hanna，2008#6842]。通過Ficoll梯度離心從人類志愿者的白細(xì)胞層分離單核細(xì)胞，并收集粘附性細(xì)胞。按照已建立的程序?qū)⒓?xì)胞在IL4和GM-CSF中生長(zhǎng)[Damaj，2007#6854]。然后我們將用四種因子0CT4、S0X2、cMYC和KLF4如上所述轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，并在存在DOX的ES細(xì)胞培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。挑取具有iPS形態(tài)的集落，并如上所述分析多能性標(biāo)志物的表達(dá)。血液衍生的iPS細(xì)胞的發(fā)育潛力將通過標(biāo)準(zhǔn)程序例如畸胎瘤形成和體外分化進(jìn)行評(píng)估。目前，分離患者特異性iPS細(xì)胞的策略設(shè)想的是對(duì)源自于深層皮膚活檢組織的供體細(xì)胞進(jìn)行重編程，該程序比采血更為復(fù)雜和痛苦。對(duì)于常規(guī)臨床應(yīng)用來說，設(shè)計(jì)從外周血樣品常規(guī)分離患者特異性iPS細(xì)胞的可重復(fù)的方案是明顯有利的。我們期望所提出的實(shí)驗(yàn)將幫助建立這樣的方案。由于小鼠B細(xì)胞重編程的簡(jiǎn)便和效率，我們得到鼓勵(lì)，這種方案在人類外周血衍生細(xì)胞的重編程中也應(yīng)該是有效的。因?yàn)锽或T細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞將在Ig或TCR基因座中分別帶有遺傳重排，因此使用巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞作為供體對(duì)于潛在的治療應(yīng)用可能是有利的，因?yàn)樗鼈儗⒉粠в羞z傳改變。盡管我們不了解導(dǎo)致c/EBPa賦予成熟B細(xì)胞對(duì)0CT4、S0X2、cMYC和KLF4引起的重編程有易感性的機(jī)制，但它可能涉及B細(xì)胞的身份向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[Xie，2004#5447]。這些考慮表明，從人類單核細(xì)胞產(chǎn)生iPS細(xì)胞可能是直接的。但是，如果在小鼠中開發(fā)的程序不能產(chǎn)生血液衍生的人類iPS細(xì)胞，我們將使用已建立的方法篩選其他因子。D.對(duì)小分子的篩選通過反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、特別是癌基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)來誘導(dǎo)重編程，呈現(xiàn)了對(duì)這種方法的最終治療性應(yīng)用的嚴(yán)重障礙。例如，我們和其他人[Okita，2007#6542]已經(jīng)看到，由于v-mycc-Myc的活化，在iPS細(xì)胞產(chǎn)生的嵌合體中形成了腫瘤。因此，鑒定增加重編程效率或活化相關(guān)途徑并因此取代了對(duì)表達(dá)給定因子例如C-MYC或KLF4的需要的小分子，將是有利的。本目標(biāo)的目的是建立高通量的基于細(xì)胞的分析系統(tǒng)，用于從化學(xué)文庫(kù)中篩選這樣的化合物。D.I用于小分子文庫(kù)篩選的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和報(bào)告細(xì)胞為了在高通量篩選中檢測(cè)重編程，我們需要帶有標(biāo)志物例如插入到內(nèi)源0CT4或NANOG基因座中的GFP的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞將不表達(dá)標(biāo)志物,但是可用于篩選活化任一內(nèi)源基因的化合物。為了設(shè)立用于重編程的高通量篩選，我們考慮了限制實(shí)驗(yàn)涉及的兩個(gè)主要制約因素。異質(zhì)細(xì)胞群最關(guān)鍵的限制大概是胞用四種因子轉(zhuǎn)導(dǎo)成纖維細(xì)將產(chǎn)生遺傳上異質(zhì)的細(xì)胞群。正如前面在V.A.3中討論的，可能只有帶有特定數(shù)量的病毒載體、能夠產(chǎn)生四種因子的“正確的”表達(dá)水平或表達(dá)水平的“正確的”組合的少部分感染細(xì)胞，才能在重編程篩選時(shí)被篩選到。因此，每個(gè)孔中的感染細(xì)胞在病毒整合和病毒拷貝數(shù)方面不同，阻礙了在篩選中對(duì)暴露于不同化合物的孔進(jìn)行有意義的比較。分析法的標(biāo)志物活化頻率、靈敏度和時(shí)間限制為了建立篩選，另一個(gè)重要的考慮涉及檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度需要多少細(xì)胞表達(dá)0CT4-GFP報(bào)告基因才能在給定孔中被檢測(cè)至IJ報(bào)告基因的表達(dá)是一個(gè)重要制約因素，因?yàn)橹鼐幊碳?xì)胞的比例需要足夠高，以在具有活性化合物的孔中產(chǎn)生至少單個(gè)可檢測(cè)的重編程事件。此外，重編程的細(xì)胞只有在用四種因子感染后3到5周才在成纖維細(xì)胞群中出現(xiàn)。因此，被感染的細(xì)胞需要在這段時(shí)間內(nèi)在96孔或384孔板中存活并增殖，這限制了可以鋪板的細(xì)胞的數(shù)量。為了克服這些限制，我們將產(chǎn)生遺傳上同質(zhì)的成纖維細(xì)胞群，因?yàn)樗鼈?i)帶有相同數(shù)量的載體整合或(ii)帶有通過同源重組插入到內(nèi)源表達(dá)基因座中的各種不同的重編程因子組合。(i).帶有特定和預(yù)定的原病毒組合的“次級(jí)”克隆成纖維細(xì)胞最近，我們顯示了可以從通過用轉(zhuǎn)導(dǎo)四種轉(zhuǎn)錄因子0ct4、Sox2、c-myc和Klf4的DOX誘導(dǎo)型慢病毒對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行感染而產(chǎn)生的“初級(jí)”iPS細(xì)胞來產(chǎn)生“次級(jí)”小鼠iPS細(xì)胞[Hanna，2008#6842]。因?yàn)樵凇按渭?jí)”成纖維細(xì)胞中帶有原病毒拷貝的“正確”組合和數(shù)量，因此不需要病毒感染來誘導(dǎo)B細(xì)胞向次級(jí)次級(jí)iPS細(xì)胞的重編程。我們將按照與預(yù)先選擇帶有“正確的”反轉(zhuǎn)錄病毒拷貝組合和數(shù)量的細(xì)胞相似的方案。如圖23A-23B中所示，通過不使用DOX的體外分化從“初級(jí)”iPS細(xì)胞產(chǎn)生了“次級(jí)”成纖維細(xì)胞。代替使用轉(zhuǎn)導(dǎo)單個(gè)因子的載體，我們將替代地使用如圖13A-13C和14A-14E中所述的多順反子構(gòu)建物來轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的不同組合。正如在VI.A.3中概述的，這種使用“次級(jí)”成纖維細(xì)胞或B細(xì)胞的方法引起了重編程因子的有效和DOX依賴性的活化，導(dǎo)致不需任何附加的病毒感染即可形成iPS[Hanna，2008#6842]。為了評(píng)估在添加DOX后產(chǎn)生的iPS細(xì)胞的比例，我們將在96孔板中每個(gè)孔鋪板500到1000個(gè)細(xì)胞，在384孔板中每個(gè)孔鋪板約100個(gè)細(xì)胞，并評(píng)估了GFP陽性細(xì)胞的比例。在小鼠細(xì)胞中的結(jié)果表明，次級(jí)iPS細(xì)胞只在DOX誘導(dǎo)后2到3周才產(chǎn)生。因?yàn)榧?xì)胞在96孔或384孔板中只能培養(yǎng)約7天，因此我們將在鋪板前用DOX對(duì)次級(jí)成纖維細(xì)胞預(yù)處理不同的時(shí)間。(ii).在COLlAl基因座中帶有DOX誘導(dǎo)型重編程因子的轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞我們已經(jīng)顯示，插入到Collal基因座中的轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中高度表達(dá)，并且如果在tet操作子的控制之下，在施加DOX后能夠在所有組織中可重復(fù)地活化[Beard，2006#6199；Hochedlinger,2005#5758]。我們將把在tet操作子控制之下表達(dá)3種或所有4種重編程因子的不同組合的多順反子構(gòu)建物插入到在0CT4基因座中帶有GFP標(biāo)志物的huES細(xì)胞的COLlAl基因座中(圖10)。此外，將細(xì)胞用轉(zhuǎn)導(dǎo)rtTA反式激活子的慢病毒載體感染。細(xì)胞將分化成次級(jí)成纖維細(xì)胞，其可篩選增強(qiáng)重編程或代替給定因子的化合物(參見后文，圖24)。D.2篩選增強(qiáng)重編程效率的化合物為了篩選增加重編程效率的化合物，我們將在DOX存在下培養(yǎng)帶有所有四種因子的“正確”組合的次級(jí)iPS細(xì)胞或在COLlAl基因座中帶有所有四種因子的成纖維細(xì)胞(圖24)。在初步實(shí)驗(yàn)中，我們將確定可以在篩選中檢測(cè)到的GFP陽性細(xì)胞的比例。由于從用四種因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的重編程細(xì)胞的比例低，因此除非給定化合物顯著增加重編程細(xì)胞的比例，否則在每個(gè)96孔或384孔板可以鋪板的1000或100個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)單個(gè)重編程細(xì)胞可能是困難或不可能的。但是，該分析法具有非常低的背景，這補(bǔ)償了固有的低信號(hào)。在試篩選中，我們將測(cè)試在四種因子報(bào)告細(xì)胞中產(chǎn)生的GFP陽性細(xì)胞的比例，所述報(bào)告細(xì)胞在DOX存在下培養(yǎng)并且用或沒有用5-&^(1(處理或0匪1'1siRNA載體進(jìn)行感染，這兩種處理方式都將降低整體DNA甲基化水平，是已顯示出能增加小鼠成纖維細(xì)胞的重編程的處理[Mikkelsen，2008#6891]。在任何這些條件下GFP陽性細(xì)胞的比例，將決定在嚴(yán)緊性較低的篩選中需要在每個(gè)孔鋪板多少個(gè)細(xì)胞才能檢測(cè)增加GFP陽性細(xì)胞比例的化合物。更嚴(yán)緊的篩選將使用未用5-azadC處理或未用DNMTlsiRNA載體感染的細(xì)胞，因?yàn)檫@將對(duì)未增敏的細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以篩選與上述相比更有效地活化報(bào)告基因的化合物。D.3篩選代替四種因子任一種的化合物為了篩選能夠代替任一反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的因子的化合物，我們將用可以獨(dú)立調(diào)控的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。方法的概念是三種因子在一個(gè)誘導(dǎo)型系統(tǒng)的控制之下，第四種因子在獨(dú)立的誘導(dǎo)型控制之下。我們將使用兩種不同策略產(chǎn)生用于篩選的細(xì)胞。(i)三苯氧胺誘導(dǎo)型載體我們已產(chǎn)生了轉(zhuǎn)導(dǎo)0CT4、S0X2、KLF4和C-MYC雌激素受體(ER)融合構(gòu)建物的載體[Grandori，1996#6505]，通過向培養(yǎng)基添加三苯氧胺激活其表達(dá)(圖11B)。如圖26中所概述，0CT4-GFP報(bào)告初級(jí)成纖維細(xì)胞將用表達(dá)三種三苯氧胺誘導(dǎo)型因子的反轉(zhuǎn)錄病毒和從DOX依賴性載體表達(dá)的第四種因子轉(zhuǎn)導(dǎo)。感染的細(xì)胞將生長(zhǎng)在含有三苯氧胺和DOX的培養(yǎng)基中，并通過篩選GFP表達(dá)選擇“初級(jí)”iPS細(xì)胞。如上所述，產(chǎn)生次級(jí)成纖維細(xì)胞，將其暴露于三苯氧胺以活化三種三苯氧胺依賴性因子，并在不存在DOX和cMYC表達(dá)的情況下篩選活化GFP報(bào)告基因的小分子化合物。(ii)在COLlAl基因座中帶有不同因子組合的轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞我們將采取圖24中概述的避免反轉(zhuǎn)錄病毒感染的替代策略。初級(jí)成纖維細(xì)胞將從除了0CT4-GFP標(biāo)志物和轉(zhuǎn)導(dǎo)了tetM2rtTA反式激活子的病毒之外還在COLlAl基因座中帶有編碼三種重編程因子的任何組合的多順反子構(gòu)建物的huES細(xì)胞產(chǎn)生[Beard，2006#6199；Hochedlinger,2005#5758];對(duì)比圖13A-13C和14A-14E)。將成纖維細(xì)胞用兩側(cè)帶有Lox并帶有失去的第四種因子(圖24中是KLF4)的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，并將產(chǎn)生初級(jí)iPS細(xì)胞。在Cre轉(zhuǎn)導(dǎo)以刪除KLF4載體后，將產(chǎn)生次級(jí)成纖維細(xì)胞。DOX暴露將活化插入到COLlAl基因座中的三種DOX依賴性因子，并且細(xì)胞將可用于篩選在不存在失去的第四種因子(在這種情況下是KLF4)的情況下活化GFP報(bào)告基因的小分子。為了增加篩選的靈敏度，我們將使用已用5-aza-dC處理的細(xì)胞。D.4篩選平臺(tái)小分子文庫(kù)的篩選將與Scripps的S.Ding的實(shí)驗(yàn)室合作進(jìn)行(參見S.Ding的來信)。例如，Ding的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開發(fā)并優(yōu)化了基于細(xì)胞的表型高通量篩選[Xu，2008#6875]，并鑒定到在化學(xué)確定培養(yǎng)基中并且不存在LIF的情況下維持ES細(xì)胞的自身更新的小分子pluripotin[Chen,2006#6871]。篩選是基于0ct4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP標(biāo)志物的表達(dá)。我們將針對(duì)GFP活化來篩選帶有上述不同的因子組合的0CT4-GFP轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞。任何在篩選中得分為正的化合物的活性，將在確定的培養(yǎng)條件下驗(yàn)證。主要問題是調(diào)查參與重編程過程的分子途徑?？赡艿慕Y(jié)果和解釋我們預(yù)期對(duì)OCT基因活化的篩選將鑒定到促進(jìn)從體細(xì)胞表觀遺傳狀態(tài)向具有多能細(xì)胞特征的狀態(tài)轉(zhuǎn)變、并因此使重編程過程更加有效的化合物。這些實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)重要目的是發(fā)現(xiàn)能夠代替對(duì)涉及編碼癌基因例如cMYC、0CT4或KLF4的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的遺傳操作的需要的小分子化合物。高通量篩選的兩個(gè)最重要的潛在問題是⑴發(fā)生重編程所需的時(shí)間，以及(ii)在可以鋪于96或384孔板的每個(gè)孔中的有限細(xì)胞數(shù)量中是否可以檢測(cè)到稀少的重編程事件。正如上面討論的，我們將對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)調(diào)制使其帶有“正確的”因子數(shù)量和組合，并進(jìn)一步增敏細(xì)胞以增加各種報(bào)告基因的重編程誘導(dǎo)的活化頻率。一旦鑒定到增加重編程效率的化合物，它們將在隨后的篩選中用作增敏劑，以篩選能夠進(jìn)一步增加iPS細(xì)胞形成的其它化合物。重要性現(xiàn)有的誘導(dǎo)重編程的策略依賴于強(qiáng)有力的癌基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)，這對(duì)于任何治療性應(yīng)用來說是是一種障礙。本目標(biāo)力圖鑒定能夠活化相關(guān)途徑的小分子，從而提高效率并可能使誘導(dǎo)重編程所需的遺傳改變降到最低。重要性和長(zhǎng)期意義體外產(chǎn)生多能iPS細(xì)胞的方法有希望革新復(fù)雜人類疾病的研究，并對(duì)最終治療變性疾病具有重要意義。已經(jīng)顯示，小鼠體細(xì)胞向多能狀態(tài)的體外重編程相當(dāng)有效，并且正在對(duì)該過程背后的分子機(jī)制進(jìn)行積極的研究。但是，已證明人類細(xì)胞的重編程更加繁瑣和困難，在該技術(shù)可適用于臨床應(yīng)用之前有大量技術(shù)問題需要解決。本文描述的工作力圖確定導(dǎo)致人類體細(xì)胞向多能狀態(tài)轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制，以設(shè)計(jì)用于評(píng)估人類iPS細(xì)胞的發(fā)育潛力的策略并且不需要遺傳操作即可實(shí)現(xiàn)重編程。本文描述的工作將有助于解決目前阻礙該技術(shù)應(yīng)用于人類疾病研究及其最終用于變性疾病的移植療法的一些關(guān)鍵障礙。實(shí)施例3:使用單一多順反子載體重編程鼠類和人類體細(xì)胞材料和方法病毒制備和感染在從FUW慢病毒骨架進(jìn)行EcoRI克隆后，產(chǎn)生了含有在四環(huán)素操作子和最小CMV啟動(dòng)子控制下的0ct4、SoX2、Klf4和c-Myc的4F2A慢病毒載體構(gòu)建物。所有構(gòu)建物都在通過PCR擴(kuò)增后使用獨(dú)特的限制性位點(diǎn)以將單個(gè)因子置于相應(yīng)的2A肽之間來產(chǎn)生(第一個(gè)XbaI-NheI;第二個(gè)SphI;第三個(gè)XhoI;第四個(gè)AscI)。相應(yīng)的2A序列為P2A-GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT(SEQIDNO21)；T2A-GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT(SEQIDNO:22)；E2A-CAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAACCCAGGTCCC(SEQIDNO.23)。不能復(fù)制的慢病毒粒子(4F2A和M2rtTA)在293T細(xì)胞中用VSV-G外殼包裝，并用于感染含有靶向內(nèi)源Nanog基因座的GFP等位基因的MEF(25)(7)。按照以前的出版物，從小鼠產(chǎn)生14周齡的尾梢成纖維細(xì)胞(12)。人類角化細(xì)胞(NHFK)從Coriell醫(yī)學(xué)研究所(CoriellInstituteforMedicalResearch)Camden,NJ獲得。將來自包裝兩種病毒中的每種的培養(yǎng)物的病毒上清液合并，通過O.45μM濾膜過濾，并通過超離心進(jìn)行濃縮。將病毒沉淀重懸浮在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中(DMEM中添加有10%FBS(Hyclone)、白血病抑制因子、β-巰基乙醇(Sigma-Aldrich)、青霉素/鏈霉素、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸(都來自Invitrogen)),然后施加于細(xì)胞24小時(shí)。Western印跡100μI裂解緩沖液含有2%SDSUOmM二硫蘇糖醇、10%甘油、12%尿素、IOmMTris-HCKpH7.5)、lmM苯基甲基磺酰氟、Ix蛋白酶抑制劑混合物(Roche),25μMMG132蛋白體(protesome)抑制劑，并將其煮沸5分鐘。然后使用Bradford試劑(Pierce)并在590nm處獲取分光光度讀數(shù)，對(duì)蛋白進(jìn)行定量。對(duì)照使用牛血清白蛋白產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線估算濃度。將總蛋白(5μg)在含有10%SDS的10%變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。然后使用半干式轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜上(Millipore)。將膜在含有2%脫脂奶粉(Bio-Rad)的PBS、0.01%吐溫20中阻斷。通過與阻斷溶液中濃度為50ng/ml的抗體一起溫育來檢測(cè)蛋白。使用的抗體是0ct4(h_134SantaCruzBiotechnology)>Sox2(小鼠單克隆抗體，R&DBiosystems)、c_Myc(06_340Upstate)、Klf4(H-180SantaCruzBiotechnology)、GAPDH(sc-25778SantaCruzBiotechnology)。定量RT-PCR使用Trizol試劑(Invitrogen)分離總RNA。將5微克總RNA使用無DNA的RNA試劑盒(ZymoResearch),用DNaseI處理以除去基因組DNA的潛在污染。使用第一鏈合成試劑盒(Invitrogen)對(duì)I微克DNaseI處理過的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并最終重懸浮在IOOmyI水中。使用1/50的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,在ABIPrism7000(AppliedBiosystems)中，使用帶有ROX的PlatinumSYBRgreenqPCRSuperMix-UDG(Invitrogen)進(jìn)行一式三份的定量PCR分析。通過擴(kuò)增GAPDHmRNA來實(shí)現(xiàn)等量上樣，并且所有反應(yīng)進(jìn)行三份平行樣。用于擴(kuò)增的引物如下0ct4F,5/-ACATCGCCAATCAGCTTGG-3'(SEQIDNO:24)和R，5'-AGAACCATACTCGAACCACATCC-3'(SEQIDNO:25)Sox2F，5'-ACAGATGCAACCGATGCACC-3'(SEQIDNO:26)和R，5'-TGGAGTTGTACTGCAGGGCG-3'(SEQIDNO:27)4F2A(E2A-cMyc)F，5'-GGCTGGAGATGTTGAGAGCAA-3'(SEQIDNO:28)和R，5'-AAAGGAAATCCAGTGGCGC-3'(SEQIDNO:29)GAPDHF,5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3'(SEQIDNO:30)和R，5'-CCCTTTTGGCTCCACCCT-3'(SEQIDNO31)誤差線表示三份平行反應(yīng)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。Southern印跡分析將IOygBamHI消化的基因組DNA在O.7%瓊脂糖凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Amersham)，并與32P隨機(jī)引物(Stratagene)標(biāo)記的針對(duì)0CT4(pFUff-tet0-0CT4質(zhì)粒的EcoRI-PstI片段)、KLF4(全長(zhǎng)KLF4cDNA)、c-MYC(全長(zhǎng)c_MYCcDNA)和S0X2(PFUW-tetO-SOX2質(zhì)粒的全長(zhǎng)片段)的探針雜交。免疫突光染色將細(xì)胞在4%聚甲醛中在25°C下固定20分鐘，用PBS清洗三次，并用含有O.1%Triton-X和5%FBS的PBS阻斷15分鐘。在與針對(duì)0ct4(SantaCruzh_134)、Sox2(R&DBiosystems)、Nanog(anti-msR&D和anti-h)、Tra-1-60(小鼠單克隆抗體，ChemiconInternational)、hNANOG(山羊多克隆抗體，R&DSystems)、mNANOG(BethylA300-398A)、Tral-81(小鼠單克隆抗體，ChemiconInternational)、SSEA4和SSEAl(小鼠單克隆抗體，DevelopmentalStudiesHybridomaBank)的第一抗體在含有O.I%Triton-X和I%FBS的PBS中溫育I小時(shí)后，將細(xì)胞用PBS清洗三次，并與從JacksonImmunoresearch購(gòu)買的熒光團(tuán)標(biāo)記的適合的第二抗體溫育。將樣本在Olympus突光顯微鏡上分析,使用ZeissAxiocam相機(jī)獲取照片。小鼠嵌合體和畸胎瘤的形成將二倍體囊胚(hCG注射后94-98小時(shí))置于礦物油下的一滴Ifepes-CZB培養(yǎng)基中。使用內(nèi)徑為16μm的平頭顯微注射移液器進(jìn)行iPS細(xì)胞注射。每個(gè)囊胚接受8-10個(gè)iPS細(xì)胞。注射后，將囊胚在鉀單純優(yōu)化培養(yǎng)基(KSOM)中在37°C下培養(yǎng)并放置，直到將其轉(zhuǎn)移到雌性受體中。將約10個(gè)注射過的囊胚轉(zhuǎn)移到交配后2.5天的假孕B6D2F1雌性的每個(gè)子宮角。在第19.5天回收幼仔，如果需要交由分泌乳汁的B6D2F1母鼠喂養(yǎng)。通過將2xl06個(gè)細(xì)胞沉積到受體SCID或Rag2-/_小鼠的側(cè)脅來進(jìn)行對(duì)于畸胎瘤的形成。在3_6周后分離腫瘤進(jìn)行組織學(xué)分析。人類畸胎瘤的形成和分析通過膠原酶處理(I.5mg/ml)收集hiPSC，并通過隨后用培養(yǎng)基清洗并沉降iPSC集落而與飼養(yǎng)細(xì)胞分離。通過離心收集iPSC集合體，并以IO6個(gè)細(xì)胞的比率重新懸浮在250μIiPSC培養(yǎng)基中。通過21號(hào)針頭將iPSC皮下注射到SCID小鼠(Taconic)的背部。在6周內(nèi)發(fā)展出腫瘤，并在腫瘤尺寸超過直徑I.5cm之前將動(dòng)物處死。在處死小鼠后分離畸胎瘤，并在福爾馬林中固定。在切片后，根據(jù)蘇木精和曙紅染色診斷畸胎瘤。使用CLGenetics(Madison,WI)分析核型。人類IPS細(xì)胞體外分化成神經(jīng)元祖細(xì)胞使人類角化細(xì)胞iPS細(xì)胞不傳代在培養(yǎng)物中過量生長(zhǎng)兩周，每天更換培養(yǎng)基。在傳代后第15天觀察到清晰的神經(jīng)菊形團(tuán)，并通過合并玻璃移液管進(jìn)行機(jī)械挑取(26)。將菊形團(tuán)重新鋪在用15μg/ml聚鳥氨酸/10μg/ml層粘連蛋白(Po/Lam)預(yù)包被的板上，在添加有FGF2(20ng/ml)和EGF(20ng/ml)(都來自R&DSystems)的N2B27培養(yǎng)基中。在5-7天后，通過在N2B27培養(yǎng)基中用細(xì)胞刮刀刮擦和吸取使細(xì)胞分離成單細(xì)胞，并重新鋪板在Po/Lam培養(yǎng)皿上。分化和免疫細(xì)胞化學(xué)神經(jīng)元祖細(xì)胞的分化的誘導(dǎo)，通過從培養(yǎng)基中撤除FGF2和EGF五天來進(jìn)行。將細(xì)胞在4%聚甲醛中固定20分鐘，并對(duì)人類巢蛋白(Chemicon;1100)和Tuj-I(I100)進(jìn)行染色，然后用PBS清洗3次,并與從JacksonImmunoresearch購(gòu)買的突光團(tuán)標(biāo)記的適合的第二抗體進(jìn)行溫育。將樣本在Olympus突光顯微鏡上分析,并使用ZeissAxiocam相機(jī)獲取圖像。結(jié)果使用來自一個(gè)啟動(dòng)子的兩種、三種或所有四種重編程因子的不同組合構(gòu)建載體。目標(biāo)是產(chǎn)生能夠使用2A肽從單個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)多個(gè)重編程基因的多順反子病毒載體。為此，將一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)含有獨(dú)特限制性位點(diǎn)的2A寡肽連接到FUW慢病毒(18)骨架中，以允許有效克隆各被不同2A序列隔開的0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4。對(duì)于使用不同組合的F2A、T2A、E2A或P2A序列來連續(xù)攜帶四個(gè)、三個(gè)或兩個(gè)因子的載體(圖13A和14A)，通過在人類293細(xì)胞中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測(cè)試了它們表達(dá)各個(gè)因子的能力。Western印跡分析證明2A肽支持兩個(gè)、三個(gè)或所有四個(gè)順反子從單個(gè)多順反子載體的有效表達(dá)(圖14B)。為了測(cè)試多順反子載體對(duì)于重編程的用途，我們一開始將帶有2或3種重編程因子的不同組合的反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到MEF中，并顯示這些構(gòu)建物與帶有另外的單因子cDNA的載體組合，能夠產(chǎn)生iPS細(xì)胞。重要的是，帶有所有四種因子的多順反子載體能夠產(chǎn)生iPS細(xì)胞。在該初步實(shí)驗(yàn)中，我們將0ct4-GFP成纖維細(xì)胞用多順反子Sox2-0ct4-Klf4-myc載體和附加的0ct4載體共轉(zhuǎn)染(以解釋重編程可能需要相對(duì)多0ct4蛋白的可能性；圖13B)。圖13B顯示獲得的iPS細(xì)胞表達(dá)AP、SSEA、Nanog和0ct4。此外，從用四因子2A載體加0ct4Moloney病毒感染的iPS細(xì)胞系產(chǎn)生了成年嵌合體。為了確定原病毒整合的數(shù)量，將Southern印跡用Sox2、Klf4、c-myc和0ct4探針順序雜交。圖13C顯示出在3個(gè)不同的被測(cè)iPS細(xì)胞系中的2個(gè)中整合有單個(gè)多順反子載體，并且在第三個(gè)細(xì)胞系中帶有2個(gè)原病毒(在該細(xì)胞系4F0#14中，在一個(gè)原病毒中c-myc序列缺失)。令人吃驚的是，在每個(gè)iPS細(xì)胞系中帶有另外的8到11個(gè)0ct4原病毒，表明了對(duì)多個(gè)0ct4原病毒整合的強(qiáng)烈篩選。因?yàn)槲覀冊(cè)谟伤膫€(gè)分別轉(zhuǎn)導(dǎo)的因子誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞中從未看見超過4個(gè)或5個(gè)0ct4原病毒，因此盡管不能排除，但篩選不太可能是針對(duì)高0ct4表達(dá)的。另一種解釋是對(duì)于多個(gè)原病毒的篩選是由于對(duì)未知細(xì)胞基因的插入活化的選擇。這些初始數(shù)據(jù)表明可以從單個(gè)多順反子原病毒表達(dá)至少3種重編程因子以誘導(dǎo)重編程。正如將在下面進(jìn)一步描述的，我們接下來僅僅使用帶有四種因子的多順反子載體成功地產(chǎn)生了鼠類iPS細(xì)胞，并且也已使用多順反子載體系統(tǒng)以產(chǎn)生帶有最少遺傳變化的人類iPS細(xì)胞。構(gòu)建了四環(huán)素誘導(dǎo)型慢病毒載體，其中基因的表達(dá)受到四環(huán)素操作子最小啟動(dòng)子(tetOP;圖14C)的控制。為了測(cè)試單個(gè)四因子(0ct4/Sox2/Klf4/c-Myc)病毒的所有四種基因是否能夠在添加DOX后表達(dá)，將MEF用多順反子載體(在下文中稱為“4F2A”)以及帶有四環(huán)素可控的反式激活子(M2rtTA;縮寫為rtTA)的組成型FUW慢病毒進(jìn)行感染。進(jìn)行了兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，并在感染后三天通過qRT-PCR測(cè)試病毒的藥物誘導(dǎo)型表達(dá)。使用針對(duì)病毒特異性轉(zhuǎn)錄本(E2A-cMyc)的引物，在用DOX培養(yǎng)的細(xì)胞中與對(duì)照培養(yǎng)基中的細(xì)胞相比，觀察到了強(qiáng)烈的表達(dá)(7-10倍)(圖14D)。為了測(cè)試與ES細(xì)胞相比的相對(duì)誘導(dǎo)，使用了不能區(qū)別病毒轉(zhuǎn)錄本或內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本的0ct4和Sox2引物，并且在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，感染的DOX誘導(dǎo)的MEF明顯高于在ES細(xì)胞中(分別超過ES水平3.5和17倍)。在感染后第3天分離的細(xì)胞的Western印跡分析表明，當(dāng)細(xì)胞不用DOX培養(yǎng)時(shí)只有很少或沒有蛋白表達(dá)，而在DOX存在下看到強(qiáng)有力的誘導(dǎo)，其中0ct4和Sox2蛋白的水平與ES細(xì)胞中相似(圖14E)。為了測(cè)試4F2A載體是否能夠?qū)Ⅲw細(xì)胞重編程到多能狀態(tài)，將含有由內(nèi)源Nanog啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP報(bào)告基因的MEF用病毒(4F2A+rtTA)感染。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)，85-90%的細(xì)胞對(duì)0ct4染色，表明了高滴度的感染(圖15A)。在添加DOX后幾天觀察到形態(tài)變化(數(shù)據(jù)未顯示)，明顯的集落約8天后出現(xiàn)，Nanog-GFP+細(xì)胞在DOX誘導(dǎo)后約25天出現(xiàn)(圖15B)。在機(jī)械分離并隨后傳代后，細(xì)胞具有典型的ES細(xì)胞形態(tài)并且生長(zhǎng)不依賴于D0X。建立了四個(gè)獨(dú)立的4F2AiPS細(xì)胞系，它們對(duì)于多能性標(biāo)志物AP、SSEAl和Nanog-GFP是陽性的(圖15C)。為了調(diào)查成年體細(xì)胞是否能夠使用4F2A載體重編程，我們用4F2A+rtTA載體感染了來自14周齡小鼠的尾梢成纖維細(xì)胞(TTF)。與MEF相似，在添加DOX培養(yǎng)基后幾天，觀察到了典型的形態(tài)變化。集落在8天左右出現(xiàn)并繼續(xù)擴(kuò)增，直到根據(jù)形態(tài)將它們挑出(第16天)。在幾次傳代后，建立了四個(gè)穩(wěn)定的iPS細(xì)胞系，其對(duì)于所有多能性標(biāo)志物(Nanog、0ct4、SSEA、AP)染色為陽性(圖15C)。將MEFiPS細(xì)胞系皮下注射到SCID小鼠中，并顯示誘導(dǎo)了含有所有三種胚層的分化細(xì)胞的畸胎瘤(圖16A)。最后，將MEFiPS細(xì)胞(#4)注入囊胚產(chǎn)生了新出生的嵌合體(圖16B)，證明了單一4F2A多順反子病毒能夠?qū)EF重編程到多能狀態(tài)。為了確定4F2AiPS細(xì)胞系中攜帶的原病毒數(shù)量，提取DNA，并使用不在載體序列中切開的酶進(jìn)行Southern印跡分析。使用0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4探針進(jìn)行雜交,我們檢測(cè)到分子量一致的條帶，證實(shí)了因子序列攜帶在一個(gè)原病毒中。對(duì)于帶有單個(gè)病毒插入的iPS細(xì)胞系#4，原病毒的總數(shù)介于I到3之間(圖16C)。來自iPS細(xì)胞系#1的兩個(gè)整合中的一個(gè)在C-Myc雜交后不能產(chǎn)生條帶,表明可能發(fā)生了c-Myc序列的3'缺失。第二個(gè)消化證實(shí)了原病毒拷貝數(shù)(圖18A)。為了估計(jì)重編程效率，將MEF用4F2A和rtTA載體感染，并以每個(gè)IOcm培養(yǎng)皿O.25xl06個(gè)鋪板。在感染后48小時(shí)，通過0ct4免疫染色估計(jì)有約70%的MEF被感染(圖19A)。將細(xì)胞在含有DOX的ES培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天，然后轉(zhuǎn)移到ES細(xì)胞培養(yǎng)基中，直到在第25天對(duì)GFP+集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。在三個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)皿中檢測(cè)到平均14.7±4個(gè)集落(10+10+17)，表明相對(duì)效率為O.0001%。這比“初級(jí)”感染的成纖維細(xì)胞低I到2個(gè)數(shù)量級(jí)(3，7)。為了測(cè)試使用4F2A病毒進(jìn)行重編程的動(dòng)力學(xué)，我們進(jìn)行了dox撤回實(shí)驗(yàn)，其中在指定的天數(shù)(即2、4、8、12等)，將含有DOX的培養(yǎng)基用ES培養(yǎng)基代替，并在第25天對(duì)Nanog-GFP+集落的數(shù)量計(jì)數(shù)。使用分別的藥物誘導(dǎo)型病毒遞送四種因子，據(jù)報(bào)道9-12天是用于產(chǎn)生穩(wěn)定的iPS細(xì)胞的最少時(shí)間(20，21)。在該時(shí)間期間不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，以便最小化重編程事件的復(fù)制。進(jìn)行了兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，在兩種情況下都在DOX培養(yǎng)基中培養(yǎng)的板上出現(xiàn)單個(gè)Nanog-GFP+集落，與使用分別的病毒所需的最少時(shí)間相似(圖14B)。這些數(shù)據(jù)證明，含有通過三個(gè)2A肽相連的四種因子的單一多順反子病毒，使因子的表達(dá)足以從胚胎或成年體細(xì)胞產(chǎn)生iPS細(xì)胞。重要的是，我們的結(jié)果還顯示，單個(gè)多順反子原病毒拷貝足以使體細(xì)胞重編程為多能性。使用單個(gè)多順反子病毒產(chǎn)生人類iPS細(xì)胞為了研究人類細(xì)胞是否能夠用多順反子載體進(jìn)行重編程，將新生兒的人類包皮角化細(xì)胞(NHFK)用組成型rtTA和DOX誘導(dǎo)型4F2A載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)對(duì)0ct4進(jìn)行染色，確定了被感染的細(xì)胞比例為10%(圖20A)。將細(xì)胞在角化細(xì)胞培養(yǎng)基+DOX中溫育，并允許其生長(zhǎng)6天，直到將它們?cè)诿髂z化的板上在hESC培養(yǎng)基+DOX中進(jìn)行傳代和培養(yǎng)。集落在第12天首次出現(xiàn)，并且大多數(shù)顯示出轉(zhuǎn)變的形態(tài)，有幾個(gè)集落表現(xiàn)出類似hESC樣形態(tài)的獨(dú)特外觀。在感染后22到35天之間挑取在獨(dú)立的感染中產(chǎn)生的兩個(gè)這樣的集落，并發(fā)現(xiàn)其擴(kuò)增成具有類似hESC形態(tài)的清晰集落(圖17A)。將這些細(xì)胞在不存在DOX下擴(kuò)增，并在附加的2-5次傳代后產(chǎn)生了與hESC—致的同質(zhì)群(Ker-iPS)。細(xì)胞對(duì)多能性標(biāo)志物AP、0ct4、Nanog、Sox2、SSEA4、Tral-60、Tral-81染色(圖17B、圖10B)，并具有正常核型(圖17C)。DNA指紋分析排除了這些Ker-iPS細(xì)胞系是來自于我們實(shí)驗(yàn)室以前建立的人類iPS細(xì)胞或hES細(xì)胞系的污染(數(shù)據(jù)未顯示)。為了確定Ker-iPS細(xì)胞系中的原病毒拷貝數(shù)，提取基因組DNA，并使用不在載體序列中切開的酶進(jìn)行Southern印跡分子。針對(duì)所有四種重編程因子的探針再次顯示出與同樣分子量條帶的雜交，表明它們攜帶在單一病毒上。兩種不同的消化(XbaI&BamHI)顯示出4F2A原病毒拷貝數(shù)分別是3(#1.I)和2(#3)(圖21A-B)。為了測(cè)試多能性，將一個(gè)細(xì)胞系Ker_iPS#l.I皮下注射到SCID小鼠中。這些細(xì)胞誘導(dǎo)了畸胎瘤，并在組織學(xué)檢查后發(fā)現(xiàn)分化成所有三種胚層的細(xì)胞(圖17D)。此外，Ker-iPS#l.I細(xì)胞當(dāng)進(jìn)行體外神經(jīng)分化方案時(shí)，通過免疫染色檢測(cè)到產(chǎn)生了巢蛋白+神經(jīng)祖細(xì)胞群以及Tujl+有絲分裂后的神經(jīng)元(圖17E)。討論上面描述的實(shí)驗(yàn)顯示，插入到多順反子載體中由2A序列分隔開的最多四種不同重編程因子，可以表達(dá)到足以實(shí)現(xiàn)重編程的水平。當(dāng)用轉(zhuǎn)導(dǎo)0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的FUffrtTA和2A載體感染時(shí)，胚胎和成年鼠類成纖維細(xì)胞以及新生兒的人類角化細(xì)胞被誘導(dǎo)形成了多能iPS細(xì)胞。我們觀察到重編程效率明顯低于以前使用單一載體轉(zhuǎn)導(dǎo)四種因子的每一種的實(shí)驗(yàn)(圖19B和表3)。表3:多能性實(shí)驗(yàn)以及所有產(chǎn)生的iPS細(xì)胞系的相對(duì)效率的總結(jié)表。GFP，存在的GFP報(bào)告基因；ES，ES細(xì)胞標(biāo)志物(AP、SSEAl、0ct4或Sox2)的表達(dá)；TF，畸胎瘤形成；PC，新生嵌合體。小鼠的嵌合性通過深淺環(huán)紋毛皮顏色評(píng)估。細(xì)胞來源GFPiPS細(xì)效率(iPS/ESTFPC胞系輸入，％)(m)胚胎成纖維細(xì)胞Nanog50.0001%是是是(m)成年成纖維細(xì)胞無4ND是否否(h)角化細(xì)胞無20.00001%是是否細(xì)胞系注射的胚細(xì)胞成活幼仔嵌合體數(shù)量嵌合性(％)^MEFiPS#46030230-50MEFiPS#2201410可能較低的重編程效率是由于從多順反子載體以化學(xué)計(jì)量表達(dá)因子所致，其對(duì)于誘導(dǎo)重編程來說可能不是最適的。使用分別的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)允許每種因子有不同數(shù)量的原病毒整合，因此可以篩選產(chǎn)生高表達(dá)或不同因子之間最適化學(xué)計(jì)量的特定一組原病毒整合來進(jìn)行重編程。但是，已報(bào)道2A系統(tǒng)支持體內(nèi)接近等摩爾的蛋白表達(dá)(17)。此外，當(dāng)使用轉(zhuǎn)導(dǎo)四種因子中每一種的單獨(dú)載體誘導(dǎo)iPS細(xì)胞時(shí)，早至DOX誘導(dǎo)后16天時(shí)就檢測(cè)到Nanog-GFP陽性細(xì)胞，與此對(duì)照，在4F2A載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后22-25天觀察到GFP陽性細(xì)胞，這與未達(dá)最適重編程相一致。此外，盡管iPS細(xì)胞經(jīng)常帶有多個(gè)0ct4或Klf4原病毒，但發(fā)現(xiàn)總是具有較少的Sox2原病毒，表明Sox2的高水平表達(dá)可能對(duì)重編程是不利的(24)。在其他實(shí)驗(yàn)中，使用flp-in轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)產(chǎn)生了在膠原蛋白基因座中含有4、3、和2因子2A構(gòu)建物的多個(gè)鼠類細(xì)胞系(圖22)(20)。系統(tǒng)包含兩個(gè)組分四環(huán)素可控的反式激活子(rtTA)和驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因的四環(huán)素操作子最小啟動(dòng)子(tetOP)。在添加含有強(qiáng)力霉素的培養(yǎng)基后，反式激活子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因在膠原蛋白基因座處的表達(dá)。如果需要，在Nanog基因處插入GFP報(bào)告構(gòu)建物允許檢測(cè)到Nanog基因座的完全重新活化，并用作基因組廣度的表觀遺傳重編程的標(biāo)志物。實(shí)施例3的參考文獻(xiàn)I.LowryWE,RichterL,YachechkoR等，(2008)從皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的人類多倉(cāng)泛干細(xì)胞(Generationofhumaninducedpluripotentstemcellsfromdermalfibroblasts),ProcNatlAcadSciUSA105,2883-2888.2.MaheraliN，SridharanR，XieW等，(2007)直接重編程的成纖維細(xì)胞顯示出整體表觀遺傳重塑和廣泛的組織分布(Directlyreprogrammedfibroblastsshowglobalepigeneticremodelingandwidespreadtissuecontribution)，CellStemCell1，55-70.3.OkitaK，IchisakaT，&YamanakaS(2007)具有生殖系能力的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的產(chǎn)生(Generationofgermline-competentinducedpluripotentstemcells)，Nature448,313-317.4.ParkIH，ZhaoR，WestJA等，(2008)使用確定的因子將人類體細(xì)胞重編程為多會(huì)泛性(Reprogrammingofhumansomaticcellstopluripotencywithdefinedfactors)，Nature451，141-146.5.TakahashiK，TanabeK，OhnukiM等，(2007)通過確定的因子從成年人類成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors)Cell131,861-872.6.TakahashiK&YamanakaS(2006)通過確定的因子從小鼠胚胎和成年成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors)Cell126，663-676.7.WernigM，MeissnerA，F(xiàn)oremanR等，(2007)成纖維細(xì)胞體外重編程到多會(huì)泛ES細(xì)胞樣狀態(tài)(InvitroreprogrammingoffibroblastsintoapluripotentES-cell-likestate)Nature448，318-324.8.YuJ，VodyanikMA,Smuga-OttoK等，(2007)源自于人類體細(xì)胞的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系(Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells)Science318，1917-1920.9.HannaJ，MarkoulakiS，SchorderetP等，(2008)終末分化的成熟B淋巴細(xì)胞直接重編程為多能性(DirectreprogrammingofterminallydifferentiatedmatureBlymphocytestopluripotency)Cell133，250-264.10.KimJBiZaehresH，WuG等，(2008)通過用兩種因子重編程從成年神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)多會(huì)泛干細(xì)胞(Pluripotentstemcellsinducedfromadultneuralstemcellsbyreprogrammingwithtwofactors)Nature454，646-650.11.StadtfeldM，BrennandK，&HochedlingerK(2008)膜腺β細(xì)胞重編程成誘導(dǎo)的多會(huì)泛干細(xì)胞(Reprogrammingofpancreaticbetacellsintoinducedpluripotentstemcells)CurrBiol18，890-894.12.HannaJ，WernigM，MarkoulakiS等，(2007)使用從自體皮膚產(chǎn)生的iPS細(xì)胞治療德刀細(xì)胞貧血癥小鼠模型(TreatmentofsicklecellanemiamousemodelwithiPScellsgeneratedfromautologousskin)Science318，1920-1923.13.WernigM，ZhaoJP，PruszakJ等，(2008)將源自于重編程的成纖維細(xì)胞的神經(jīng)元功能性整合到胎鼠腦中并改善患有帕金森氏癥的大鼠的癥狀(NeuronsderivedfromreprogrammedfibroblastsfunctionallyintegrateintothefetalbrainandimprovesymptomsofratswithParkinson'sdisease)ProcNatlAcadSciUSA105，5856-5861.14.RyanMD&DrewJ(1994)口蹄疫病毒2A寡肽介導(dǎo)的人造聚蛋白的切割(Foot-and-mouthdiseasevirus2Aoligopeptidemediatedcleavageofanartificialpolyprotein)EmboJ13,928-933.15.RyanMDiKingAM，&ThomasGP(1991)口蹄疫病毒聚蛋白的切割由位于19個(gè)氛基酸序列中的殘基介導(dǎo)(Cleavageoffoot-and-mouthdiseaseviruspolyproteinismediatedbyresidueslocatedwithina19aminoacidsequence)JGenVirol72(Pt11),2727-2732.16.DoroninaVA,WuC，deFelipeP等，(2008)初生鏈從核糖體上有義密碼子處的位點(diǎn)特異性釋放(Site-specificreleaseofnascentchainsfromribosomesatasensecodon)MolCellBiol28，4227-4239.17.SzymczakAL，WorkmanCJ,WangY等，(2004)使用基于單一“自切割”2A月太的反轉(zhuǎn)錄病毒載體在體內(nèi)校正多基因缺陷(Correctionofmulti-genedeficiencyinvivousingasingle!self-cleaving!2Apeptide-basedretroviralvector)NatBiotechnol22，589-594。18.LoisC，HongEJ，PeaseS等，(2002)通過慢病毒載體遞送的轉(zhuǎn)基因的種系傳播和組織特異性表達(dá)(Germlinetransmissionandtissue-specificexpressionoftransgenesdeliveredbylentiviralvectors)Science295，868-872.19.WernigM,LengnerCJ,HannaJ等，(2008)用于多種體細(xì)胞類型的直接重編程的藥物誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)(Adrug-inducibletransgenicsystemfordirectreprogrammingofmultiplesomaticcelltypes)NatBiolechnol26，916-924.20.BrambrinkT，F(xiàn)oremanR,WelsteadGG等，(2008)小鼠體細(xì)胞的直接重編程過程中多能性標(biāo)志物的順序表達(dá)(Sequentialexpressionofpluripotencymarkersduringdirectreprogrammingofmousesomaticcells)CellStemCell2，151-159.21.StadtfeldM，MaheraliN，BreaultDT等，(2008)定義小鼠中成纖維細(xì)胞向iPS細(xì)胞重編程過程中的分子基石(DefiningmolecularcornerstonesduringfibroblasttoiPScellreprogramminginmouse)CellStemCell2，230-240.22.OkitaK，NakagawaM，HyenjongH等，(2008)不使用病毒載體產(chǎn)生誘導(dǎo)的小鼠多能干細(xì)胞(GenerationofMouseInducedPluripotentStemCellsWithoutViralVectors)Science322，949-95323.StadtfeldM，NagayaM，UtikalJ等，(2008)不需病毒整合產(chǎn)生誘導(dǎo)的多會(huì)泛干細(xì)胞(InducedPluripotentStemCellsGeneratedWithoutViralIntegration)Science322，945-949.24.EminliS，UtikalJS，ArnoldK等，(2008)在不存在外源Sox2表達(dá)的情況下將神經(jīng)袓細(xì)胞重編程成iPS細(xì)胞(ReprogrammingofNeuralProgenitorCellsintoiPSCellsintheAbsenceofExogenousSox2Expression)StemCells.25.MeissnerA，WernigM，&JaenischR(2007)將未遺傳修飾的成纖維細(xì)胞直接重編程成多會(huì)泛干細(xì)胞(Directreprogrammingofgeneticallyunmodifiedfibroblastsintopluripotentstemcells)NatBiotechnol25，1177-1181.26.ZhangSC，WernigM，DuncanID等，(2001)從人類胚胎干細(xì)胞體外分化可移植的神經(jīng)前體(Invitrodifferentiationoftransplantableneuralprecursorsfromhumanembryonicstemcells)NatBiotechnol19,1129-1133.27.HockemeyerD,SoldnerF,CookEG等，(2008)用于將人類體細(xì)胞直接重編程為多能性的藥物誘導(dǎo)型系統(tǒng)(Adrug-induciblesystemfordirectreprogrammingofhumansomaticcellstopluripotency)CellStemCell3,346-353.實(shí)施例4:不含病毒重編程因子的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)程序細(xì)胞培養(yǎng)在本文中描述的所有初級(jí)成纖維細(xì)胞系購(gòu)自Coriell細(xì)胞保藏中心(CoriellCellR印ository)。將成纖維細(xì)胞在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基[DMEM添加有15%FBS(Hyclone)、ImM谷氨酰胺(Invitrogen)、I%非必需氨基酸(Invitrogen)和青霉素/鏈霉素(Invitrogen)]中培養(yǎng)。將HiPSC和hESC細(xì)胞系BGOl和BG02(NIH編號(hào)BG01和BGO2；BresaGen,Inc.，Athens,GA)維持在hESC培養(yǎng)基[DMEM/F12(Invitrogen)添加有15%FBS(Hyclone)>5%KnockOut血清替代物(Invitrogen)、ImM谷氨酸胺(Invitrogen)、I%非必需氨基酸(Invitrogen)、0·ImMβ-疏基乙醇(Sigma)和4ng/mlFGF2(R&Dsystems)]中絲裂霉素C(MMC)失活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層上。每5到7天，通過手動(dòng)或用IV型膠原酶(Invitrogen；1.5mg/ml)酶法處理將培養(yǎng)物傳代。按照制造商的說明書，將人類胚胎干細(xì)胞H9(NIH編號(hào)WA09,WisconsinAlumniResearchFoundation,Madison,WI)維持在MMC失活的MEF或MMC失活的人類成纖維細(xì)胞(D551;美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),Manassas,VA)上。對(duì)于EB誘導(dǎo)的分化來說，使用I.5mg/mlIV型膠原酶(Invitrogen)收獲ESC/hiPSC集落,通過重力與MEF飼養(yǎng)細(xì)胞分離，輕柔研磨，在非粘附性懸液培養(yǎng)皿(Corning)中在添加有15%FBS的DMEM中培養(yǎng)10天。對(duì)于Cre重組酶介導(dǎo)的載體切除來說，在電穿孔之前，將hiPSC細(xì)胞系在Rho激酶(ROCK)抑制劑(Calbiochem;Y-27632)中培養(yǎng)24小時(shí)。使用O.05%胰蛋白酶/EDTA溶液(Invitrogen)收獲細(xì)胞，并將重懸浮在PBS中的IxlO7個(gè)細(xì)胞通過以前描述過的電穿孔(Costa等，2007;GenePulserXcellSystem,Bio-Rad:250V,500μF,O.4cm小杯)，用PCre-PAC(50μg；Taniguchi等，1998)轉(zhuǎn)染或用pTurbo-Cre(40μg；Genbank登記號(hào)AF334827)和pEGFP-Nl(10μg；Clontech)共轉(zhuǎn)染。然后將細(xì)胞在前24小時(shí)鋪于MEF飼養(yǎng)細(xì)胞層上(DR4MEF用于嘌呤霉素篩選)添加有ROCK抑制劑的hESC培養(yǎng)基中。使用下列方法之一篩選表達(dá)Cre重組酶的細(xì)胞I)在電穿孔后2天加入嘌呤霉素(2μg/ml)，為期48小時(shí)。2)在電穿孔后60小時(shí)進(jìn)行單細(xì)胞懸液的FACS分揀(FACS-Aria;BD-Biosciences)以篩選表達(dá)EGFP的細(xì)胞，然后以低密度重新鋪板在含有ROCK抑制劑的hESC培養(yǎng)基中。在電穿孔后10到14天挑取各個(gè)集落。病毒構(gòu)建物FUff-M2rtTA慢病毒載體和含有在四環(huán)素操作子和最小CMV啟動(dòng)子控制下的KLF4(FUW-tetO-hKLF4)、0CT4(FUW-tet0-h0CT4)、S0X2(FUW-tet0-hS0X2)和c-MYC(FUff-tetO-hMYC)的人類cDNA的慢病毒載體，已在以前描述(Hockemeyer等,2008)。為了產(chǎn)生Cre重組酶可切除的DOX誘導(dǎo)型慢病毒載體，將含有四環(huán)素操作子/最小CMV啟動(dòng)子和KLF4、0CT4或S0X2的人類cDNA的NotI/Bsu36I片段，從每個(gè)FUW_tet0載體亞克隆、到在3'LTR中含有IoxP位點(diǎn)的FUGff-IoxP的NotI/BSU36I位點(diǎn)中(Hanna等，2007)。慢病毒感染和hiPSC產(chǎn)生按照以前的描述在293細(xì)胞中產(chǎn)生VSVG包被的慢病毒(Brambrink等，2008)。簡(jiǎn)單來說，在轉(zhuǎn)染后12小時(shí)改變培養(yǎng)基，并在轉(zhuǎn)染后60-72小時(shí)收集含有病毒的上清液。將病毒上清液通過O.45μm濾膜過濾。對(duì)于3和4種因子的感染來說，合并含有病毒的上清液，并添加FUW-M2rtTA病毒和等體積的新鮮培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)導(dǎo)前24小時(shí)將IxlO6個(gè)人類成纖維細(xì)胞接種在T75培養(yǎng)瓶中。在存在2μg/ml聚凝胺的情況下在48小時(shí)的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行四次連續(xù)的感染。最后一次感染后12小時(shí)改變培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)導(dǎo)后5天，使用胰蛋白酶將成纖維細(xì)胞傳代，以5X104到2xl05個(gè)細(xì)胞/IOcm2之間的不同密度重新鋪板在明膠包被的培養(yǎng)皿上。為了誘導(dǎo)重編程，在48小時(shí)后將培養(yǎng)基替換成添加有DOX(Sigma-Aldrich；2yg/ml)的hESC培養(yǎng)基。在DOX誘導(dǎo)后3到5周之間，根據(jù)形態(tài)手動(dòng)挑取HiPSCs集落，并按照hESC的方案在不存在DOX的情況下手動(dòng)維持和傳代。為了確定重編程效率，將IxlO5個(gè)人類成纖維細(xì)胞接種在IOcm2的明膠包被的培養(yǎng)皿上。在20天后根據(jù)多能性標(biāo)志物Tra-1-60和NANOG的免疫細(xì)胞化學(xué)計(jì)算重編程效率。微陣列基因表達(dá)分析使用RNeasyMini試劑盒(Qiagen),從與飼養(yǎng)細(xì)胞機(jī)械分離的hESC和iPSC中提取RNA。按照制造商的說明書(Affymetrix單循環(huán)cDNA合成試劑盒)，使用2μg總RNA制備生物素化的cRNA。簡(jiǎn)單來說,該方法包含使用T7-寡聚(dT)啟動(dòng)子引物進(jìn)行SuperscriptII指導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄，以產(chǎn)生第一鏈cDNA。按照T7RNA聚合酶指導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄進(jìn)行RNaseH介導(dǎo)的第二鏈cDNA合成，其在cRNA擴(kuò)增過程中摻入生物素化的核苷酸類似物。使用在IX雜交混合物中的15μg生物素化的cRNA,按照Affymetrix雜交手冊(cè)制備用于雜交的樣品。將基因芯片陣列(人類U1332.O)在基因芯片雜交爐中，以60RPM在45°C下雜交16小時(shí)。使用基因芯片流體工作站450，按照制造商的說明書，使用在Affymetrix基因芯片雜交、清洗和染色試劑盒中提供的緩沖液進(jìn)行清洗。將陣列在基因芯片掃描儀3000上掃描，使用基因芯片操作軟件vl.4提取圖像并分析。U133Plus2.O微陣列(Affymetrix)使用MAS5算法進(jìn)行處理,每個(gè)探針組需不需要存在使用標(biāo)準(zhǔn)AfTymetrix算法來確定,兩種算法都在Bioconductor中進(jìn)行。除去在所有樣品中都不存在的探針組以進(jìn)行下一步分析。通過使用R中的“l(fā)i_a”包進(jìn)行適度t_檢驗(yàn)(校正假發(fā)現(xiàn)率)或通過倍數(shù)變化來確定差異表達(dá)。當(dāng)基因由多個(gè)探針組表現(xiàn)時(shí)(根據(jù)Affymetrix的注釋)，基因表達(dá)的對(duì)數(shù)比率和p_值分別被計(jì)算為這些探針組的平均值和最小值。在對(duì)數(shù)變換的基因表達(dá)率的基礎(chǔ)上，使用非中Pearson相關(guān)性和配對(duì)平均聯(lián)接來進(jìn)行層次聚類。相關(guān)性使用Fisher'sZ轉(zhuǎn)換來比較。層次聚類的置信度使用利用R包“pvclust”的多尺度自助模擬重米樣(multiscalebootstrapresampling)來計(jì)算。總RNA的反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)PCR從與飼養(yǎng)細(xì)胞機(jī)械分離的EB或hESC和iPSC中，使用RNeasyMini試劑盒(Qiagen)或Trizol提取以及隨后的乙醇沉淀，來分離RNA。對(duì)IygSRNA使用寡聚dT引物和Thermoscript反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)在50°C下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)PCR在帶有PlatinumSYBRgreenpPCRSuperMIX-UDG和ROX(Invitrogen)的ABIPrism7000(AppliedBiosystems)中，使用一部分在以前描述(Hockemeyer等,2008;Yu等,2007)和一部分在Soldner等，2009,補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)程序(SupplementalExperimentalProcedures)中描述的引物來進(jìn)行?；チ鲂纬膳c分析通過膠原酶處理(1.5mg/ml)收集hiPSC，并通過隨后用培養(yǎng)基清洗和通過重力沉降來與飼養(yǎng)細(xì)胞分離。通過離心收集iPSC集合體，并重新懸浮在250μI磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。將HiPSC皮下注射到SCID小鼠(Taconic)的背部。一般在4_8周內(nèi)發(fā)展出腫瘤，并在腫瘤尺寸超過直徑I.5cm之前將動(dòng)物處死。在處死小鼠后分離畸胎瘤，并在福爾馬林中固定。在切片后，根據(jù)蘇木精和曙紅染色診斷畸胎瘤。甲基化分析從與飼養(yǎng)細(xì)胞機(jī)械分離的hESC和hiPSC收集基因組DNA。將DNA用蛋白酶K處理·并用酹-氯仿抽提，并使用QiagenEpiTect亞硫酸氫鹽試劑盒對(duì)IygDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。0CT4的啟動(dòng)子區(qū)使用以前描述的引物擴(kuò)增(Yu等，2007)0CT4正向ATTTGTTTTTTGGGTAGTTAAAGGT(SEQIDNO:32)0CT4反相CCAACTATCTTCATCTTAATAACATCC(SEQIDNO:33)PCR產(chǎn)物使用pCR2.1_T0P0載體克隆，并使用Μ13正向和反向引物測(cè)序。免疫細(xì)胞化學(xué)將細(xì)胞固定在含有4%聚甲醛的PBS中，并按照標(biāo)準(zhǔn)方案使用下列第一抗體進(jìn)行免疫染色SSEA4(小鼠單克隆抗體，DevelopmentalStudiesHybridomaBank)；Tra1-60(小鼠單克隆抗體，ChemiconInternational)；hS0X2(山羊多克隆抗體，R&DSystems);0ct_3/4(小鼠單克隆抗體，SantaCruzBiotechnology);hNAN0G(山羊多克隆抗體，R&DSystems);使用適合的MolecularProbesAlexaFluor偶聯(lián)的第二抗體(Invitrogen)。Southern印跡分析將Xbal、EcoRI或MfeI消化的基因組DNA在O.7%瓊脂糖凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Amersham),并用32P隨機(jī)引物(Stratagene)標(biāo)記的針對(duì)0CT4(pFUW-tetO_hOCT4質(zhì)粒的EcoRI-PstI片段)、KLF4(全長(zhǎng)hKLF4cDNA)、c-MYC(全長(zhǎng)c_MYCcDNA)、S0X2(pFUW-tetO-hSOX2質(zhì)粒的FspI-EcoRI片段)和M2rtTA(M2rtTAc-DNA的380bpC-末端片段)的探針雜交。登記號(hào)微陣列數(shù)據(jù)可以在NCBI基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBIGeneExpressionOmnibusdatabase)中在系列登記號(hào)GSE14711下獲得。概述在本實(shí)施例中，我們顯示了來自5位患有特發(fā)性帕金森氏病(PD)患者的成纖維細(xì)胞可以被有效重編程。此外，我們使用Cre重組酶可切除病毒產(chǎn)生了不含重編程因子的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)。無因子的iPSC維持多能狀態(tài)，并且與帶有轉(zhuǎn)基因的hiPSC相t匕，顯示出與hESC更密切相關(guān)的整體基因表達(dá)分布情況。我們的結(jié)果表明，在帶有病毒的hiPSC中殘留的轉(zhuǎn)基因表達(dá)能夠影響它們的分子特性，并因此表明無因子hiPSC代表了用于模擬人類疾病的更適合的細(xì)胞來源。結(jié)果通過DOX誘導(dǎo)型慢病毒載體對(duì)來自PD患者的成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程來自5位患有特發(fā)性H)的患者(活組織檢查時(shí)的年齡在53到85歲之間)和兩位未患病對(duì)象的皮膚成纖維細(xì)胞，從Coriell醫(yī)學(xué)研究所(CoriellInstituteforMedicalResearch)獲得(參見表4)。為了誘導(dǎo)重編程，將IxIO6個(gè)成纖維細(xì)胞用表達(dá)反四環(huán)素反式激活子的組成型活性慢病毒(FUW-M2rtTA)和轉(zhuǎn)導(dǎo)4種(0CT4、S0X2、c_MYC、KLF4)或3種(0CT4、S0X2、KLF4)重編程因子的DOX誘導(dǎo)型慢病毒一起進(jìn)行感染。在后文中，我們將把通過4種因子轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的hiPSC細(xì)胞系稱為hiPSC4F，通過三種因子獲得的稱為hiPSC3F。在DOX誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)后3到5周，選擇并手工挑取具有明確的hESC樣形態(tài)的集落。所有從ro患者和非ro患者獲得的成纖維細(xì)胞都產(chǎn)生穩(wěn)定的hiPSC，它們?cè)诓淮嬖贒OX的情況下維持30次傳代以上。對(duì)來自每個(gè)供體成纖維細(xì)胞系的至少一種細(xì)胞系進(jìn)行了詳細(xì)分析(表4)。所有這些hiPSC—致地表達(dá)多能性標(biāo)志物Tra-1-60、SSEA4、0CT4、S0X2和NAN0G，正如通過免疫細(xì)胞化學(xué)所確定的(圖27A)。此外，所有通過定量RT-PCR分析的hiPSC細(xì)胞系都顯示出與在hESC中觀察到的表達(dá)水平相似的內(nèi)源多能性相關(guān)基因0CT4、S0X2和NANOG的重新活化(圖27B)。正如對(duì)于hiPSC所預(yù)期的，發(fā)現(xiàn)H)患者衍生的hiPSC的0CT4啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度低，與其在親代成纖維細(xì)胞中的高甲基化狀態(tài)相反(圖27C)。為了測(cè)試多能性，將從每種供體成纖維細(xì)胞系分離的hiPSC注射到SCID小鼠中。所有hiPSC形成畸胎瘤，包含從所有胚胎胚層發(fā)育的組織，包括軟骨、骨、平滑肌(中胚層)、神經(jīng)菊形團(tuán)、色素沉著的神經(jīng)上皮(外胚層)以及具有杯狀和Paneth樣細(xì)胞的腸上皮(內(nèi)胚層)(圖28A)。對(duì)H)特異性hiPSC細(xì)胞系進(jìn)行的細(xì)胞遺傳學(xué)分析顯示，在12個(gè)細(xì)胞系中有11個(gè)具有正常的核型(參見Soldner，2009，補(bǔ)充圖I)。從轉(zhuǎn)導(dǎo)有4種因子的成纖維細(xì)胞系I3DD衍生的三個(gè)克隆中只有一個(gè)(iPSPDD4F-5)，顯示出18號(hào)染色體的長(zhǎng)臂與22號(hào)染色體的長(zhǎng)臂之間的不均衡易位，產(chǎn)生了衍生的18號(hào)染色體和單拷貝的22號(hào)染色體。從非H)患者的成纖維細(xì)胞系衍生的兩個(gè)獨(dú)立hiPSC(iPSM3f-I和iPSM3F-2)顯示出4號(hào)和7號(hào)染色體的短臂與長(zhǎng)臂之間的平衡易位，表明4；7易位在供體成纖維細(xì)胞中已經(jīng)存在(參見Soldner等，2009，補(bǔ)充圖I)。進(jìn)行了H)患者衍生的hiPSC和親代成纖維細(xì)胞的DNA指紋分析，以驗(yàn)證hiPSC的起源并排除與存在的多能細(xì)胞系的交叉污染(數(shù)據(jù)未顯示)。探測(cè)慢病毒整合的Southern印跡分析顯示每個(gè)hiPSC細(xì)胞系具有獨(dú)特的圖譜,證實(shí)了所分析的每個(gè)細(xì)胞系源自于帶有總共4到10個(gè)原病毒拷貝的獨(dú)立感染的成纖維細(xì)胞(圖28B，28C)。為了進(jìn)一步定性該系統(tǒng)的可用性，我們對(duì)一個(gè)成纖維細(xì)胞系(TOB)詳細(xì)測(cè)定了重編程效率。重編程效率在20天后根據(jù)多能性標(biāo)志物Tra-1-60和NANOG的免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行計(jì)算。在用三種因子轉(zhuǎn)導(dǎo)后產(chǎn)生HiPSC的效率約為O.005%，在用四種因子轉(zhuǎn)導(dǎo)后的產(chǎn)生效率約為O.01%。這與以前使用基于Moloney的反轉(zhuǎn)錄病毒載體或組成型活性慢病毒載體時(shí)所報(bào)道的效率相當(dāng)(Nakagawa等,2008;Takahashi等,2007;Yu等,2007)。在DOX添加后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)NANOG和Tra-1-60的免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示，在四種因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中，早至轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)后8天即可檢測(cè)到小的多能集落(圖32A)。通過改變?cè)谵D(zhuǎn)導(dǎo)有3種或4種重編程因子的成纖維細(xì)胞中DOX誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的時(shí)間，我們還確定了對(duì)重編程因子表達(dá)的時(shí)間要求。在24天后，我們能夠從暴露于DOX僅8天的4種因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞分離到hiPSC集落(H)B4f-U2、3)，而來自3種因子轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的hiPSC只有在暴露于DOX至少12天后才能分離到(PDB3F-dl2)。盡管重編程因子僅表達(dá)有限的時(shí)間，但所有挑取的細(xì)胞都產(chǎn)生完全重編程的hiPSC，其對(duì)多能性標(biāo)志物染色(圖32B)、重新活化內(nèi)源0CT4、NAN0G和S0X2基因(圖32C)，并形成包含源自三種發(fā)育胚層的細(xì)胞的畸胎瘤(圖32D)。我們的結(jié)果表明，與用4種因子重編程相比，通過3種因子重編程效率較低并花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間，這與以前的觀察相符(Nakagawa等,2008;Wernig等,2008)。但是，我們發(fā)現(xiàn)使用三種因子產(chǎn)生hiPSC更加實(shí)用，因?yàn)楸桓腥镜某衫w維細(xì)胞培養(yǎng)物不會(huì)過度生長(zhǎng)粒狀的、快速生長(zhǎng)的非hiPSC集落，正如以前對(duì)用4種因子感染的培養(yǎng)物所描述的(Nakagawa等，2008；Takahashi等，2007)。到目前為止描述的結(jié)果顯示，重編程因子的DOX誘導(dǎo)型遞送能夠在不存在c-MYC的情況下，從由ro患者獲得的皮膚活檢組織有效地產(chǎn)生hiPsc，其動(dòng)力學(xué)和效率與以前報(bào)道的使用其他方法相似。重要的是，13個(gè)三因子hiPSC中的8個(gè)帶有總共僅僅3到5個(gè)原病毒整合(圖28B，28C)，其明顯少于在以前的研究中所觀察到的(Wernig等，2007)。不含病毒重編程因子的源自H)患者的hiPSC的產(chǎn)生為了得到不含原病毒的hiPSC，我們產(chǎn)生了在整合后能夠使用Cre重組酶切除的慢病毒載體。將在3'LTR中包含IoxP的FUGW-IoxP慢病毒(Hanna等，2007)的人類遍在蛋白啟動(dòng)子，用DOX誘導(dǎo)型最小CMV啟動(dòng)子代替，該啟動(dòng)子后跟有0CT4、KLF4或S0X2的人類cDNA。在原病毒復(fù)制后，3'LTR中的IoxP位點(diǎn)復(fù)制到5'LTR中，導(dǎo)致在整合的轉(zhuǎn)基因兩側(cè)的LTR中都具有IoxP位點(diǎn)(圖4A)。使用這3種病毒以及表達(dá)反四環(huán)素反式激活子的組成型活性慢病毒(FUW-M2rtTA)同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)IxlO6個(gè)成纖維細(xì)胞(PDB)。在添加DOX后3到4周，以與上述相似的動(dòng)力學(xué)和效率分離到24個(gè)hiPSC細(xì)胞系(PDB21°x-1到24)。對(duì)12個(gè)細(xì)胞系的Southern印跡分析顯示，4個(gè)PDB21t5x細(xì)胞系(PDB21ra￡-5、PDB21ox-17,PDB21ox-2UPDB21ox-22)僅包含5到7個(gè)重編程因子整合(圖33)。這些Η)Β21°Χ細(xì)胞系在不存在DOX下維持20次傳代以上，并顯示出所有hiPSC的特征，例如多能性相關(guān)的標(biāo)志物蛋白Tra-1-60、SSEA4、0CT4、S0X2和NANOG的表達(dá)(圖29B)，以及內(nèi)源多能性相關(guān)基因0CT4、NANOG和S0X2的重新活化(包含在圖31B中)。此外，所有測(cè)試的Η)Β21°Χ克隆(PDB21°x-5、PDB21°x-17、PDB21°x-21、PDB21ox-22)證明了EB中的體外多譜系分化(數(shù)據(jù)未顯示)，并且在皮下注射到SCID小鼠中以后形成了產(chǎn)生所有三種胚胎胚層的畸胎瘤(圖29C)。我們著力于兩個(gè)克隆，其帶有總共5個(gè)(PDB21°x_21)或7個(gè)(PDB21°X_17)重編程因子整合，以測(cè)試是否慢病毒載體兩側(cè)的IoxP位點(diǎn)的切除將產(chǎn)生不含轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。使用了兩種不同的Cre介導(dǎo)的載體切除策略(圖30A)(I)瞬時(shí)表達(dá)編碼Cre重組酶和嘌呤霉素抗性標(biāo)志物的載體(pCre-PAC)。在電穿孔中，使用嘌呤霉素篩選細(xì)胞48小時(shí)，以富集瞬時(shí)表達(dá)Cre重組酶和嘌呤霉素的細(xì)胞。(2)共轉(zhuǎn)染Cre重組酶和EGFP表達(dá)質(zhì)粒，并隨后在轉(zhuǎn)染后60小時(shí)進(jìn)行FACS分揀，揀出EGFP陽性和表達(dá)Cre的細(xì)胞。使用這兩種方法，我們?cè)陔姶┛缀?0到14天分離到總共180個(gè)克隆(圖30A)。使用內(nèi)部EcoRI消化對(duì)KLF4(最高的整合數(shù)量)切除進(jìn)行篩選的最初Southern印跡分析顯示,48個(gè)克隆對(duì)KLF4慢病毒整合為陰性(數(shù)據(jù)未顯示)。隨后使用XbaI外部限制性消化對(duì)KLF4、0CT4和S0X2原病毒整合進(jìn)行的Southern印跡分析表明，源自Η)Β21°Χ_17的7個(gè)克隆和源自PDB21°X_21的9個(gè)克隆沒有整合任何重編程因子(圖30B，稱為TOBllrai克隆)。使用不同的限制性消化，通過附加的Southern印跡分析證實(shí)了所有重編程因子的切除(圖34)。此外，使用特異性針對(duì)Cre重組酶的引物進(jìn)行的基因組DNA的PCR證實(shí)，沒有TOBllrai克隆穩(wěn)定地整合有電穿孔的質(zhì)粒(數(shù)據(jù)未顯示)。針對(duì)反四環(huán)素反式激活子M2rtTA整合的Southern印跡分析顯示，PDB21ox-17細(xì)胞系有一個(gè)整合，PDB21ox-21細(xì)胞系有兩個(gè)整合(圖35)。這意味著Η)Β21°Χ-21細(xì)胞系中包括反式激活子在內(nèi)的原病毒整合的總數(shù)與從Η)Β21°Χ-17切除的轉(zhuǎn)基因的數(shù)量相同，表明切除包括反式激活子在內(nèi)的所有轉(zhuǎn)基因應(yīng)該是可能的。細(xì)胞遺傳學(xué)分析證明，14個(gè)被分析克隆中的14個(gè)在Cre介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因切除后顯示出正常核型(圖30C和未顯示的數(shù)據(jù))。所有無病毒的克隆在15次傳代以上的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后保持了穩(wěn)定的hESC樣形態(tài)，并維持所有的hIPSC特征，例如通過免疫細(xì)胞化學(xué)所顯示的hESC相關(guān)標(biāo)記物蛋白Tra-1-60、SSEA4、0CT4、S0X2和NANOG的表達(dá)(圖31A)，以及內(nèi)源多能性相關(guān)基因0CT4、S0X2和NANOG的表達(dá)與hESC和轉(zhuǎn)基因切除前的親代hiPSC的水平相當(dāng)(圖31B)。為了證明不含重編程因子的TOB11t5x克隆在重編程因子切除后維持多能性，通過EB形成或皮下注射到SCID小鼠中，對(duì)獨(dú)立的TOBllrai克隆進(jìn)行體外分化。所有測(cè)試的I3DBllrai克隆在體外顯示出多譜系分化，并發(fā)展成產(chǎn)生所有三種胚胎胚層的畸胎瘤(圖31C)。為了比較帶有整合的轉(zhuǎn)基因的不同hiPSC與不含因子的hiPSC之間的殘留轉(zhuǎn)基因表達(dá)，我們使用轉(zhuǎn)基因特異性PCR引物進(jìn)行了定量RT-PCR。正如以前使用慢病毒或基于Moloney的反轉(zhuǎn)錄病毒載體所報(bào)道的(Dimos等，2008；Ebert等，2008；Hockemeyer等，2008;Park等，2008a;Yu等，2007)，我們?cè)谒袔в姓喜《镜募?xì)胞系中檢測(cè)到了重編程因子對(duì)大多數(shù)轉(zhuǎn)基因的殘余表達(dá)，但是在未感染的成纖維細(xì)胞、hESC或TOB11t5x細(xì)胞系中沒有檢測(cè)到(圖31D)。我們的結(jié)果表明，使用兩側(cè)帶有IoxP的載體進(jìn)行重編程然后進(jìn)行Cre介導(dǎo)的切除，能夠有效地產(chǎn)生不含重編程因子的hiPSC。為了闡明剩余的轉(zhuǎn)基因表達(dá)是否能夠影響重編程細(xì)胞的總體基因表達(dá)情況，我們通過基因組范圍的基因表達(dá)分析比較了hESC、親代成纖維細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因切除之前和之后的hiPSC。基于在成纖維細(xì)胞與hESC之間顯示出表達(dá)相差至少4倍的所有基因的初始相關(guān)性分析，證實(shí)了不論轉(zhuǎn)基因是否被除去，所有hiPSC都與hESC密切相關(guān)(參見Soldner等，2009，補(bǔ)充圖7)。盡管hESC與hiPSC之間有相似性，但比較PDBllox和PDB21ox細(xì)胞與hESC的關(guān)聯(lián)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明，PDBllox細(xì)胞與親代PDB21t5x細(xì)胞相比更類似hESC(Soldner等，2009，補(bǔ)充圖7)。尤其是，基于在帶有或不帶有轉(zhuǎn)基因的hiPSC之間顯示出表達(dá)相差至少2倍的所有基因的相關(guān)性分析，證實(shí)了每個(gè)單獨(dú)的TOB11t5x細(xì)胞系與TOB21t5x細(xì)胞系相比，其基因表達(dá)情況與hESC更密切相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。在帶有病毒整合的hiPSC中，271個(gè)基因顯示出與hESC相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的差異表達(dá)(P<O.05)(圖31E)。類似的差異已在以前報(bào)道過(Takahashi等，2007)。相反，在不含轉(zhuǎn)基因的hiPSC與hESC之間只有48個(gè)基因差異表達(dá)(圖31E)。這表明在除去重編程因子后失調(diào)控的基因減少了80%以上。在不含因子的hiPSC中剩余的差異表達(dá)基因更可能是由于hESC和hiPSC的多樣化遺傳背景或反式激活子的表達(dá)或重編程的體細(xì)胞來源的遺傳記憶所致。差異調(diào)控的基因的詳細(xì)名單顯示在Soldner等,2009的補(bǔ)充表I中。討論在本實(shí)施例描述的工作中，我們從患有特發(fā)性H)的患者獲得的皮膚活檢組織產(chǎn)生了hiPSC。我們開發(fā)了穩(wěn)固的重編程方案，允許可重復(fù)地產(chǎn)生帶有低的原病毒載體整合數(shù)量的患者特異性hiPSC。使用在整合的原病毒兩側(cè)帶有IoxP位點(diǎn)的修改的慢病毒，允許有效地移除所有轉(zhuǎn)基因序列并產(chǎn)生不含重編程因子的hiPSC。不含因子的hiPSC是多能的，并且使用分子標(biāo)準(zhǔn)判斷，與帶有常規(guī)載體的親代hiPSC相比，更類似胚胎來源的hESC。了解許多神經(jīng)變性疾病例如H)背后的病理生理學(xué)的努力受到在體外模型中缺乏真實(shí)性的阻礙。使用hiPSC技術(shù)，我們使用轉(zhuǎn)導(dǎo)3種或4種重編程因子的DOX誘導(dǎo)型慢病毒載體，從5位患有特發(fā)性ro的患者上建立了hiPsc細(xì)胞系。這些細(xì)胞顯示出具有多能ES細(xì)胞的所有特點(diǎn)，包括分化成所有胚胎譜系的細(xì)胞類型的能力。我們的結(jié)果表明，通過Cre/lox介導(dǎo)的重組來移除整合的轉(zhuǎn)基因，能夠產(chǎn)生不含載體的hiPSC。以前的報(bào)道未能切除兩側(cè)帶有IoxP位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因(Takahashi和Yamanaka,2006)。不受理論的限制，這可能是由于高的反轉(zhuǎn)錄病毒整合數(shù)量(20個(gè)以上)使得不可能完全移除所有原病毒或引起了災(zāi)難性的基因組不穩(wěn)定性。我們的基于DOX誘導(dǎo)型慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果，顯示出可以產(chǎn)生帶有少至3或4個(gè)病毒整合的hiPSC。使用在3'LTR中具有IoxP位點(diǎn)的DOX誘導(dǎo)型慢病毒載體，在Cre重組酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因切除后，我們產(chǎn)生了H)患者特異性的不含重編程因子的hiPSC。移除自失活(SIN)慢病毒載體中的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)基因序列，預(yù)計(jì)將顯著降低由于病毒介導(dǎo)的癌基因活化和/或被轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子的重新表達(dá)所引起的癌基因轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)(Allen和Berns，1996;vonKalle等，2004)。其余的基因破壞的風(fēng)險(xiǎn)，可以通過將重編程因子作為兩側(cè)帶有IoxP位點(diǎn)的多順反子單一表達(dá)載體定向到基因組的安全港(safe-harbor)基因座中來消除。不含因子的hiPSC維持多能ESC樣狀態(tài)盡管已報(bào)道了幾種hiPSC的轉(zhuǎn)基因表達(dá)沉默，但所有到目前為止產(chǎn)生的hiPSC(包括在本實(shí)施例中描述的在除去重編程因子之前的細(xì)胞系)，都維持低的但是可檢測(cè)的殘余轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Dimos等，2008；Ebert等，2008；Hockemeyer等，2008；Park等，2008a；Yu等，2007)。因此，hiPSC是否依賴于重編程因子的表達(dá)來維持多能ESC樣狀態(tài)這一問題，還沒有結(jié)論性地解決。不含因子的hiPSC在形態(tài)和生物學(xué)方面不能與親代hiPSC相區(qū)分并且維持hESC的所有特征的這一觀察結(jié)果，證明人類體細(xì)胞能夠被重編程到可以在完全不存在外源重編程因子的情況下維持的自持續(xù)多能狀態(tài)。這些結(jié)果提供了hiPSC重新建立多能性相關(guān)的自調(diào)控回路的附加證據(jù)，該觀點(diǎn)的提出是依賴于四種內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子0CT4、NAN0G、S0X2和TCF3的活化(Jaenisch和Young,2008)。來自部分沉默的病毒載體的殘余轉(zhuǎn)基因表達(dá)擾亂了hiPSC的轉(zhuǎn)錄情況因?yàn)樘囟ㄔ《镜幕蚪M整合位點(diǎn)影響原病毒的沉默及其被重新活化的風(fēng)險(xiǎn)，所以具有一致和可預(yù)測(cè)性質(zhì)的hiPSC不能通過依賴于隨機(jī)沉默的方法產(chǎn)生。殘余的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可能影響iPSC的分化性質(zhì)。事實(shí)上，已觀察到小鼠ES細(xì)胞和iPSC之間分化成心肌細(xì)胞的能力的顯著差異(K.Hochedlinger,個(gè)人通訊)，以及不同hiPSC克隆的部分阻斷的EB誘導(dǎo)的分化和不完全的0CT4和NANOG下調(diào)(Yu等，2007)。這些觀察結(jié)果與僅僅部分沉默的載體的可變基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄可能影響功能分化細(xì)胞的產(chǎn)生這一可能性相一致。在評(píng)估載體的移除是否影響hiPSC性質(zhì)的工作中，我們比較了帶有原病毒的親代hiPSC、不含因子的hiPSC和源自胚胎的hESC中的整體基因表達(dá)圖譜。正如以前報(bào)道的(Park等，2008b；Takahashi等，2007；Yu等；2007)，與供體成纖維細(xì)胞相比，帶有原病毒的hiPSC和不含因子的hiPSC與hESC聚類更為接近。但是，對(duì)不同hiPSC細(xì)胞類型之間最趨異的基因進(jìn)行的更詳細(xì)的分析顯示，與帶有原病毒的親代hiPSC相比，源自胚胎的hESC和不含因子的hiPSC彼此之間更加緊密相關(guān)。在不含載體的hiPSC與hESC之間基因表達(dá)的殘留的少量差異可能是由于在我們的實(shí)驗(yàn)中尚未被切除的反式激活子的表達(dá)。這里呈現(xiàn)的這些結(jié)果提供了清楚的證據(jù)，表明在常規(guī)iPS細(xì)胞中攜帶的原病毒的基礎(chǔ)表達(dá)能夠影響細(xì)胞的分子特征。本文描述的系統(tǒng)為在例如體外和體內(nèi)分化范例的背景中進(jìn)一步闡明殘留轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，提供了基礎(chǔ)。此外，這些結(jié)果證明，產(chǎn)生不含重編程因子的hiPSC，不僅對(duì)于潛在的治療應(yīng)用、而且對(duì)于生物醫(yī)學(xué)研究以便開發(fā)更可靠和可重復(fù)的體外疾病模型來說，都是極為有利的。為此，我們建議，通過Cre介導(dǎo)的切除產(chǎn)生不含轉(zhuǎn)基因的hiPSC提供了顯著優(yōu)點(diǎn)，例如其高效率和實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)單性。本文描述的系統(tǒng)有潛力成為一種用于產(chǎn)生hiPSC的常規(guī)技術(shù)，其將允許從不同來源、使用不同的重編程因子組合產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化的hiPSC。表4從初級(jí)成纖維細(xì)胞衍生的hiPSC的概要權(quán)利要求1.一種核酸構(gòu)建物，其包含至少兩個(gè)編碼區(qū)，其中所述編碼區(qū)由編碼自切割肽的核酸彼此相連以便形成單一開放閱讀框，并且其中所述編碼區(qū)編碼第一和第二種重編程因子，所述第一和第二種重編程因子能夠單獨(dú)或與一種或多種另外的重編程因子組合，將哺乳動(dòng)物體細(xì)胞重編程為多能性。2.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其還包含編碼第三種重編程因子的第三個(gè)編碼區(qū)，其中三個(gè)編碼區(qū)由編碼自切割肽的核酸彼此相連以便形成單一開放閱讀框。3.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其還包含編碼第三和第四種重編程因子的第三和第四個(gè)基因，其中四個(gè)編碼區(qū)由編碼自切割肽的核酸彼此相連以便形成單一開放閱讀框。4.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其中自切割肽是病毒2A肽。5.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其中自切割肽是口蹄疫病毒2A肽。6.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其中重編程因子選自O(shè)ct4、Nanog、Sox2、Klf4、Lin28和O-Myc07.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其中編碼區(qū)編碼的第一和第二種重編程因子需要至少一種另外的重編程因子以便將哺乳動(dòng)物體細(xì)胞重編程為多能性。8.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物不編碼0ct4。9.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物不編碼Klf4。10.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物不編碼Sox2。11.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物不編碼c-Myc。12.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物不編碼Lin28。13.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物不編碼Nanog。14.權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其中編碼區(qū)編碼選自下列的重編程因子組(i)由0ct4和Sox2構(gòu)成的組；(ii)由0ct4和Klf4構(gòu)成的組；(iii)由0ct4和Nanog構(gòu)成的組；(iv)由0ct4、Klf4和Sox2構(gòu)成的組；(V)由0ct4、Nanog和Lin28構(gòu)成的組；(vi)由0ct4、Nanog和Sox2構(gòu)成的組；以及(vii)由(i)-(vi)任一個(gè)并另外包括c_Myc構(gòu)成的組。15.—種表達(dá)盒，其包含與啟動(dòng)子可操作連接的權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建物，其中所述啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼重編程因子的多順反子信使的轉(zhuǎn)錄，每種重編程因子通過自切割肽與至少一種其他重編程因子相連。16.權(quán)利要求15的表達(dá)盒，其還包含介導(dǎo)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組中整合的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。17.包含權(quán)利要求15的表達(dá)盒的表達(dá)載體。18.權(quán)利要求17的表達(dá)載體，其中所述載體是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。19.權(quán)利要求18的表達(dá)載體，其中啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的。20.包含權(quán)利要求15的表達(dá)盒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。21.權(quán)利要求20的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是體細(xì)胞。22.權(quán)利要求20的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是終末分化的體細(xì)胞。23.權(quán)利要求20的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是iPS細(xì)胞。24.一種嵌合小鼠，其至少部分從權(quán)利要求23的哺乳動(dòng)物iPS細(xì)胞產(chǎn)生。25.權(quán)利要求24的嵌合小鼠，其中所述小鼠通過將哺乳動(dòng)物iPS細(xì)胞注射到小鼠囊胚中并允許囊胚在體內(nèi)發(fā)育成小鼠來產(chǎn)生。26.從權(quán)利要求24的小鼠獲得的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞源自于iPS細(xì)胞。27.權(quán)利要求20的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是人類細(xì)胞。28.權(quán)利要求20的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中表達(dá)盒被整合到基因組中的基因座處，所述基因座的破壞對(duì)細(xì)胞具有最小影響或沒有影響。29.權(quán)利要求20的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞從表達(dá)盒表達(dá)兩種重編程因子。30.權(quán)利要求20的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞從表達(dá)盒表達(dá)三種重編程因子。31.權(quán)利要求20的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞從表達(dá)盒表達(dá)三種重編程因子，其中所述三種重編程因子不足以以至少0.05%的效率重編程哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞。32.權(quán)利要求20的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞從表達(dá)盒表達(dá)三種重編程因子，其中所述三種重編程因子足以以至少0.05%的效率重編程哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞。33.權(quán)利要求20的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞還包含整合在基因座中的報(bào)告基因，所述基因座的活化被用作重編程為多能性的標(biāo)志物。34.權(quán)利要求31的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述基因座選自Nanog和0ct4。35.一種組合物，其包含多個(gè)基本上遺傳一致的權(quán)利要求20的細(xì)胞。36.一種用于鑒定重編程劑的組合物，所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求20的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和被測(cè)藥劑。37.權(quán)利要求34的組合物，其還包含誘導(dǎo)重編程因子從表達(dá)盒表達(dá)的藥劑。38.一種鑒定重編程劑的方法，所述方法包含(i)將權(quán)利要求34的組合物在從表達(dá)盒表達(dá)重編程因子并發(fā)生細(xì)胞增殖的條件下維持一段時(shí)間；以及(ii)評(píng)估細(xì)胞重編程的程度，其中如果重編程的發(fā)生頻率明顯高于組合物缺乏被測(cè)藥劑的情況下的頻率，則該被測(cè)藥劑被鑒定為重編程劑或重編程增強(qiáng)劑。39.權(quán)利要求36的方法，其中將組合物維持至少X天。40.權(quán)利要求36的方法，其中被測(cè)藥劑存在至少X天。41.權(quán)利要求36的方法，其中如果細(xì)胞在不存在被測(cè)藥劑的情況下維持所述時(shí)間段，沒有以可檢測(cè)的頻率重編程，但是如果在所述被測(cè)藥劑存在下維持至少一部分所述時(shí)間段，以可檢測(cè)的頻率重編程，則所述被測(cè)藥劑被鑒定為重編程劑。42.權(quán)利要求36的方法，其中如果細(xì)胞在不存在被測(cè)藥劑的情況下維持所述時(shí)間段，以可檢測(cè)的頻率重編程，并且如果在所述被測(cè)藥劑存在下維持至少一部分所述時(shí)間段，以明顯更高的頻率重編程，則所述測(cè)試藥劑被鑒定為重編程劑的增強(qiáng)劑。43.權(quán)利要求36的方法，其中細(xì)胞從表達(dá)盒表達(dá)一組重編程因子，其中所述組由下列構(gòu)成(i)0ct4和Sox2；(ii)0ct4和Klf4；(iii)0ct4和Nanog；(iv)0ct4、Klf4和Sox2；(v)0ct4、Nanog和Lin28；(vi)0ct4>Nanog和Sox2;以及(vii)(i)-(vi)任一項(xiàng)并另外包括c-Myc。44.一種將分化的體細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)的方法，所述方法包含下列步驟(a)將分化的體細(xì)胞與至少一種有助于所述細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)的重編程劑接觸；(b)將所述細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種重編程劑的活性的條件下維持足以開始所述細(xì)胞的重編程的一段時(shí)間；以及(c)使所述至少一種重編程劑功能性失活。45.一種將分化的體細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)的方法，所述方法包含下列步驟(a)提供分化的體細(xì)胞，所述分化的體細(xì)胞含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子；(b)將所述細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；以及(c)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活。46.一種篩選已被重編程為多能狀態(tài)的分化體細(xì)胞的方法，所述方法包含下列步驟(a)提供分化的體細(xì)胞，所述分化的體細(xì)胞含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子；(b)將所述細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；(c)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活；以及(d)將表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞與不表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞區(qū)分開。47.源自于重編程的分化體細(xì)胞的分離的多能細(xì)胞。48.純化的體細(xì)胞群，其包含至少70%的源自于重編程的分化體細(xì)胞的多能細(xì)胞。49.分離的多能細(xì)胞，其通過下述方法產(chǎn)生(a)提供分化的體細(xì)胞，所述分化的體細(xì)胞含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子；(b)將所述細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；(c)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活；以及(d)將表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞與不表現(xiàn)多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞區(qū)分開。50.純化的體細(xì)胞群，其包含至少70%的源自于重編程的分化體細(xì)胞的多能細(xì)胞，所述多能細(xì)胞通過包含下列步驟的方法產(chǎn)生(a)提供分化的體細(xì)胞，所述體細(xì)胞含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子；(b)將所述細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；(c)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活；以及(d)將表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞與不表現(xiàn)多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞區(qū)分開。51.一種從體細(xì)胞產(chǎn)生多能細(xì)胞的方法，所述方法包含下列步驟(a)提供一種或多種體細(xì)胞，其各自含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子，其中所述外源導(dǎo)入因子使用不進(jìn)行甲基化誘導(dǎo)的沉默的誘導(dǎo)型載體導(dǎo)A；(b)將所述一種或多種細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；(C)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活；(d)篩選表現(xiàn)出多能性的標(biāo)志物的一種或多種細(xì)胞；(e)利用表現(xiàn)出多能性的標(biāo)志物的所述一種或多種細(xì)胞產(chǎn)生嵌合胚胎；(f)從所述嵌合胚胎獲得一種或多種體細(xì)胞；(g)將所述一種或多種體細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；以及(h)將表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞與不表現(xiàn)一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞區(qū)分開。52.分離的多能細(xì)胞，其通過包含下列步驟的方法產(chǎn)生(a)提供一種或多種體細(xì)胞，其各自含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子，其中所述外源導(dǎo)入因子使用不進(jìn)行甲基化誘導(dǎo)的沉默的誘導(dǎo)型載體導(dǎo)A；(b)將所述一種或多種細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；(c)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活；(d)篩選表現(xiàn)出多能性的標(biāo)志物的一種或多種細(xì)胞；(e)利用表現(xiàn)出多能性的標(biāo)志物的所述一種或多種細(xì)胞產(chǎn)生嵌合胚胎；(f)從所述嵌合胚胎獲得一種或多種分化的體細(xì)胞；(g)將所述一種或多種分化的體細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；以及(h)將表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞與不表現(xiàn)多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞區(qū)分開。53.純化的體細(xì)胞群，其包含至少70%的源自于重編程的分化體細(xì)胞的多能細(xì)胞，所述多能細(xì)胞通過包含下列步驟的方法產(chǎn)生(a)提供一種或多種體細(xì)胞，其各自含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子，其中所述外源導(dǎo)入因子使用不進(jìn)行甲基化誘導(dǎo)的沉默的誘導(dǎo)型載體導(dǎo)A；(b)將所述一種或多種細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；(c)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活；(d)篩選表現(xiàn)出多能性的標(biāo)志物的一種或多種細(xì)胞；(e)利用表現(xiàn)出多能性的標(biāo)志物的所述一種或多種細(xì)胞產(chǎn)生嵌合胚胎；(f)從所述嵌合胚胎獲得一種或多種分化的體細(xì)胞；(g)將所述一種或多種分化的體細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；以及(h)將表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞與不表現(xiàn)多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞區(qū)分開。54.一種將分化的免疫細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)的方法，所述方法包括下列步驟(a)提供分化的免疫細(xì)胞，其含有外源導(dǎo)入的、各自在誘導(dǎo)型載體控制之下的0ct4、Sox2、Klf-4和c-Myc，并另外含有外源導(dǎo)入的C/EBPa；(b)將所述細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和0(^4、3012、1(1卜4、^7(3與(/^80的活性的條件下維持足以活化內(nèi)源Nanog和/或0ct4的一段時(shí)間；以及(c)功能性失活外源導(dǎo)入的0ct4、Sox2、Klf-4和c_Myc。55.純化的免疫細(xì)胞群，其包含至少70%的源自于重編程的分化免疫細(xì)胞的多能細(xì)胞，所述多能細(xì)胞通過包含下列步驟的方法產(chǎn)生(a)提供分化的免疫細(xì)胞，其含有外源導(dǎo)入的、各自在誘導(dǎo)型載體控制之下的0ct4、Sox2、Klf-4和c-Myc，并另外含有外源導(dǎo)入的C/EBPa；(b)將所述細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和0ct4、Sox2、Klf-4、c-Myc與C/EBPa的活性的條件下維持足以活化內(nèi)源Nanog和/或0ct4的一段時(shí)間；以及(c)功能性失活外源導(dǎo)入的0ct4、Sox2、Klf-4和c_Myc。56.一種鑒定重編程劑的方法，所述方法包含(a)提供一種或多種體細(xì)胞，其各自含有至少一種有助于所述細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)的外源導(dǎo)入因子，其中每種所述外源導(dǎo)入因子使用不進(jìn)行甲基化誘導(dǎo)的沉默、并且其表達(dá)受到由不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的調(diào)控元件控制的誘導(dǎo)型載體進(jìn)行導(dǎo)入；(b)將所述一種或多種細(xì)胞在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下維持足以使所述細(xì)胞重編程或活化至少一種內(nèi)源多能性基因的一段時(shí)間；(c)使所述至少一種外源導(dǎo)入因子功能性失活；(d)篩選表現(xiàn)出多能性的標(biāo)志物的一種或多種細(xì)胞；(e)利用表現(xiàn)出多能性的標(biāo)志物的所述一種或多種細(xì)胞產(chǎn)生嵌合胚胎；(f)從所述嵌合胚胎獲得一種或多種體細(xì)胞；(g)將所述一種或多種體細(xì)胞維持在適合于所述細(xì)胞增殖和所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性的條件下，其中所述至少一種外源導(dǎo)入因子的活性本身不足以活化至少一種內(nèi)源多能性基因；(h)將(g)的體細(xì)胞與一種或多種候選重編程劑接觸；以及(i)鑒定與所述一種或多種候選重編程劑接觸過的、表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的細(xì)胞，其中誘導(dǎo)(g)的體細(xì)胞表現(xiàn)出多能性的一種或多種標(biāo)志物的候選重編程劑，被鑒定為重編程劑。全文摘要本公開涉及將一種或多種體細(xì)胞例如部分分化或完全/終末分化的體細(xì)胞重編程到分化較低的狀態(tài)例如多能或多潛能狀態(tài)的方法。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的重編程的體細(xì)胞、包含本發(fā)明的重編程體細(xì)胞的嵌合動(dòng)物、所述細(xì)胞的使用以及可用于重編程體細(xì)胞的藥劑的鑒定方法。文檔編號(hào)C12N15/867GK102725409SQ200980131281公開日2012年10月10日申請(qǐng)日期2009年6月15日優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日發(fā)明者布賴斯·伍德伯里·凱里,魯?shù)婪颉ひ崾┥暾?qǐng)人:懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所