一種低氧促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種低氧促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 心血管疾病是威脅人類健康的主要疾病，尤其是心肌梗死已經(jīng)成為人類死亡的主 要病因之一。許多心肌再生策略都是為了解決移植器官短缺的問題。在心肌替代治療中，成 體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的心肌細(xì)胞是治療心肌缺血性疾病細(xì)胞替代治療不失為一個(gè)很好的選擇。 如何安全、高效獲得誘導(dǎo)心肌細(xì)胞是用個(gè)性化細(xì)胞療法治療心肌梗死和心力衰竭亟待解決 的問題。成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞將為心肌細(xì)胞移植提供了新的細(xì)胞來源?；?之前的研究，說明體細(xì)胞存在的微環(huán)境對體細(xì)胞表觀遺傳修飾和重編程具有極其重要的作 用。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中還沒有一種低氧促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種低氧促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞重編 程為心肌細(xì)胞的方法，利用重編程因子(Gata4、Mef2c和Tbx5)將小鼠成纖維細(xì)胞直接重編 程為高效分化的心肌細(xì)胞為切入點(diǎn)，研究低氧對直接重編程產(chǎn)生心肌細(xì)胞的效率及成纖維 細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞過程中HIF-1表達(dá)水平的變化，系統(tǒng)闡述低氧對細(xì)胞直接重編程的 作用。同時(shí)檢測了多潛能轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳調(diào)控因子這在低氧刺激下的表達(dá)情況。用體 細(xì)胞直接重編程得到的個(gè)體化心肌細(xì)胞用于心肌梗死的修復(fù)，將為提高臨床細(xì)胞移植的效 率和安全性打下基礎(chǔ)。探討低氧微環(huán)境與重編程的關(guān)系，為低氧下重編程機(jī)制的研究提供 新的思路。其技術(shù)方案如下：
[0005] -種低氧促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞的方法，包括以下步驟:構(gòu)建慢 病毒載體，利用293T細(xì)胞包裝生產(chǎn)病毒，將攜帶轉(zhuǎn)錄因子Gata4、Mef2c和Tbx5的慢病毒感染 小鼠背部皮膚成纖維細(xì)胞，將成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞;重編程過程中轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞分別進(jìn)行對照組常氧培養(yǎng)和低氧2 % 02+5 % C02+93 % N2預(yù)處理6h、12h，在培養(yǎng)過程中每天 觀察重編程細(xì)胞的形態(tài)改變;在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第1、2、3、4周，利用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì) 胞技術(shù)檢測低氧不同時(shí)間心肌特異標(biāo)記Myh6陽性的細(xì)胞比率;收集低氧組重編程細(xì)胞，利 用RT-PCR檢測HIF-1在重編程細(xì)胞中的表達(dá)，在mRNA水平上對其進(jìn)行分析；
[0006] 體外低氧條件2 % 〇2+5 %⑶2+93 %N2下，培養(yǎng)小鼠背部皮膚成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分 低氧6h、12h、24h、48h組，常氧為對照組；用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和RT-PCR檢測小鼠皮膚成纖 維細(xì)胞中HIF-l、0ct4和Uhrfl的表達(dá)，在蛋白和mRNA水平對其進(jìn)行分析。
[0007] 優(yōu)選地，加入低氧條件后，RT-PCR檢測直接重編程第1、2、3、4周Myh6 mRNA的表達(dá)， 第4周Myh6表達(dá)水平升高明顯，低氧6h組高于Oh和12h;免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測低氧條件下 成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞內(nèi)Myh6陽性率高于常氧組;低氧6h組Myh6的表達(dá)倍數(shù)是 對照組的4.59倍;流式細(xì)胞技術(shù)檢測到直接重編程后低氧6h組Myh6的表達(dá)量是對照組的 4.71倍P〈0.05;低氧12h組與常氧組陽性細(xì)胞比率差異不大;RT-PCR結(jié)果顯示HIF-1在細(xì)胞 重編程的早期表達(dá)水平升高，低氧6h組高于低氧12h組，與Myh6的表達(dá)變化相同，證明HIF-1 在細(xì)胞直接重編程過程中被激活，起到促進(jìn)細(xì)胞重編程的作用。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0009] 本發(fā)明成功將成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞。低氧微環(huán)境明顯提高了成纖 維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞的效率。HIF-1在低氧條件下被激活，參與促進(jìn)成纖維細(xì)胞直 接重編程的過程。多潛能轉(zhuǎn)錄因子0ct4和表觀遺傳調(diào)控因子Uhrfl在低氧微環(huán)境下在小鼠 成纖維細(xì)胞中表達(dá)水平升高，提示低氧微環(huán)境刺激有可能啟動(dòng)了細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的改變和 細(xì)胞的多潛能性，從而影響細(xì)胞的功能、增殖和分化。HIF-1通路在其中發(fā)揮了重要作用。
【附圖說明】
[0010] 圖1是原代細(xì)胞培養(yǎng)，圖1 (A)圖為原代小鼠皮膚成纖維細(xì)胞（X 40)，圖1 (B)圖為小 鼠原代心肌細(xì)胞（X 100);
[0011] 圖2是Gata4病毒液的生產(chǎn)及鑒定，圖中所示為Gata4感染239T細(xì)胞熒光(A-D)與白 光(a-d)對比圖，計(jì)算Gata4感染效率，病毒液的體積(A)為0.1yL，（B)為0.5yL，（C)為2yL， (D)為 10yL(X100);
[0012] 圖3是Tbx5病毒液的生產(chǎn)及鑒定，圖中所示為Tbx5感染239T細(xì)胞熒光(A-D)與白光 (a-d)對比圖，計(jì)算Tbx5感染效率，病毒液的體積(A)為0. lyL，⑶為0.5yL，（C)為2yL，（D)為 10yL(X100)；
[0013] 圖4是Mef2c病毒液的生產(chǎn)及鑒定，圖中所示為Mef2c感染239T細(xì)胞熒光(A-D)與白 光(a-d)對比圖，計(jì)算Mef2c感染效率，病毒液的體積(A)為0.1yL，（B)為0.5yL，（C)為2yL， (D)為 10yL(X100);
[0014]圖5是Gata4病毒感染小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，第4d觀察熒光計(jì)算病毒感染效率，圖 中顯示為細(xì)胞在熒光(ABC)和白光(abc)下的圖片，病毒體積(A)為2yL，（B)為10yL，（C)為30 yL( X200)；
[0015] 圖6是Tbx5病毒感染小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，第4d觀察熒光計(jì)算病毒感染效率，圖中 顯示為細(xì)胞在熒光(ABC)和白光(abc)下的圖片，病毒體積(A)為2yL，（B)為10yL，（C)為30yL (X200)；
[0016] 圖7是Mef 2c病毒感染小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，第4d觀察熒光計(jì)算病毒感染效率，圖 中顯示為細(xì)胞在熒光(ABC)和白光(abc)下的圖片，病毒體積(A)為2yL，（B)為10yL，（C)為30 yL( X200)；
[0017]圖8是慢病毒感染小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，三種轉(zhuǎn)錄因子Gata4、Mef2c和Tbx5同時(shí)轉(zhuǎn) 入成纖維細(xì)胞后第4d，觀察細(xì)胞熒光（A)和白光（a)下的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算病毒感染效率（X 200)；
[0018] 圖9是RT-PCR檢測Gata4、Mef2c和Tbx5mRNA的表達(dá)，三種目的基因 Gata4、Mef2c和 Tbx5分別感染成纖維細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)每個(gè)基因 mRNA的表達(dá)水平(*P〈0.05);
[0019]圖10是三種轉(zhuǎn)錄因子Gata4、Mef2c和Tbx5共同感染小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 第1、2、3、4周細(xì)胞熒光的變化，圖為細(xì)胞熒光(A-D)和白光(a-d)下的對比圖，（A)為第1周， (B)為第2周，（C)為第3周，（D)為第4周（X 100);
[0020]圖11是免疫熒光化學(xué)方法檢測重編程細(xì)胞和心肌細(xì)胞內(nèi)心肌特異蛋白cTnl和 Myh6的表達(dá)，（A)為重編程細(xì)胞內(nèi)cTnl的表達(dá)，（B)為重編程細(xì)胞內(nèi)Myh6的表達(dá)，（C)為心肌 細(xì)胞內(nèi)cTnl的表達(dá)，（D)為心肌細(xì)胞內(nèi)Myh6的表達(dá)（X 100);
[0021]圖12是RT-PCR檢測成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞后第1、2、3、4周心肌特異標(biāo) 記基因 cTnl和Myh6的表達(dá)水平(*P〈0.05);
[0022] 圖13是三種轉(zhuǎn)錄因子Gata4、Mef2c和Tbx5同時(shí)轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后第1周和第 2周感染的細(xì)胞熒光(A-F)和白光(a-f)下的對比，ABC(abc)為病毒感染后第1周，DEF(def) 為感染后第2周，（A)和(D)為Oh組，（B)和(E)為低氧6h組，（C)和(F)為低氧12h組（X100); [0023] 圖14是三種轉(zhuǎn)錄因子Gata4、Mef2c和Tbx5同時(shí)轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后第3周和第 4周感染的細(xì)胞熒光(A-F)和白光(a-f)下的對比，ABC(abc)為病毒感染后第3周，DEF(def) 為感染后第4周，（A)和(D)為Oh組，（B)和(E)為低氧6h組，（C)和(F)為低氧12h組（X100); [0024] 圖15是RT-PCR檢測低氧預(yù)處理不同時(shí)間（Oh、6h和12h)組轉(zhuǎn)染后第1、2、3、4周重編 程細(xì)胞內(nèi)Myh6表達(dá)量的變化；
[0025]圖16是免疫熒光化學(xué)方法檢測低氧預(yù)處理不同時(shí)間點(diǎn)直接重編程的細(xì)胞內(nèi)特異 蛋白Myh6的表達(dá)，Myh6表達(dá)為綠色熒光，細(xì)胞核為DAPI染色（X200);
[0026]圖17是流式細(xì)胞儀測定心肌特異性標(biāo)記蛋白Myh6的表