專利名稱：采用重編程序的成熟成體細(xì)胞的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
使用重編程序的細(xì)胞(reprogrammed cells)諸如反分化、轉(zhuǎn)分化或再分化細(xì)胞治 療患者中的各種疾病、紊亂或病癥的方法。該方法包括從患者獲得定型細(xì)胞、反分化定型細(xì)胞以獲得反分化祀細(xì)胞、和將反分化細(xì)胞施用至患者。在一些實(shí)施方案中，該方法包括從患者獲得定型細(xì)胞、轉(zhuǎn)分化定型細(xì)胞以獲得轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞、和將轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞施用至患者。所述反分化或轉(zhuǎn)分化祀細(xì)胞修復(fù)或補(bǔ)充患者中的組織或細(xì)胞。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞的特征在于其通過(guò)細(xì)胞有絲分裂而自我更新以及分化成各種特化細(xì)胞類型的能力。兩種廣泛類型的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞是分離自胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胚胎干細(xì)胞和發(fā)現(xiàn)于成體組織的成體干細(xì)胞。在發(fā)育胚胎中，干細(xì)胞可分化成所有特化胚胎組織。在成年生物體中，干細(xì)胞和祖細(xì)胞補(bǔ)充特化細(xì)胞并維持再生器官例如血液、皮膚或腸組織的正常更新。盡管干細(xì)胞在發(fā)育胚胎中很豐富，但干細(xì)胞量隨著發(fā)育進(jìn)行而下降。相比之下，成年生物體包含有限數(shù)量的限于某些機(jī)體區(qū)室的干細(xì)胞。干細(xì)胞的治療應(yīng)用具有改變對(duì)于多種疾病或紊亂的治療的潛能。盡管已經(jīng)存在一些成體干細(xì)胞治療諸如骨髓移植，但醫(yī)學(xué)研究人員期望使用干細(xì)胞來(lái)治療更寬種類的疾病，包括癌癥、帕金森病、脊髓損傷、肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化和肌肉損傷等。這樣的治療可以利用干細(xì)胞分化成治療該疾病所需的細(xì)胞類型的能力。然而，關(guān)于成功使用干細(xì)胞治療這樣的疾病存在不確定性，而且關(guān)于干細(xì)胞可獲得的容易性存在疑慮。例如，傳統(tǒng)上通過(guò)從骨髓、動(dòng)員生長(zhǎng)因子的外周血液或臍帶血(胎盤)分離而提取造血干細(xì)胞。造血干細(xì)胞也可從胚胎干(ES)細(xì)胞制備，所述胚胎干(ES)細(xì)胞提取自使用體外受精技術(shù)獲得的胚胎。然而，從這些來(lái)源提取是麻煩的，有時(shí)是危險(xiǎn)的，并且可能受到倫理關(guān)切的挑戰(zhàn)。此外，可從這些來(lái)源獲得的干細(xì)胞數(shù)有限。而且，干細(xì)胞可能在分化成治療疾病所需的細(xì)胞方面存在困難。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及利用重編程序的細(xì)胞來(lái)在患者中修復(fù)組織或補(bǔ)充組織或細(xì)胞。例如，本發(fā)明涉及利用從分化或定型細(xì)胞的反分化獲得的反分化細(xì)胞來(lái)在患者中修復(fù)組織或補(bǔ)充組織或細(xì)胞。本發(fā)明還涉及利用從分化或定型細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化獲得的轉(zhuǎn)分化細(xì)胞來(lái)在患者中修復(fù)組織或補(bǔ)充組織或細(xì)胞。本申請(qǐng)部分基于申請(qǐng)人的這樣的發(fā)現(xiàn)從患者獲得的定型細(xì)胞或體細(xì)胞可以重編程序，產(chǎn)生不同譜系的細(xì)胞，并且這些重編程序的細(xì)胞可被施用給患者，以修復(fù)或補(bǔ)充組織或細(xì)胞。重編程序過(guò)程的實(shí)例包括反分化和轉(zhuǎn)分化。
因此，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)定型細(xì)胞可經(jīng)歷重編程序而產(chǎn)生不同譜系的細(xì)胞。例如，定型細(xì)胞可經(jīng)歷反分化，產(chǎn)生反分化細(xì)胞，例如分化程度較小的細(xì)胞，諸如多能干細(xì)胞，并且這些反分化細(xì)胞可被施用給患者以修復(fù)或補(bǔ)充組織或細(xì)胞。作為另一個(gè)實(shí)例，從患者獲得的定型細(xì)胞可以經(jīng)歷轉(zhuǎn)分化，產(chǎn)生轉(zhuǎn)分化細(xì)胞，例如與該定型細(xì)胞譜系不同的細(xì)胞，而且這些轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞可被施用給患者，以修復(fù)或補(bǔ)充組織或細(xì)胞。本發(fā)明包括通過(guò)施用重編程序的細(xì)胞至患者而在該患者中修復(fù)或補(bǔ)充一種細(xì)胞譜系的組織或細(xì)胞(tissue or cells of a cell lineage)的方法。具體而言，本發(fā)明包括在患者中修復(fù)或補(bǔ)充一種細(xì)胞譜系的組織或細(xì)胞的方法，包括(i)獲得定型細(xì)胞，(ii)反分化該定型細(xì)胞以獲得反分化靶細(xì)胞，和(iii)將該反分化靶細(xì)胞施用至患者，其中該反分化靶細(xì)胞再分化成該細(xì)胞譜系的細(xì)胞。這些再分化的細(xì)胞與該定型細(xì)胞可以是相同的細(xì)胞譜系或不同的細(xì)胞譜系。本發(fā)明還包括在患者中修復(fù)或補(bǔ)充一種細(xì)胞譜系組織或細(xì)胞的方法,包括(i)獲得定型細(xì)胞，(ii)轉(zhuǎn)分化該定型細(xì)胞以獲得轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞，和(iii)將該轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞施
用至患者。在一些實(shí)施方案中，患者可患有疾病、紊亂或病癥，包括但不限于骨髓衰竭、血液病癥、再生障礙性貧血、3地中海貧血、糖尿病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、帕金森病、脊髓損傷、肌營(yíng)養(yǎng)不良、腎疾病、多發(fā)性硬化、充血性心力衰竭、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、頭部創(chuàng)傷、脊髓損傷、肺疾病、抑郁癥、非梗阻性無(wú)精子癥、男性更年期(andropause)、絕經(jīng)期和不育癥、復(fù)壯、硬皮病性潰瘍、銀屑病、皺紋(wrinkles)、肝硬化、自身免疫病、脫發(fā)、色素性視網(wǎng)膜炎、晶狀變性(crystalline dystrophy)/失明、糖尿病和不育癥。因此，在一些實(shí)施方案中，重編程序的細(xì)胞可以是在患者中治療再生障礙性貧血、白血病、淋巴瘤或人免疫缺陷病毒的骨髓細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，重編程序的靶細(xì)胞諸如反分化細(xì)胞、轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞或再分化細(xì)胞可包括但不限于多能干細(xì)胞、多能生殖細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞(neuronal stemcell)、上皮干細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)胚層和和神經(jīng)外胚層干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、胚外的胚胎干細(xì)胞、腎細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)胚層細(xì)胞、神經(jīng)元、外胚層細(xì)胞、胰島細(xì)胞、腺泡細(xì)胞、卵母細(xì)胞、精子、造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、皮膚/角化細(xì)胞、黑素細(xì)胞、骨/骨細(xì)胞、毛發(fā)/真皮乳頭細(xì)胞、軟骨/軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞/脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌/心肌細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，定型細(xì)胞獲自血液或包括骨髓在內(nèi)的有關(guān)組織。定型細(xì)胞可以從全血獲得和/或可以通過(guò)單采血液成分術(shù)獲得。血液可以是動(dòng)員或未動(dòng)員的血液。這樣的定型細(xì)胞包括但不限于T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅血球、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞?？蛇x地，定型細(xì)胞可以獲自來(lái)自中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)組織、肌肉組織或來(lái)自皮膚的表皮和/或真皮組織。在一些實(shí)施方案中，定型細(xì)胞獲自患者的血液或組織。在一些實(shí)施方案中，從其獲得定型細(xì)胞的患者與向其施用重編程序的靶細(xì)胞諸如反分化靶細(xì)胞或轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞的患者是相同的患者。
在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將定型細(xì)胞與試劑接觸而使定型細(xì)胞反分化。例如，定型細(xì)胞可以用所述試劑溫育。在一些實(shí)施方案中，所述試劑接合在定型細(xì)胞表面上調(diào)節(jié)抗原的捕獲、識(shí)別或呈遞的受體。受體可以是MHC I類抗原或MHC II類抗原。在一些實(shí)施方案中，I類抗原是HLA-A受體、HLA-B受體、HLA-C受體、HLA-E受體、HLA-F受體或HLA-G受體，且所述II類抗原是HLA-DM受體、HLA-DP受體、HLA-DQ受體或HLA-DR受體。在一些實(shí)施方案中，所述試劑可以是受體的抗體，諸如受體的單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體CR3/43或單克隆抗體TAL 1B5。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述試劑調(diào)節(jié)MHC基因表達(dá)，諸如MHC I+類和/或MHC II+類表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，反分化細(xì)胞可在單獨(dú)的步驟中經(jīng)歷再分化。例如，可通過(guò)使反分化細(xì)胞與生長(zhǎng)因子接觸而使反分化細(xì)胞再分化，所述生長(zhǎng)因子包括但不限于堿性成纖 維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落-刺激因子、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素-I、-3、-6和-7、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素、干細(xì)胞因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白。然后，所得到的再分化靶細(xì)胞可被施用給患者。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以通過(guò)在特定培養(yǎng)條件中培養(yǎng)定型細(xì)胞而使定型細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。例如，定型細(xì)胞可以在特定類型的培養(yǎng)基中與反分化試劑一起培養(yǎng)。這些培養(yǎng)基的實(shí)例可包括達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、Iscove改良達(dá)爾伯克氏培養(yǎng)基(IMDM)等。組織培養(yǎng)基也可包含分化促進(jìn)劑，諸如維生素和/或礦物質(zhì)補(bǔ)充劑、氫化可的松、地塞米松、￠-巰基乙醇等。而且，另外的培養(yǎng)條件包括使用螯合劑或抗生素、在某些溫度或二氧化碳或氧水平下培養(yǎng)、以及在某些容器中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件可決定得到的轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞的類型。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是獲得靶細(xì)胞的方法。所述方法可包括獲得定型細(xì)胞，然后使定型細(xì)胞重編程序。這些方法如在本申請(qǐng)中所描述。在一些實(shí)施方案中，所述方法可包括反分化定型細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，所述方法可包括轉(zhuǎn)分化定型細(xì)胞。在又一些實(shí)施方案中，所述方法可包括反分化定型細(xì)胞，然后再分化所述反分化細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種或多種重編程序的靶細(xì)胞在制備用于在患者中修復(fù)或補(bǔ)充一種細(xì)胞譜系的組織或細(xì)胞或用于治療疾病或組織損傷的藥物中的用途。此外，本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種在需要的患者中治療疾病或組織損傷的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括獲得定型細(xì)胞、使所述定型細(xì)胞重編程序以獲得重編程序的靶細(xì)胞、和將所述重編程序的靶細(xì)胞施用至所述患者。在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞可以通過(guò)反分化、轉(zhuǎn)分化和/或再分化進(jìn)行重編程序。在特定實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是反分化靶細(xì)胞、轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞和/或再分化靶細(xì)胞。獲得定型細(xì)胞和使定型細(xì)胞重編程序的方法如本申請(qǐng)中所描述。在一些實(shí)施方案中，重編程序的靶細(xì)胞諸如反分化靶細(xì)胞、轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞或再分化靶細(xì)胞可以通過(guò)注射，植入或輸注施用。這些細(xì)胞可以通過(guò)腸胃外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)皮注射或注射入脊髓液而施用。在一些實(shí)施方案中，反分化靶細(xì)胞或轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞在藥物組合物中施用。藥物組合物可包含反分化靶細(xì)胞或轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。本發(fā)明的一個(gè)方面是用于施用重編程序的靶細(xì)胞諸如反分化靶細(xì)胞或轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞的藥物組合物。藥物組合物可包含一種或多種類型的靶細(xì)胞和至少一種藥學(xué)可接受的載體。任選地，藥物組合物可包含佐劑和/或其它適于施用入患者的賦形劑。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種制備藥物組合物或藥物的方法，其包括(i)獲得定型細(xì)胞，(ii)使定型細(xì)胞重編程序，以獲得重編程序的靶細(xì)胞，和(iii)任選地，組合重編程序的靶細(xì)胞與一種或多種藥物賦形劑。在一些實(shí)施方案中，重編程序的靶細(xì)胞與一種或多種藥物賦形劑組合。在其它實(shí)施方案中，重編程序的靶細(xì)胞不與一種或多種藥物賦形劑組合。獲得定型細(xì)胞和使定型細(xì)胞重編程序的方法如本申請(qǐng)中所描述。應(yīng)指出，在本公開內(nèi)容中、尤其在權(quán)利要求和/或段落中，術(shù)語(yǔ)諸如“包括”等可具有在美國(guó)專利法中屬于該術(shù)語(yǔ)的含義；例如，它們可意指“包含”等；并且術(shù)語(yǔ)諸如“基本由……組成”具有美國(guó)專利法中屬于該術(shù)語(yǔ)的含義，例如，它們?cè)试S有未明確描述的要素，但排除在現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的要素或影響本發(fā)明的基本或新的特征的要素。這些和其它實(shí)施方案公開于下列詳細(xì)描述或者從下列詳細(xì)描述是顯而易見的，并且由其包括。附圖簡(jiǎn)述
下列以實(shí)例給出但非旨在將本發(fā)明只限制于所描述的具體實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明可結(jié)合附圖得到最好的理解，其中
圖I顯示重編程序誘導(dǎo)之前(上圖)和之后(下圖)經(jīng)單采血液成分術(shù)的單核的細(xì)胞的免疫表型分型。對(duì)于免疫球蛋白Gl (IgGl)同種型對(duì)照和CD34或CD19，分別用綴合于R-藻紅蛋白(RPE) Cy-5或藻紅蛋白(PE)(垂直圖例)的單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞。細(xì)胞也針對(duì)綴合于異硫氰酸熒光素(FITC)的⑶45、⑶38、⑶61、和IgGl同種型對(duì)照單克隆抗體進(jìn)行染色(水平圖例)。下圖顯示了造血干細(xì)胞的增加，如CD34和CD34CD38-細(xì)胞的相對(duì)數(shù)增加伴隨白細(xì)胞成熟標(biāo)記諸如CD45和CD19的減少所描述。圖2a顯不在輸注自體HRSC后(輸注后第I日、第2日、第3日、第6日和第14日)患有嚴(yán)重的再生障礙性貧血的患者的外周血液樣品的順序免疫表型分型。用抗CD34和⑶45 (第二排的圖)和⑶34和⑶38 (第三排的圖)的單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞。頂排的圖顯示前向和側(cè)向散射是自體HRSC的流式細(xì)胞術(shù)、骨髓涂片和環(huán)鉆切片(tehphin section)。第I日至第14日顯示具有指示粒細(xì)胞的大的前向和側(cè)向散射的細(xì)胞增加，且第I日至第3日顯示循環(huán)CD34造血干細(xì)胞的相對(duì)數(shù)增加。圖2b顯示在輸注自體人重編程序的干細(xì)胞(HRSC)后(輸注后第I日、第2日、第3日、第6日和第14日)患有嚴(yán)重的再生障礙性貧血的患者的外周血液樣品的順序免疫表型分型。用抗⑶34和⑶61 (第一排的圖)、⑶19和⑶3 (第二排的圖)和⑶33和13和⑶7 (第三排的圖)的單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞。FACScan圖顯示了髓樣細(xì)胞數(shù)的增加，如包括祖細(xì)胞在內(nèi)的表達(dá)CD33和13的細(xì)胞的逐漸增加所描述，所述表達(dá)⑶33和13的細(xì)胞的逐漸增加通過(guò)共表達(dá)⑶33和13與⑶7的細(xì)胞相對(duì)數(shù)的增加所描述。此外,淋巴細(xì)胞的相對(duì)數(shù)也逐漸增加,如CD19和CD3淋巴細(xì)胞相對(duì)數(shù)的增加所示。圖3顯示了在輸注自體HRSC前后嚴(yán)重再生障礙性貧血患者的骨髓分析。治療前后的骨髓涂片(a和b)顯示紅細(xì)胞增加；治療前后環(huán)鉆切片(terphine section) (c和d)顯示骨髓細(xì)胞性增加；輸注HRSC后的骨髓克隆分析顯示集落形成單位巨核細(xì)胞(e);集落形成單核細(xì)胞(f);集落形成粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(g);和集落形成中幼粒細(xì)胞和類紅細(xì)胞(h)；以及爆發(fā)形成類紅細(xì)胞(I)的生長(zhǎng)增加。
圖4顯示在輸注自體HRSC 4年后患有嚴(yán)重再生障礙性貧血的患者的外周血液樣品的核型分析和g顯帶，顯示無(wú)遺傳異常。圖5顯示在用自體重編程序細(xì)胞治療后在地中海貧血患者中絕對(duì)平均胎兒血紅蛋白水平的增加。圖6顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療后在地中海貧血患者中以飛升表示的代表紅細(xì)胞平均尺寸的平均紅細(xì)胞體積增加。圖7顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療后在地中海貧血患者中以皮克表示的平均細(xì)胞血紅蛋白增加，所述平均細(xì)胞血紅蛋白是每個(gè)細(xì)胞中血紅蛋白的重量。圖8顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療后在地中海貧血患者中以納克每毫升表示的血清鐵蛋白水平的減少。
圖9顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療后在糖尿病患者中空腹和混合餐飲食攝入后C-肽水平的增加。

圖10顯示在用自體重編程序細(xì)胞治療后在糖尿病患者中糖化血紅蛋白(HbAlC)水平的減少。圖11顯示在用自體重編程序細(xì)胞治療后在肌營(yíng)養(yǎng)不良患者中肌酸磷酸激酶(CPK)和乳酸脫氫酶(LDH)水平的減少。圖12顯示在用自體重編程序細(xì)胞治療后在肌營(yíng)養(yǎng)不良患者中肝臟酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平的減少。圖13顯不在用自體重編程序細(xì)胞治療后在12例腎疾病患者中微量白蛋白尿素水平的減少。圖14顯示在用自體重編程序細(xì)胞治療后在12例由于糖尿病而患有腎疾病的患者中糖化血紅蛋白(HbAlC)水平的減少。圖15a顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療之前(左掃描圖)和治療后三個(gè)月(右掃描圖)多發(fā)性硬化患者腦的磁共振成像(MRI)掃描圖，其顯示干細(xì)胞治療后損害增強(qiáng)減少。圖15b顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療之前(左掃描圖)和治療后三個(gè)月(右掃描圖)患者腦的不同部分的MRI掃描圖。在表示治療前的掃描圖中，箭頭指向腦中的損害，而在表不治療后的掃描圖中，ftr頭指向該損咅的改善。圖16a顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療之前(上掃描圖)和治療后六個(gè)月(下掃描圖)多發(fā)性硬化患者腦的磁共振成像(MRI)掃描圖。圖16b顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療之前(上掃描圖)和治療后六個(gè)月(下掃描圖)患者腦的另外的MRI掃描圖。在表不治療如的掃描圖中，ftr頭指向腦中的損咅，而在表不治療后的掃描圖中，ftr頭指向該損害的改善，腦萎縮減少，如腦室和腦溝擴(kuò)大減少所表示的。圖17a顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療之前(左掃描圖)和治療后六個(gè)月(右掃描圖)多發(fā)性硬化患者的矢狀面磁共振成像(MRI)掃描圖。圖17b顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療之前(左掃描圖)和治療后六個(gè)月(右掃描圖)所述患者脊髓的橫斷面MRI掃描圖。在顯示治療前的掃描圖中，箭頭指向所述脊髓上的損害，而在顯示治療后的掃描圖中，箭頭指向該損害的改善。圖18a顯示在用自體重編程序細(xì)胞處理后在感染上丙型肝炎的患者中肝臟酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平的減少，而圖18b顯示在用自體重編程序細(xì)胞處理后在感染上丙型肝炎的患者中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平的減少。
圖19a顯示由于機(jī)動(dòng)車事故造成頭部創(chuàng)傷的患者腦的磁共振成像(MRI)掃描圖。在治療前(上掃描圖)，腦室顯示擴(kuò)大和移位，具有寬的矛狀血腫。在用自體重編程序的細(xì)胞治療后(下掃描圖)，腦室顯示腦萎縮參數(shù)下降，諸如腦室和腦溝擴(kuò)張減少，及血腫改善。圖19b顯示在治療之前(上掃描圖)和治療后(下掃描圖)所述患者腦的另外的MRI掃描圖。圖20顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療之前(左X-射線圖)和之后(右X-射線圖)肺病患者的胸部X-射線圖。在治療后，患者顯示出肺容量的改善和損害尺寸的減少，如高致密區(qū)減少所示。圖21顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療的非梗阻性無(wú)精子癥患者中促卵泡激素(fsh)、促黃體生激素(Ih)、孕酮(pro)和睪酮(test)的性激素水平。所述水平顯示，游離睪酮顯著增加，且由超聲波確定的睪丸尺寸(數(shù)據(jù)未示出)增加。
圖22顯示在用自體重編程序的細(xì)胞治療之前(上圖)和之后(下圖)在患有受損視力的患者中的視網(wǎng)膜靈敏度和視覺缺損。在視網(wǎng)膜靈敏度結(jié)果中，橙色區(qū)域表示視網(wǎng)膜靈敏度下降。在視覺缺損結(jié)果中，白色區(qū)域表示正常視力，粉色、橙色和黑色區(qū)域表示視覺缺損增加。在治療之后，患者的視野得以改善，因?yàn)橹委熐耙暰W(wǎng)膜靈敏度結(jié)果中的橙色區(qū)域在治療后變成綠色和白色，且治療前視覺缺損結(jié)果中的黑色區(qū)域在治療后變成白色。詳述 定義
如本文所使用，“定型細(xì)胞(committed cells) ”是展示分化特性的細(xì)胞。這些細(xì)胞通常被認(rèn)為是成熟和特化的。實(shí)例包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)元和軟骨細(xì)胞。如本文所使用，“未定型細(xì)胞”是未展示成熟的分化特性的細(xì)胞。這些細(xì)胞通常被認(rèn)為是不成熟的和非特化的。未定型細(xì)胞的實(shí)例是干細(xì)胞，其是能夠自我更新(無(wú)限制分裂)和分化(特化)的未成熟細(xì)胞。如本文所使用，“重編程序”是指第一細(xì)胞譜系的定型細(xì)胞變成不同細(xì)胞類型的細(xì)胞的過(guò)程。該不同的細(xì)胞類型可以是不同的細(xì)胞譜系。重編程序可通過(guò)諸如反分化、轉(zhuǎn)分化或再分化的過(guò)程而發(fā)生。如本文所使用，“重編程序的細(xì)胞”是經(jīng)歷定型細(xì)胞重編程序的細(xì)胞。重編程序的細(xì)胞可包括反分化細(xì)胞、轉(zhuǎn)分化細(xì)胞和/或再分化細(xì)胞。如本文所使用，“反分化”是定型細(xì)胞(即成熟的特化細(xì)胞)恢復(fù)到更原始的細(xì)胞階段的過(guò)程?！胺捶只?xì)胞”是由定型細(xì)胞反分化獲得的細(xì)胞。如本文所使用，“轉(zhuǎn)分化”是第一細(xì)胞譜系的定型細(xì)胞變成不同細(xì)胞類型的另一種細(xì)胞的過(guò)程。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)分化可以是反分化和再分化的結(jié)合?！稗D(zhuǎn)分化細(xì)胞”是由定型細(xì)胞轉(zhuǎn)分化獲得的細(xì)胞。例如，定型細(xì)胞諸如全血細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化成神經(jīng)元。如本文所使用，“再分化”是指未定型細(xì)胞或反分化細(xì)胞分化成更成熟的特化細(xì)胞的過(guò)程?！霸俜只?xì)胞”是指從未定型細(xì)胞或反分化細(xì)胞再分化獲得的細(xì)胞。如果再分化細(xì)胞通過(guò)反分化細(xì)胞的再分化獲得，再分化細(xì)胞可以是與已經(jīng)經(jīng)歷反分化的定型細(xì)胞相同或不同的譜系。例如，定型細(xì)胞諸如白細(xì)胞可以反分化而形成反分化細(xì)胞諸如多能干細(xì)胞，然后該反分化細(xì)胞可以再分化而形成淋巴細(xì)胞，其為與白細(xì)胞(定型細(xì)胞)相同的譜系，或再分化形成神經(jīng)元，其為與白細(xì)胞(定型細(xì)胞)不同的譜系。
如本文所使用，“靶細(xì)胞”是獲得用于施用至患者以修復(fù)或補(bǔ)充組織或細(xì)胞的細(xì)胞。例如，靶細(xì)胞可以是重編程序的靶細(xì)胞，諸如反分化靶細(xì)胞或轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞，由此反分化或轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞被施用至患者。定型細(xì)胞
如上所述，本發(fā)明的定型細(xì)胞是展示分化特性的細(xì)胞。定型細(xì)胞可包含與抗原呈遞、捕獲或識(shí)別有關(guān)的任何成分。例如，定型細(xì)胞可以是MHC I+類和/或MHC II+類細(xì)胞。定型細(xì)胞也可以是來(lái)源于或可來(lái)源于未分化細(xì)胞的任何細(xì)胞。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，定型細(xì)胞也是未分化細(xì)胞。因此，例如，定型細(xì)胞可以是淋巴干細(xì)胞或髓樣干細(xì)胞，其相對(duì)于多能干細(xì)胞而言是分化的。定型細(xì)胞可以來(lái)源于生物材料，諸如血液或相關(guān)組織(包括骨髓或臍帶血)、來(lái)自中樞神經(jīng)系統(tǒng)或外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)組織、肌肉組織或來(lái)自皮膚的表皮和/或真皮組織(即，例如通過(guò)口腔刮除的方式)。生物材料可以是出生后來(lái)源。生物材料可以使用本領(lǐng)域已知的適于所述組織類型的方法獲得。實(shí)例包括但不限于切除、針抽取、擦拭和單采血液成分術(shù)。在具體的實(shí)施方案中，定型細(xì)胞來(lái)源于全血或其加工產(chǎn)物，諸如血漿或棕黃層，因 為它們從受試者的移除可以以最小程度的醫(yī)學(xué)監(jiān)督進(jìn)行。血液樣品通常用抗凝劑諸如肝素或檸檬酸鹽處理。生物樣品中的細(xì)胞可以被處理以富集某些細(xì)胞類型、除去某些細(xì)胞類型或從組織塊分離細(xì)胞。用于純化和分離細(xì)胞的有用方法包括離心(諸如密度梯度離心)、流式細(xì)胞術(shù)和親和色譜法(諸如利用包含抗細(xì)胞表面標(biāo)記的單克隆抗體的磁珠或淘選)(見Vettese-Dadey, The Scientist 1999, 13: 21)。例如，F(xiàn)icoll-Hypaque 分離可用于除去紅細(xì)胞和粒細(xì)胞以留下單核的細(xì)胞諸如淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞?？梢栽醋匝旱亩ㄐ图?xì)胞的實(shí)例包括但不限于CFC-T細(xì)胞、CFC-B細(xì)胞、CFC-Eosin 細(xì)胞、CFC-Bas 細(xì)胞、CFC-Bas 細(xì)胞、CFC-GM 細(xì)胞、CFC-M、CFC-MEG 細(xì)胞、BFC-E 細(xì)胞、CFC-E細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞。血液來(lái)源的定型細(xì)胞可以通過(guò)其特定抗原的表達(dá)加以鑒定。例如，B細(xì)胞是⑶19+、⑶21+、⑶22+和DR+細(xì)胞。T細(xì)胞是⑶2+、⑶3+、以及⑶4+或⑶8+細(xì)胞。未成熟的淋巴細(xì)胞是⑶4+和⑶8+細(xì)胞?；罨疶細(xì)胞是DR+細(xì)胞。天然殺傷細(xì)胞(NK)是⑶56+和⑶16+細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞是⑶7+細(xì)胞。白細(xì)胞是⑶45+細(xì)胞。粒細(xì)胞是⑶13+和⑶33+細(xì)胞。單核巨噬細(xì)胞是⑶14+和DR+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，定型細(xì)胞可以是B淋巴細(xì)胞(活化或未活化的)、T淋巴細(xì)胞(活化或未活化的)、來(lái)自巨噬細(xì)胞單核細(xì)胞譜系的細(xì)胞、能夠表達(dá)I類或II類抗原的有核細(xì)胞、可被誘導(dǎo)表達(dá)I類或II類抗原的細(xì)胞或無(wú)核細(xì)胞(即不包含核的細(xì)胞諸如紅細(xì)胞)。在可選的實(shí)施方案中，定型細(xì)胞可以選自包括各自表達(dá)⑶56和/或⑶16細(xì)胞表面受體的大顆粒淋巴細(xì)胞、裸淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞組的任何一種。由于定型細(xì)胞基本上是原代培養(yǎng)物，因此用合適的營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充細(xì)胞群以維持生活力可能是必需的。合適的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。盡管如此，細(xì)胞群的處理優(yōu)選在從患者移出生物樣品之后盡快開始，通常在12小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選在2至4小時(shí)內(nèi)。細(xì)胞生活力可以使用眾所周知的技術(shù)諸如臺(tái)盼藍(lán)排除或碘化丙啶檢測(cè)。
反分化細(xì)胞
反分化是一種類型的重編程序過(guò)程，由此細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能逐漸地變化，產(chǎn)生特化程度較低的細(xì)胞。反分化可以自然地發(fā)生，其中細(xì)胞可響應(yīng)于組織損傷而在體內(nèi)經(jīng)歷有限的反向分化?？蛇x地，可以使用在美國(guó)申請(qǐng)序列第08/594，164號(hào)(現(xiàn)美國(guó)專利第6，090，625號(hào))、美國(guó)申請(qǐng)序列第09/742，520號(hào)(現(xiàn)美國(guó)專利第7，112，440號(hào))、美國(guó)申請(qǐng)序列第10/140，978號(hào)(現(xiàn)美國(guó)專利第7，220，412號(hào))、美國(guó)申請(qǐng)序列第10/150，789號(hào)(現(xiàn)美國(guó)專利第7，410，773號(hào))和美國(guó)申請(qǐng)序列第09/853，188號(hào)中描述的方法誘導(dǎo)反分化，所述申請(qǐng)或?qū)＠纪ㄟ^(guò)引用并入本文。本發(fā)明的反分化細(xì)胞可包括但不限于多能干細(xì)胞、淋巴干細(xì)胞、髓樣干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、內(nèi)胚層干細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。
在具體實(shí)施方案中，定型細(xì)胞來(lái)源于血液并反分化而形成造血細(xì)胞譜系的反分化細(xì)胞。這些反分化細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于多能干細(xì)胞、淋巴干細(xì)胞和髓樣干細(xì)胞。定型細(xì)胞可以通過(guò)將該細(xì)胞與可操作地接合該細(xì)胞的試劑接觸而反分化。然后，溫育所述細(xì)胞，以使得已經(jīng)由所述試劑可操作接合的那些細(xì)胞通過(guò)反分化過(guò)程發(fā)展并最終變成未分化的。接觸步驟可包括所述試劑與定型細(xì)胞上的表面抗原接合。所述試劑可以與定型細(xì)胞直接接合或間接接合起作用。直接接合的實(shí)例是定型細(xì)胞在其細(xì)胞表面上具有至少一種細(xì)胞表面受體諸如具有同源區(qū)(通常發(fā)現(xiàn)具有相同或相似的序列的區(qū)域)的鏈(諸如可在B細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的那些)并且其中試劑直接結(jié)合所述細(xì)胞表面受體時(shí)。另一個(gè)實(shí)例是定型細(xì)胞在其細(xì)胞表面上具有細(xì)胞表面受體諸如具有同源區(qū)的α-鏈(諸如可在T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的那些)并且其中所述試劑直接接合所述細(xì)胞表面受體時(shí)。間接接合的實(shí)例是定型細(xì)胞在其細(xì)胞表面上具有至少兩種細(xì)胞表面受體并且所述試劑與所述受體之一的接合影響另一個(gè)受體時(shí)，該另一個(gè)受體然后誘導(dǎo)定型細(xì)胞的反分化。用于反分化定型細(xì)胞的試劑可以是化學(xué)化合物或組合物。例如，所述試劑可以能夠接合定型細(xì)胞表面上的細(xì)胞表面受體。在一些實(shí)施方案中，所述試劑可操作地接合定型細(xì)胞表面上存在的受體，該受體可以由所述定型細(xì)胞表達(dá)，例如能夠由定型細(xì)胞表達(dá)的受體。例如，試劑可包括但不限于環(huán)腺苷酸(cAMP)、⑶4分子、⑶8分子、T細(xì)胞受體的一部分或全部、配體(固定的或游離的)、肽、T細(xì)胞受體(TCR)、抗體、交叉反應(yīng)性抗體、單克隆抗體或多克隆抗體中的任何一種或多種。也可使用生長(zhǎng)因子，諸如造血生長(zhǎng)因子，例如促紅細(xì)胞生成素和粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。如果所述試劑是抗體、交叉反應(yīng)性抗體、單克隆抗體或多克隆抗體，則所述試劑可以是下列的任何一種或多種的抗體、交叉反應(yīng)性抗體、單克隆抗體或多克隆抗體的任何一種或多種MHC II類抗原的β -鏈、MHC HLA-DR抗原的β -鏈、MHC I類或II類抗原的α-鏈、HLA-DR抗原的α-鏈、MHC II類抗原或MHC I類抗原的α -鏈和β-鏈?？贵w的實(shí)例是CR3/43 (由Dako提供)。術(shù)語(yǔ)“抗體”可包括保持結(jié)合活性的各種片段(來(lái)源于蛋白水解裂解或重組技術(shù))和衍生物，諸如Fab、F(ab’)2和scFv抗體以及其模擬物或生物電子等排體。也包括在內(nèi)的抗體是遺傳改造的變體，其中一些氨基酸序列已經(jīng)被修飾，例如通過(guò)氨基酸殘基的置換以增強(qiáng)結(jié)合，或者其中抗體已經(jīng)在與其細(xì)胞期望根據(jù)本發(fā)明的方法處理的生物不同的物種中進(jìn)行制備，以減小不利免疫反應(yīng)的可能性(其一個(gè)實(shí)例是“人源化”小鼠單克隆抗體)。用于實(shí)現(xiàn)定型細(xì)胞向反分化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的試劑優(yōu)選可在定型細(xì)胞的胞外發(fā)揮作用。例如，定型細(xì)胞可包含由所述試劑可操作接合的受體，并且所述試劑可操作接合所述受體。例如，受體可以是細(xì)胞表面受體。細(xì)胞表面受體的具體實(shí)例包括但不限于MHC I類和II類受體。受體可包含α -成分和/或β -成分，如同MHC I類和II類受體的情況一樣。受體可包含具有同源區(qū)的β -鏈，例如至少HLA-DR的β -鏈的同源區(qū)?？蛇x地或另外，所述受體可包含具有同源區(qū)的α -鏈，例如至少HLA-DR的α -鏈的同源區(qū)。受體可以是主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的I類或II類抗原。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞表面受體可包括但不限于HLA-DR受體、DM受體、DP受體、DQ受體、HLA-A受體、HLA-B受體、HLA-C受體、HLA-E受體、HLA-F受體或HLA-G受體。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞表面受:體可以是HLA-DR受:體。試劑可以是所述受體的抗體，諸如所述受體的單克隆抗體。試劑的實(shí)例可以是調(diào)節(jié)MHC基因表達(dá)諸如MHC I+類和/或MHC II+類表達(dá)的試劑。在一些實(shí)施方案中，所述試劑可與生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑一起使用。生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括但不限于烷化劑、免疫調(diào)節(jié)劑、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面受體、激素、核酸、核苷酸序列、抗原或肽。例如，烷化劑可以是環(huán)磷酰胺或可包含環(huán)磷酰胺。其它生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑可包括能夠上調(diào)MHC I類和/或II類抗原表達(dá)的化合物，其在一些實(shí)施方案中可允許結(jié)合MHC受體的試劑更有效地工作。由于可使任何細(xì)胞類型表達(dá)MHC I類和/或II類抗原，這可提供一種用于反分化各種細(xì)胞類型的方法，無(wú)論它們是否組成型表達(dá)I類和/或II類MHC抗原。定型細(xì)胞通常與試劑一起溫育至少兩個(gè)小時(shí)，典型地2-24小時(shí)，優(yōu)選2-12小時(shí)。溫育典型地在約室溫或例如約22°C直至約37°C包括33°C下進(jìn)行。反分化程序的進(jìn)展可以通過(guò)移出樣品的小等分試樣并使用顯微術(shù)和/或流式細(xì)胞術(shù)檢查細(xì)胞進(jìn)行定期檢查?？蛇x地，裝置可以包含在線監(jiān)測(cè)反分化程序進(jìn)展的追蹤元件。除了利用反分化試劑之外，定型細(xì)胞可以在自體血漿或血清中或在胎血清或馬血清中培養(yǎng)。任選地，定型細(xì)胞可以用抗凝劑、螯合劑或抗生素培養(yǎng)。用于溫育細(xì)胞的溫度可以延伸至18-40°C，并且還可包括4-10 % 0)2和/或10-35 % 02。此外，溫育可在涂層或無(wú)涂層的血液袋、組織培養(yǎng)袋或塑料容器中發(fā)生。一些類型的反分化細(xì)胞可以通過(guò)使用特定培養(yǎng)條件進(jìn)行反分化而獲得。例如，通過(guò)在達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺(L_glu)和β-巰基乙醇(2βΜΕ)中連同反分化試劑培養(yǎng)定型細(xì)胞，定型細(xì)胞可以反分化成多能細(xì)胞。 定型細(xì)胞也可最初暴露于螯合劑。作為另一個(gè)實(shí)例，為獲得間充質(zhì)細(xì)胞，可以使用DMEM(低葡萄糖)和L-glu，或者DMEM (低葡萄糖)、L-glu、2 β ME和NEAA，結(jié)合反分化試劑培養(yǎng)定型細(xì)胞。此外，抗生素慶大霉素也可用于細(xì)胞培養(yǎng)。轉(zhuǎn)分化細(xì)胞
通過(guò)用組織培養(yǎng)基結(jié)合反分化試劑培養(yǎng)定型細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)分化細(xì)胞。定型細(xì)胞由此經(jīng)歷轉(zhuǎn)分化，其中定型細(xì)胞轉(zhuǎn)化成另一個(gè)細(xì)胞類型的細(xì)胞；在一些實(shí)施方案中，定型細(xì)胞轉(zhuǎn)化成不同譜系的細(xì)胞。通過(guò)轉(zhuǎn)分化獲得的靶細(xì)胞的類型取決于培養(yǎng)條件。這些條件根據(jù)組織培養(yǎng)基的類型、各種分化促進(jìn)劑的存在/不存在、不同血清的存在/不存在、溫育溫度、氧或二氧化碳的存在/不存在、以及用于溫育的容器或器皿的類型而不同。
用于轉(zhuǎn)分化的組織培養(yǎng)基的實(shí)例包括但不限于Iscove改良達(dá)爾伯克氏培養(yǎng)基(MDM)、達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、伊格爾極限必需(EME)培養(yǎng)基、α -極限必需培養(yǎng)基(a-MEM)、Roswell Park Memorial Institute (RPMI ;開發(fā)培養(yǎng)基的地點(diǎn))1640、Ham-F-12、E199、MCDB、Leibovitz L_15、Williams培養(yǎng)基E或任何商業(yè)上配制的組織培養(yǎng)基。分化促進(jìn)劑包括抗凝劑、螯合劑和抗生素。此類試劑的實(shí)例可以是下列的一種或多種維生素和礦物質(zhì)或其衍生物，諸如維生素A(視黃醇)、B3、C(抗壞血酸)、抗壞血酸2_磷酸酯、D2、D3、K、視黃酸、煙酰胺、鋅或鋅化合物、以及鈣或鈣化合物；天然或合成激素諸如氫化可的松和地塞米松；氨基酸或其衍生物，諸如L-谷氨酰胺(L-glu)、乙二醇四乙酸(EGTA)、脯氨酸和非必需氨基酸(NEAA);化合物或其衍生物，諸如巰基乙醇、二丁基環(huán)腺苷酸(db-cAMP)、一硫代甘油(MTG)、腐胺、二甲亞砜(DMSO)、次黃嘌呤、腺嘌呤、毛喉素、西洛酰胺和3-異丁基-I-甲基黃嘌呤；核苷和其類似物，諸如5-氮雜胞苷；酸或其鹽，諸如抗壞血酸、丙酮酸、岡田軟海綿酸(okadic acid)、亞油酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、抗凝劑朽1檬酸鹽右旋糖配方A(ACDA)、EDTA 二鈉、丁酸鈉和磷酸甘油；抗生素或藥物，諸如G418、慶大霉素、己酮可可豆堿(1-(5_氧代己基)-3，7-二甲基黃嘌呤)和吲哚美辛；和蛋白質(zhì)諸如組織纖溶酶原激活物(TPA)。這些分化促進(jìn)劑可用來(lái)獲得特定類型的靶細(xì)胞。例如，維生素B3可用來(lái)產(chǎn)生腺泡細(xì)胞諸如胰島細(xì)胞或氫化可的松、地塞米松可用來(lái)產(chǎn)生間質(zhì)來(lái)源或上皮來(lái)源的細(xì)胞(例如，腎上皮細(xì)胞、皮膚和伴生構(gòu)造諸如真皮乳頭細(xì)胞)；以及巰基乙醇可用來(lái)產(chǎn)生外胚層細(xì)胞諸如神經(jīng)細(xì)胞，包括CNS的輔助細(xì)胞。培養(yǎng)基可包含自體血漿；血小板；血清諸如胎血樣；或哺乳動(dòng)物來(lái)源的血清諸如馬血清。此外，轉(zhuǎn)化過(guò)程可以在血液袋、支架、組織培養(yǎng)袋、或塑料組織培養(yǎng)容器內(nèi)部發(fā)生。組織培養(yǎng)容器可以是粘附或非粘附型組織培養(yǎng)容器，或可以包被或未包被試劑諸如明膠、膠原、基質(zhì)膠(matrigel)或胞外基質(zhì)，其促進(jìn)粘附或漂浮，這取決于待制備的組織或特化細(xì)胞的要求類型。另外的培養(yǎng)條件包括溫度，其可以是約10-約60°C、或約18-約40°C;二氧化碳水平(CO2)，其可以是約O-約20%或約4-約10% ;和氧(O2)，其可以是約O-約50%或約10-約35 %。獲得靶細(xì)胞并結(jié)合反分化試劑使用的方法的實(shí)例在表I中論述。表I.結(jié)合反分化試劑獲得各種類型的靶細(xì)胞的方法
權(quán)利要求
1.一種在患者中補(bǔ)充一種細(xì)胞譜系的組織或細(xì)胞的方法，包括(i)獲得第一細(xì)胞譜系的定型細(xì)胞；(ii)使所述定型細(xì)胞重編程序以獲得重編程序的細(xì)胞，和(iii)將所述重編程序的細(xì)胞施用至所述患者。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述患者遭受選自下列的疾病或紊亂骨髓衰竭、血液學(xué)病癥、再生障礙性貧血、3地中海貧血、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、帕金森病、脊髓損傷、肌營(yíng)養(yǎng)不良、腎疾病、多發(fā)性硬化、充血性心力衰竭、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、頭部創(chuàng)傷、脊髓損傷、肺疾病、抑郁癥、非梗阻性無(wú)精子癥、男性更年期、絕經(jīng)期和不育癥、復(fù)壯、硬皮病性潰瘍、銀屑病、皺紋、肝硬化、自身免疫病、脫發(fā)、色素性視網(wǎng)膜炎、晶狀變性/失明、糖尿病、肝硬化和不育癥。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述重編程序的細(xì)胞選自多能干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)胚層和神經(jīng)外胚層干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、胚外的胚胎干細(xì)胞、腎細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、肺泡內(nèi)胚層細(xì)胞、神經(jīng)元、外胚層細(xì)胞、胰島細(xì)胞、腺泡細(xì)胞、卵母細(xì)胞、精子、肝細(xì)胞、角化細(xì)胞、黑素細(xì)胞、骨細(xì)胞、真皮乳頭細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞。
4.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述定型細(xì)胞從全血、骨髓、神經(jīng)組織、肌肉組織、表皮或真皮獲得。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述定型細(xì)胞從全血獲得。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述定型細(xì)胞通過(guò)單采血液成分術(shù)獲得。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述定型細(xì)胞從動(dòng)員或未動(dòng)員的血液獲得。
8.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述定型細(xì)胞選自T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅血球、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞。
9.權(quán)利要求I所述的方法，其中重編程序包括所述定型細(xì)胞的反分化、轉(zhuǎn)分化、再分化或其組合。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述重編程序包括所述定型細(xì)胞的反分化以獲得反分化細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中通過(guò)將所述定型細(xì)胞與試劑接觸而使所述定型細(xì)胞反分化。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述定型細(xì)胞用所述試劑溫育。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述試劑與受體接合，所述受體在所述定型細(xì)胞的表面上調(diào)節(jié)抗原的捕獲、識(shí)別或呈遞。
14.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述受體是MHCI類抗原或MHC II類抗原。
15.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述試劑是所述受體的抗體。
16.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述試劑是所述受體的單克隆抗體。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述抗體選自單克隆抗體CR3/43和單克隆抗體TAL1B5。
18.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述反分化細(xì)胞通過(guò)注射或植入而施用。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述反分化細(xì)胞通過(guò)腸胃外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)皮注射或注射入脊髓液而施用。
20.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述重編程序包括所述定型細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化以獲得轉(zhuǎn)分化細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中通過(guò)將所述定型細(xì)胞在包含一種或多種反分化試劑和一種或多種分化促進(jìn)劑的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)而使所述定型細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述組織培養(yǎng)基選自Iscove改良達(dá)爾伯克氏培養(yǎng)基(MDM)、達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、伊格爾極限必需(EME)培養(yǎng)基、a -極限必需培養(yǎng)基(a-MEM)、Roswell Park Memorial Institute (RPMI ;開發(fā)培養(yǎng)基的地點(diǎn))1640、Ham-F-12、E199、MCDB、Leibovitz L-15、和Williams培養(yǎng)基E或任何商業(yè)上可得的培養(yǎng)基。
23.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述分化促進(jìn)劑是抗凝劑、螯合劑或抗生素。
24.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述分化促進(jìn)劑是維生素、礦物質(zhì)或其衍生物。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述維生素、礦物質(zhì)或其衍生物選自維生素A、維生素B3、維生素C、維生素D3、維生素K、視黃酸、煙酰胺、鋅或鋅化合物、和鈣或鈣化合物。
26.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述分化促進(jìn)劑是天然或合成激素。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述天然或合成激素是氫化可的松或地塞米松。
28.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述分化促進(jìn)劑是氨基酸或其衍生物。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述氨基酸或其衍生物選自L-谷氨酰胺(L-glu)、麥角硫因(EGT)、脯氨酸和非必需氨基酸(NEAA)。
30.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述分化促進(jìn)劑是化學(xué)化合物或其衍生物。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述化學(xué)化合物或其衍生物選自3-巰基乙醇、二丁基環(huán)腺苷酸(db-cAMP)、一硫代甘油(MTG)、腐胺、二甲亞砜(DMS0)、次黃嘌呤、腺嘌呤、毛喉素、西洛酰胺和3-異丁基-I-甲基黃嘌呤。
32.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述分化促進(jìn)劑是核苷或其類似物。
33.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述核苷或其類似物是5-氮雜胞苷。
34.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述分化促進(jìn)劑是酸或其鹽。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述酸或其鹽選自抗壞血酸、丙酮酸、網(wǎng)田軟海綿酸、亞油酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA 二鈉、乙二醇四乙酸(EGTA)、抗凝劑檸檬酸鹽右旋糖配方A (ACDA)、丁酸鈉和磷酸甘油。
36.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述分化促進(jìn)劑是抗生素或藥物。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述抗生素或藥物選自G418、慶大霉素、己酮可可豆堿(1-(5-氧代己基)_3，7-二甲基黃嘌呤)和吲哚美辛。
38.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述分化促進(jìn)劑是蛋白質(zhì)。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是組織纖溶酶原激活物(TPA)。
40.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述組織培養(yǎng)基包含自體血漿；血小板；血清；或哺乳動(dòng)物來(lái)源的血清。
41.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞在血液袋、支架、組織培養(yǎng)袋、或塑料組織培養(yǎng)容器內(nèi)培養(yǎng)。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述組織培養(yǎng)容器是粘附型或非粘附型組織培養(yǎng)容器。
43.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述組織培養(yǎng)容器是包被或未包被的。
44.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述組織培養(yǎng)容器用選自明膠、膠原、基質(zhì)膠或胞外基質(zhì)的試劑包被。
45.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞在約18-約40°C的溫度培養(yǎng)。
46.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞在約4%-約10%的二氧化碳水平培養(yǎng)。
47.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞在約10%-約35%的氧水平培養(yǎng)。
48.—種在需要的患者中治療疾病或組織損傷的方法,包括(i)獲得定型細(xì)胞；(ii)使所述定型細(xì)胞重編程序以獲得重編程序的靶細(xì)胞，和(iii)將所述重編程序的靶細(xì)胞施用至所述患者。
49.權(quán)利要求1-48任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶細(xì)胞以藥物組合物施用。
50.權(quán)利要求49的藥物組合物。
51.—種或多種重編程序的靶細(xì)胞在制備用于在患者中修復(fù)或補(bǔ)充一種細(xì)胞譜系的組織或細(xì)胞或用于治療疾病或組織損傷的藥物或藥物組合物中的用途。
52.一種獲得用于施用至需要的患者的重編程序的靶細(xì)胞的方法，其中所述方法包括(i)獲得第一細(xì)胞譜系的定型細(xì)胞；和(ii)使所述定型細(xì)胞重編程序以獲得重編程序的靶細(xì)胞。
53.一種藥物組合物，其包含通過(guò)權(quán)利要求52所述的方法獲得的重編程序的靶細(xì)胞和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
54.一種制備用于施用至需要的患者的藥物或藥物組合物的方法，其中所述方法包括(i)獲得第一細(xì)胞譜系的定型細(xì)胞；(ii)使所述定型細(xì)胞重編程序以獲得重編程序的靶細(xì)胞jP(iii)任選地，組合所述重編程序的靶細(xì)胞與一種或多種藥物賦形劑。
55.一種通過(guò)權(quán)利要求54所述的方法制備的藥物組合物。
全文摘要
一種使用重編程序的細(xì)胞諸如反分化、轉(zhuǎn)分化或再分化細(xì)胞治療患者中的各種疾病、紊亂或病癥的方法。該方法包括從患者獲得定型細(xì)胞、反分化所述定型細(xì)胞以獲得反分化靶細(xì)胞、和將所述反分化細(xì)胞施用至所述患者。在一些實(shí)施方案中，該方法包括從患者獲得定型細(xì)胞、轉(zhuǎn)分化所述定型細(xì)胞以獲得轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞、和將所述轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞施用至所述患者。所述反分化或轉(zhuǎn)分化靶細(xì)胞修復(fù)或補(bǔ)充患者中的組織或細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61P17/02GK102647989SQ200980163043
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日
發(fā)明者I.M.S.S.阿布爾賈達(dá)耶爾 申請(qǐng)人:特里施泰姆貿(mào)易(塞浦路斯)有限公司