專利名稱：存活蛋白mRNA的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用了核酸擴(kuò)增方法的簡便、迅速的存活蛋白mRNA的測定方法。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明提供適合一定溫度(40 50°C，優(yōu)選43°C )下的存活蛋白mRNA的擴(kuò)增、檢測的寡核苷酸。本發(fā)明可用于分子生物學(xué)、生化學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等中的研究、診療。
背景技術(shù)：
凋亡是細(xì)胞能動地導(dǎo)致自己死亡的現(xiàn)象，也稱為程序性細(xì)胞死亡。已知人類這樣的多細(xì)胞生物其體細(xì)胞由于病毒導(dǎo)致的感染、癌化等，而不斷地產(chǎn)生不利于生命維持的細(xì)胞。除去這種細(xì)胞的系統(tǒng)是凋亡。除此之外，在發(fā)生的過程中，凋亡起到生命中不可缺少的作用。從昆蟲到人類，凋亡以共通的機(jī)制發(fā)揮作用，其中已知胱天蛋白酶(caspase)是關(guān)鍵酶。抑制胱天蛋白酶、并抑制凋亡的物質(zhì)是凋亡抑制因子(IAP)蛋白質(zhì)。典型的IAP蛋白質(zhì)具有所謂的作為與蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的WR結(jié)構(gòu)域、和作為一種鋅指結(jié)構(gòu)域的環(huán)指域的結(jié)構(gòu)。近年，作為存活蛋白(survivin)已知的蛋白質(zhì)被鑒定為凋亡抑制因子(IAP)基因家族的一員。存活蛋白代替單一的BIR結(jié)構(gòu)域和環(huán)指具有卷曲螺旋區(qū)域，與已知的IAP家族成員相比結(jié)構(gòu)特異。作為存活蛋白的臨床學(xué)上的重要性之一，報告了與其它的作為凋亡調(diào)節(jié)因子的 Bcl-2、其它的IAP家族成員不同，在正常人體組織中幾乎檢測不到其表達(dá)，而在一般的人體的癌組織(肺、胰臟、大腸、膀胱、胸部、前列腺、胃、肝臟等)、非霍奇金淋巴瘤、白血病中顯著地表達(dá)增加。這表示存活蛋白可以成為非常優(yōu)異的標(biāo)記基因。因此，認(rèn)為存活蛋白mRNA 的測定能夠廣泛地應(yīng)用于癌癥治療等中的凋亡控制的監(jiān)測、癌癥的早期診斷、癌癥的轉(zhuǎn)移診斷、癌癥的治療效果監(jiān)測等。一般性的癌癥的診斷是從病理學(xué)方面進(jìn)行，但為此要求病理醫(yī)生的高技術(shù)，并且根據(jù)使用的檢測體而存在漏診癌細(xì)胞的情況。近年，為了減少這樣的漏診、另外使各醫(yī)院能夠進(jìn)行統(tǒng)一的診斷，提出利用核酸擴(kuò)增方法的基因檢查，甚或一部分被實用化。已知利用核酸擴(kuò)增方法的基因檢查的靈敏度高，在進(jìn)行核酸擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，與該檢查的特異性高度相關(guān)的是所使用的癌標(biāo)記基因的種類。如上所述，存活蛋白在廣泛的癌癥、淋巴瘤、白血病中能看到其高表達(dá)，另一方面，在正常細(xì)胞中幾乎看不到其表達(dá)。因此，存活蛋白具有作為核酸擴(kuò)增方法中的優(yōu)異的癌標(biāo)記的特征。即，通過調(diào)查各種組織中的存活蛋白mRNA表達(dá)的有無，能夠發(fā)現(xiàn)癌、淋巴瘤、白血病等惡性疾病。已知癌可以從原發(fā)部位向其它部位發(fā)生轉(zhuǎn)移。即使是現(xiàn)在，轉(zhuǎn)移也是癌癥患者主要的死亡原因，與原發(fā)部位的診斷同樣，轉(zhuǎn)移診斷也非常重要。癌細(xì)胞從原發(fā)病灶部位放出到各種體液、血液、尿、淋巴液中。特別是如果放出到血液、淋巴液中，則隨著其流動而游遍全身，引起向多個部位轉(zhuǎn)移。由于這樣從原發(fā)部位放出的癌細(xì)胞一般為少數(shù)，因此檢測上述癌細(xì)胞需要高靈敏度的檢測方法。使用了核酸擴(kuò)增方法的檢測方法由于一般能夠進(jìn)行高靈敏度的檢測，因而適合上述癌細(xì)胞的檢測。即，可以說使用了核酸擴(kuò)增方法的存活蛋白mRNA 的檢測是在廣范圍的癌癥的轉(zhuǎn)移診斷中特別有用的檢查方法。
作為一個例子，在胃癌、大腸癌之類的消化道癌癥中，為了診斷腹膜轉(zhuǎn)移，用生理鹽水清洗腹腔，檢查該清洗液中有無癌細(xì)胞。如果胃癌等有發(fā)展，則癌細(xì)胞剝離到腹膜中， 在清洗水中確認(rèn)有癌細(xì)胞則為清洗細(xì)胞診斷陽性，表示不可能通過手術(shù)完全除去癌細(xì)胞。 該檢查通常用顯微鏡從病理學(xué)上進(jìn)行，但是不看漏癌細(xì)胞而將全部的細(xì)胞以目視來進(jìn)行確認(rèn)存在困難。另外，已知很多根據(jù)病理檢查的細(xì)胞診斷即使是陰性也成為腹膜轉(zhuǎn)移的病例， 認(rèn)為這是看漏了極少數(shù)的轉(zhuǎn)移細(xì)胞的結(jié)果。因此，希望出現(xiàn)高靈敏度地檢測清洗水中的癌細(xì)胞的方法。認(rèn)為使用了核酸擴(kuò)增方法的存活蛋白mRNA的檢測在胃癌、大腸癌等全部消化道癌癥中能夠高靈敏度地進(jìn)行腹膜轉(zhuǎn)移診斷。作為其它的例子，已知在膀胱癌中癌細(xì)胞剝離到尿中。懷疑是膀胱癌的情況下，一般進(jìn)行利用細(xì)胞診斷和膀胱鏡的檢查，但是前者存在如上所述的漏診的問題，后者由于是侵入性的檢查，所以存在患者負(fù)擔(dān)大的問題。因此，將尿中的細(xì)胞作為檢測體的存活蛋白 mRNA的測定可以說是彌補(bǔ)細(xì)胞診斷和膀胱鏡的缺點(diǎn)的檢查方法。另外，如果著眼于低侵入性方面，將血液作為檢測體的檢查也適用，但是使用了核酸擴(kuò)增方法的存活蛋白mRNA的檢測即便是血液檢測體也可以在廣泛的癌癥中以高靈敏度檢測癌細(xì)胞。另外作為其它的例子，癌細(xì)胞可能剝離到肺癌中的胸水中、肝癌中的腹水中。癌細(xì)胞剝離到這樣的體液中時，一般成為獲知癌癥進(jìn)程的基準(zhǔn)。通過使用了核酸擴(kuò)增方法的存活蛋白mRNA的檢測，能夠高靈敏度地檢測這樣的胸水、腹水中有無癌細(xì)胞。進(jìn)一步作為其它例子，存活蛋白mRNA的測定還可以適用于術(shù)中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷。現(xiàn)在，廣泛認(rèn)識了乳癌中的前哨淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移診斷的重要性，并且正在研究在以胃癌為代表的消化道癌癥中的適用。像這樣，認(rèn)為存活蛋白是從表達(dá)特性方面考慮非常有效的癌標(biāo)記基因，因此其適用范圍以及有用性高。一般，利用核酸擴(kuò)增方法檢測癌標(biāo)記基因mRNA時，使用RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)法作為核酸擴(kuò)增方法，并報告了對存活 ^ S mRNA iii iS M ( Mertines, A. et al. , American journal of Pathology, 164, 501-51(K2004)(非專利文獻(xiàn) 1) ；Zhen-ning, W. et al.，Chinese Medical Journal, 117, 1210-1217(2004)(非專利文獻(xiàn) 2)以及 Weikert，S. et al. , International Journal of Cancer, 116，100-104(2005)(非專利文獻(xiàn)3))。該擴(kuò)增方法從腫瘤組織提取RNA后，需要以下兩步工序(根據(jù)情況需要進(jìn)一步實施其它的檢測工序)(a)利用逆轉(zhuǎn)錄酶由提取的RNA合成cDNA的工序，以及(b)用PCR法擴(kuò)增該cDNA并檢測的工序。因此，暗示了操作的繁雜性、二次污染的危險性。另外，為了實施上述兩步的工序通常需要2小時以上，并存在實施多個工序?qū)е碌脑佻F(xiàn)性不良、多個檢測體處理、降低檢查成本方面的問題。進(jìn)而，由于還擔(dān)心利用PCR法的擴(kuò)增由于擴(kuò)增雙鏈DNA而擴(kuò)增混入的染色體DNA的可能性，因此為了嚴(yán)密地解析mRNA表達(dá)，需要進(jìn)行利用DNase等的消化來完全除去染色體DNA。因此，導(dǎo)致操作的更進(jìn)一步的繁雜化、再現(xiàn)性不良。而且，PCR法需要急劇升降反應(yīng)溫度，成為了自動化時的反應(yīng)裝置的省力化、低成本化的障礙。另一方面，作為以一定溫度僅擴(kuò)增RNA的方法，報告了 NASBA法(參照日本專利第沈50159號公報(專利文獻(xiàn)1)和日本專利第315四27號公報(專利文獻(xiàn)幻)、以及TMA法 (參照日本專利第3241717號公報(專利文獻(xiàn)3))等。上述RNA擴(kuò)增方法是進(jìn)行如下連鎖反應(yīng)的方法利用對作為靶的RNA含有啟動子序列的引物、逆轉(zhuǎn)錄酶以及根據(jù)需要的核糖核酸酶H (RNaseH)合成含有啟動子序列的雙鏈DNA，以該雙鏈DNA為模板并利用RNA聚合酶來生成含有來自靶RNA的特定堿基序列的RNA，該RNA繼而成為含有啟動子序列的雙鏈DNA 合成的模板。并且，RNA擴(kuò)增后，利用電泳或使用結(jié)合有可檢測標(biāo)記的核酸探針的雜交法等檢測擴(kuò)增的RNA。上述RNA擴(kuò)增方法由于以一定溫度、以一步操作僅擴(kuò)增RNA，所以適合簡便的RNA 測定，但是利用雜交法等的檢測需要繁雜的操作，因此存在不僅不適合多個檢測體處理、自動化，而且作為結(jié)果容易導(dǎo)致再現(xiàn)性不良、擴(kuò)增核酸的二次污染的問題。另外，到出結(jié)果為止，通常NASBA法、TMA法均需要90分鐘以上，不能迅速得到結(jié)果。而且，雖然擴(kuò)增工序以一定溫度進(jìn)行，但是通常在擴(kuò)增工序前需要預(yù)加熱(例如65°C )，成為了反應(yīng)裝置的省力化、 低成本化的課題。作為簡便地擴(kuò)增、測定RNA的方法，可以舉出Ishiguro等方法(參照日本特開 2000-14400 號公報(專利文獻(xiàn) 4)以及 Ishiguro, T. et al.，Analytical Biochemistry, 314，1247-1252 (2003)(非專利文獻(xiàn)4))。上述方法是在寡核苷酸探針存在下實施RNA擴(kuò)增方法，并測定熒光特性的變化，能夠以一定溫度、以一步操作且在密閉容器內(nèi)同時且迅速、簡便地實施RNA擴(kuò)增及測定，所述寡核苷酸探針設(shè)計成由插入性熒光色素標(biāo)記，并且若形成與靶核酸互補(bǔ)的雙鏈，則插入性熒光色素部分插入上述雙鏈部分而使熒光特性發(fā)生變化。作為更具體的一個方式，是包括以下步驟的方法對于存在于任意的RNA、且能夠從其它RNA中區(qū)別出該RNA的特定堿基序列，(1)使用與該特定堿基序列的3’末端側(cè)互補(bǔ)的DNA引物和RNA依賴性DNA聚合酶 (逆轉(zhuǎn)錄酶)，將RNA作為模板，生成與特定堿基序列互補(bǔ)的DNA，(2)對于通過(1)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)而產(chǎn)生的RNA-DNA雙鏈，使其與具有核糖核酸酶H 活性的酶作用，分解RNA，生成單鏈DNA，(3)使用與⑵中生成的單鏈DNA的3’末端互補(bǔ)，并且其自身在其5’末端具有 RNA聚合酶的啟動子序列的DNA引物、和DNA依賴性DNA聚合酶，合成含有上述啟動子序列的雙鏈DNA，(4)使(3)中生成的雙鏈DNA與RNA聚合酶作用生成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(特定堿基序列的 RNA)的方法。并且，由于(4)中生成的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是來自特定堿基序列的RNA，因此成為上述 (1)的反應(yīng)中的模板，與上述(1)的反應(yīng)中使用的DNA引物結(jié)合，進(jìn)行(1) (4)的反應(yīng)，從而引發(fā)RNA擴(kuò)增的連鎖反應(yīng)。該核酸擴(kuò)增方法的特征在于，不需要像PCR法那樣升降反應(yīng)液的溫度，另外不需要分成RNA的逆轉(zhuǎn)錄、和其后的DNA擴(kuò)增反應(yīng)而實施。進(jìn)而，使對擴(kuò)增的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能夠進(jìn)行特異性結(jié)合的、由插入性熒光色素標(biāo)記的寡核苷酸探針在反應(yīng)液中共存，從而擴(kuò)增特定堿基序列或與該序列互補(bǔ)的序列的同時，能夠檢測(監(jiān)測)該擴(kuò)增的狀態(tài)。因此，由于不需要像通常的RNA擴(kuò)增方法那樣進(jìn)行另外的雜交檢測等，所以能夠大幅度地縮短獲得結(jié)果的時間。但是，對于適合該核酸擴(kuò)增方法的存活蛋白mRNA擴(kuò)增用引物序列及其組合，檢測用的寡核苷酸探針序列還是未知。這是因為相比于需要在反應(yīng)開始時暫設(shè)為比反應(yīng)溫度更高的溫度、使成為靶的RNA的高級結(jié)構(gòu)變性的工序的PCR法、NASBA法、TMA法等核酸擴(kuò)增方法，該核酸擴(kuò)增方法在一定的比較低的溫度(40 50°C，優(yōu)選為43°C )條件下進(jìn)行mRNA的擴(kuò)增、檢測。即，已知一般mRNA之類的單鏈RNA容易形成高級結(jié)構(gòu)，認(rèn)為在該核酸擴(kuò)增方法這樣的反應(yīng)條件下，成為靶的mRNA形成高級結(jié)構(gòu)，從而抑制引物和探針的結(jié)合，因此，最適合的引物和探針需要設(shè)計在高級結(jié)構(gòu)自由區(qū)域。作為RNA高級結(jié)構(gòu)的指標(biāo)，可以由堿基序列利用2級結(jié)構(gòu)解析軟件計算、推定2級結(jié)構(gòu)，但是從計算上的2級結(jié)構(gòu)推定實際的高級結(jié)構(gòu)是極其困難的。另外，像該核酸擴(kuò)增方法這樣在比較低的溫度實施核酸擴(kuò)增時，與在高溫實施的 PCR法相比較，容易生成被稱為引物二聚體的非特異性產(chǎn)物，為了減少非特異性產(chǎn)物的生成，需要嚴(yán)密地選定引物的組合。但是一般使用的引物的設(shè)計方法由于以包括在高溫下進(jìn)行變性的工序(PCR法)為前提，以已知的引物設(shè)計技術(shù)難以設(shè)計適合該核酸擴(kuò)增方法的引物。因此，為了實現(xiàn)利用上述一定溫度RNA擴(kuò)增·測定方法的迅速、簡便、且高靈敏度的存活蛋白mRNA的測定，需要即便是在一定的比較低的溫度(40 50°C，優(yōu)選為43°C )條件下結(jié)合效率也不降低、且能夠進(jìn)行存活蛋白mRNA的擴(kuò)增、檢測的寡核苷酸及其組合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供對由人體細(xì)胞、組織等得到的試樣，以一定溫度、一步操作迅速測定存活蛋白mRNA的方法。本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述課題而進(jìn)行深入研究的結(jié)果，構(gòu)筑了特異性地且迅速地測定存活蛋白mRNA的方法。第一發(fā)明是一種試樣中的存活蛋白mRNA的測定方法，其特征在于，上述測定方法使用了第一引物和第二引物，所述第一引物具有與存活蛋白mRNA 中的特定堿基序列的一部分相同的序列，所述第二引物具有與特定堿基序列的一部分互補(bǔ)的序列，其中，第一引物或第二引物中的任意一方是其5’末端添加有RNA聚合酶的啟動子序列的引物，并包括下述工序(1)以RNA為模板，利用具有RNA依賴性DNA聚合酶活性的酶合成與上述特定堿基序列互補(bǔ)的cDNA的工序；(2)利用具有核糖核酸酶H(RNaseH)活性的酶，分解上述(1)的反應(yīng)中得到的 RNA-DNA雙鏈的RNA的工序(單鏈DNA的生成)；(3)以上述單鏈DNA為模板，利用具有DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶，生成具有啟動子序列的雙鏈DNA的工序，所述啟動子序列能夠轉(zhuǎn)錄上述特定堿基序列、或與上述特定堿基序列互補(bǔ)的序列的RNA ；(4)利用具有RNA聚合酶活性的酶，以上述雙鏈DNA為模板生成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的工序；(5)通過該RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物成為上述(1)的反應(yīng)中的cDNA合成的模板，從而連鎖性地生成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的工序；以及(6)測定上述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的工序；并且，上述第一引物和第二引物為以下的任一種(i)上述第一引物是由序列號1所示的堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，上述第二引物是由序列號3所示的堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，(ii)上述第一引物是由序列號2所示的堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，上述第二引物是由序列號4所示的堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸。
第二發(fā)明是根據(jù)第一發(fā)明所述的存活蛋白mRNA的測定方法，其特征在于，上述第一引物和第二引物為以下的任一種的測定方法(i)上述第一引物是由序列號12或13所示的堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，上述第二引物是由序列號19 22所示的任一堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，(ii)上述第一引物是由序列號14 18所示的任一堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，上述第二引物是由序列號20 25所示的任一堿基序列中的至少15 個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸。第三發(fā)明是根據(jù)第一發(fā)明或第二發(fā)明所述的存活蛋白mRNA的測定方法，其特征在于，上述(6)的工序(測定RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的工序)是通過在熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針共存下測定上述熒光特性的變化而進(jìn)行的，上述熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針設(shè)計成若形成與靶RNA互補(bǔ)的雙鏈則熒光特性發(fā)生變化。第四發(fā)明是根據(jù)第三發(fā)明所述的測定方法，其特征在于，上述熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針是介由連接子結(jié)合有插入性熒光色素的插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針。第五發(fā)明是根據(jù)第四發(fā)明所述的測定方法，其特征在于，上述插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針含有由序列號28 31所示的任一堿基序列中、或其互補(bǔ)序列中的至少15 個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸。第六發(fā)明是根據(jù)第一發(fā)明至第五發(fā)明所述的存活蛋白mRNA的測定方法，其特征在于，在上述(1)的工序(以RNA為模板，利用具有RNA依賴性DNA聚合酶活性的酶合成與上述特定堿基序列互補(bǔ)的cDNA的工序)之前，進(jìn)行以下工序以存活蛋白mRNA中的特定堿基序列為模板，利用(i)剪切用寡核苷酸和(ii)具有核糖核酸酶H(RNase H)活性的酶，在上述特定堿基序列的5’末端部位剪切上述RNA;上述(i)剪切用寡核苷酸具有對上述特定堿基序列中的、與第一引物的相同區(qū)域的5’末端部位重復(fù)的區(qū)域以及從該部位在5’側(cè)鄰接的區(qū)域互補(bǔ)的序列。第七發(fā)明是根據(jù)第六發(fā)明所述的測定方法，其特征在于，上述剪切用寡核苷酸是由序列號5 11所示的任一堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸。第八發(fā)明是上述寡核苷酸，其特征在于，是用于特異性地擴(kuò)增或檢測存活蛋白 mRNA的寡核苷酸，含有由序列號1 4或序列號28 31所示的任一堿基序列中或其互補(bǔ)序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸。第九發(fā)明是一種存活蛋白mRNA的測定試劑，其特征在于，至少含有1種第八發(fā)明所述的寡核苷酸。


圖1是存活蛋白RNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(a)表1的寡核苷酸組合[7] ； (b)組合[15]；(c)組合[17] ； (d)組合[38]?？v軸是熒光強(qiáng)度比超過1.2的時間(檢測時間，分鐘)，橫軸是將用于測定的初期的標(biāo)準(zhǔn)RNA量(拷貝數(shù))用log表示的值。另外，記載有由各點(diǎn)求出的線性一次曲線的式以及R2的值。
具體實施例方式以下，詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明中的試樣是指含有RNA的核酸試樣。本發(fā)明通過將人體細(xì)胞、人體組織、體液、血液、尿、便、淋巴液、乳管液、或腹腔、胸腔的清洗液、胸腔的清洗液等作為材料，并使用基于例如日本特開平7-59572號等記載的核酸提取方法制備的試樣，直接測定該試樣，從而進(jìn)行作為該試樣的來源的人體細(xì)胞、組織等中所含有的存活蛋白mRNA的測定。本發(fā)明中的特定堿基序列是指存活蛋白mRNA中與從與第一引物相同區(qū)域的5’末端開始至與第二引物互補(bǔ)區(qū)域的3’末端為止的堿基序列相同的RNA或DNA的堿基序列。 即，在存活蛋白mRNA上，第一引物與特定堿基序列的5’末端至3’方向的至少15個連續(xù)堿基以上相同，第二引物與特定堿基序列的3’末端至5’方向的至少15個連續(xù)堿基以上互補(bǔ)。 因此，在本發(fā)明中來自上述特定堿基序列的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能夠擴(kuò)增。本發(fā)明中的與第一引物相同區(qū)域的5’末端部位是指由在特定堿基序列內(nèi)含有該相同區(qū)域的5’末端的部分序列構(gòu)成，且該部位是與剪切用寡核苷酸互補(bǔ)區(qū)域和與第一引物相同區(qū)域重復(fù)的部位。就本發(fā)明中的啟動子而言，已知在與RNA聚合酶結(jié)合而開始轉(zhuǎn)錄的部位對各種 RNA聚合酶具有特異性的啟動子序列，在本發(fā)明的使用中沒有特別的限定，但優(yōu)選分子生物學(xué)實驗等中通常使用的T7啟動子、SP6啟動子、T3啟動子。另外，上述序列還可含有與轉(zhuǎn)錄效率相關(guān)的附加序列。本發(fā)明中的互補(bǔ)序列是指在高嚴(yán)謹(jǐn)條件中能夠?qū)Τ蔀閷ο蟮膲A基序列進(jìn)行雜交的序列。作為高嚴(yán)謹(jǐn)條件的一個例子，可以舉出本發(fā)明的實施例所述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液組成。另外，本發(fā)明中的相同的序列是指在高嚴(yán)謹(jǐn)條件中能夠?qū)Τ蔀閷ο蟮膲A基序列的完全互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交的序列。因此，本發(fā)明中所述的互補(bǔ)的或相同的序列只要是高嚴(yán)謹(jǐn)條件中在對雜交的特異性和效率不造成影響的范圍內(nèi)就可以任意設(shè)定長度等，這是不言而喻的。進(jìn)而，在對雜交的特異性和效率不造成影響的范圍，可以使用進(jìn)行了 1 數(shù)堿基的取代、缺失、插入的堿基序列。本發(fā)明中的核苷酸或核酸是指由天然存在的堿基、糖和糖之間鍵合構(gòu)成的核苷酸或核苷(包括RNA和DNA雙方)，是包括其低聚物(寡核苷酸，例如2 100堿基程度)以及多聚物(多核苷酸，例如100堿基以上)的總稱。本發(fā)明中的核苷酸或核酸還包括起到相同功能的不是天然存在的單體，用熒光分子等、放射性同位素標(biāo)記的單體，或含有它們的低聚物或多聚物。本發(fā)明中的引物是指在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中與模板雜交，用于引發(fā)核酸擴(kuò)增反應(yīng)所必需的核苷酸，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中將擴(kuò)增進(jìn)行如下設(shè)計基于所需要的模板，與該模板雜交， 并通過所謂的PCR法、LAMP法、ICAN法、NASBA法、TMA法、3SR法、TRC法(參照專利文獻(xiàn)4 和非專利文獻(xiàn)4)之類的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，能夠得到鏈長或在序列中特異性的生成物，優(yōu)選引物自身含有該模板中特異性的序列。引物的長度被設(shè)計成具有通常為15 100堿基、優(yōu)選15 35堿基的鏈長，但是不限于該鏈長。因此，本發(fā)明的第一引物和第二引物可以在本發(fā)明記載的堿基序列的范圍內(nèi)，在至少15個連續(xù)堿基以上的任意序列中選定。即，用于本發(fā)明中的存活蛋白mRNA檢測的第一引物和第二引物是(i)第一引物是對于與存活蛋白mRNA的一部分相同的序列號1記載的序列相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，第二引物是對于與存活蛋白mRNA的一部分互補(bǔ)的序列號3所述的序列相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，或(ii)第一引物是對于與存活蛋白mRNA的一部分相同的序列號2中記載的序列相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，第二引物是對于與存活蛋白mRNA的一部分互補(bǔ)的序列號4記載的序列相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸。應(yīng)予說明，(ii)的情況下，由于序列號2的3’末端側(cè)與序列號4的3’末端側(cè)重復(fù)，因此第一引物與第二引物需要設(shè)計成第一引物的3’末端與第二引物的3’末端至少相隔15堿基以上的位置。本發(fā)明中的用于檢測存活蛋白mRNA的第一引物和第二引物的更優(yōu)選的方式是(i)第一引物是對于與存活蛋白mRNA的一部分相同的的序列號12或13記載的序列相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，第二引物是對于與存活蛋白mRNA 的一部分互補(bǔ)的序列號19 22記載的任一序列相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，或(ii)第一引物是對于與存活蛋白mRNA的一部分相同的序列號14 18記載的任一序列相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，第二引物是對于與存活蛋白 mRNA的一部分互補(bǔ)的序列號20 25記載的任一序列相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸。作為本發(fā)明中的用于檢測存活蛋白mRNA的第一引物和第二引物的優(yōu)選方式，可以舉出(i)第一引物是選自序列號12或13記載的序列中的一種寡核苷酸，第二引物是選自序列號19 22記載的序列中的一種寡核苷酸，或(ii)第一引物是選自序列號14 18記載的序列中的一種寡核苷酸，第二引物是選自序列號20 25記載的序列中的一種寡核苷酸。進(jìn)一步，作為本發(fā)明的一個方式，存活蛋白mRNA在成為cDNA合成的模板之前在該 RNA內(nèi)的特定核酸序列的上述5’末端部位被剪切。通過在特定核酸序列的5’末端部位被剪切，在cDNA合成后，可以通過延伸上述cDNA的3，末端來有效地合成與cDNA雜交的第一引物的啟動子序列互補(bǔ)的DNA鏈，結(jié)果形成功能性的雙鏈DNA啟動子結(jié)構(gòu)。作為這樣的剪切方法，可以舉出如下方法將通過添加與存活蛋白mRNA內(nèi)的特定堿基序列的5’末端部位(含有該特定堿基序列內(nèi)的5’末端部位的部分序列)重復(fù)、并且對于向5’方向鄰接的區(qū)域具有互補(bǔ)序列的寡核苷酸(以下稱為剪切用寡核苷酸)而形成的RNA-DNA雙鏈的RNA 部分利用具有核糖核酸酶H(RNaseH)活性的酶等來進(jìn)行剪切的方法。該剪切用寡核苷酸的 3’末端的羥基是為了防止延伸反應(yīng)而進(jìn)行了適當(dāng)修飾的羥基，優(yōu)選使用例如進(jìn)行了氨基化等的羥基。在本發(fā)明的優(yōu)選的一個方式中，作為剪切用寡核苷酸，可以舉出對于與存活蛋白 mRNA的一部分互補(bǔ)的序列號5 11記載的序列相同的序列構(gòu)成的寡核苷酸。
本發(fā)明中的靶RNA是指在RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的特定堿基序列中，與上述引物相同或互補(bǔ)的區(qū)域以外的序列，具有能夠與插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針互補(bǔ)性地結(jié)合的序列。因此，插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針成為與本發(fā)明中的特定堿基序列的一部分互補(bǔ)的、或相同的序列。作為本發(fā)明的一個方式，作為插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針，可以舉出含有對于與存活蛋白mRNA的一部分互補(bǔ)的序列號觀 31相同的、或互補(bǔ)的序列中的至少15個堿基構(gòu)成的寡核苷酸的探針。作為本發(fā)明中的用于存活蛋白mRNA檢測的寡核苷酸的組合的一個方式，可以舉出(i)剪切用寡核苷酸是由與序列號5或6分別相同的序列構(gòu)成的寡核苷酸，第一引物是由與序列號1記載的序列相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸(應(yīng)予說明，第一引物在其5’末端具有啟動子序列，并且特定核酸序列中的與該引物相同區(qū)域的 5’末端部位與序列號5或6的互補(bǔ)區(qū)域重復(fù))，第二引物是與序列號3相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基的寡核苷酸，插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針是含有由與序列號觀或 29相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸的探針、或(ii)剪切用寡核苷酸是由與序列號7 11分別相同的序列構(gòu)成的寡核苷酸，第一引物是由與序列號2記載的序列相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸(應(yīng)予說明，第一引物在其5’末端具有啟動子序列，并且特定核酸序列中的與該引物相同區(qū)域的5’末端部位與序列號7 11中的任一的互補(bǔ)區(qū)域重復(fù))，第二引物是與序列號4相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基的寡核苷酸，插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針是含有由與序列號四 31相同的序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸的探針。作為在本發(fā)明中用于存活蛋白mRNA檢測的寡核苷酸組合的更優(yōu)選方式，可以舉出(i)剪切用寡核苷酸是由序列號5構(gòu)成的寡核苷酸，第一引物是由序列號12構(gòu)成的寡核苷酸(應(yīng)予說明，第一引物在其5’末端具有啟動子序列)，第二引物是選自序列號 19 22中的一種的寡核苷酸，插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針是由序列號觀或四構(gòu)成的寡核苷酸；(ii)剪切用寡核苷酸是由序列號6構(gòu)成的寡核苷酸，第一引物是由序列號13構(gòu)成的寡核苷酸(應(yīng)予說明，第一引物在其5’末端具有啟動子序列)，第二引物是選自序列號19 22中的一種寡核苷酸，插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針是由序列號觀或四構(gòu)成的寡核苷酸；(iii)剪切用寡核苷酸是由序列號7構(gòu)成的寡核苷酸，第一引物是由序列號14構(gòu)成的寡核苷酸(應(yīng)予說明，第一引物在其5’末端具有啟動子序列)，第二引物是選自序列號 20 25中的一種寡核苷酸，插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針是選自序列號四 31中的一種寡核苷酸；(iv)剪切用寡核苷酸是由序列號8構(gòu)成的寡核苷酸，第一引物是由序列號15構(gòu)成的寡核苷酸(應(yīng)予說明，第一引物在其5’末端具有啟動子序列)，第二引物是選自序列號 20 25中的一種寡核苷酸，插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針是選自序列號四 31中的一種寡核苷酸；(ν)剪切用寡核苷酸是由序列號9構(gòu)成的寡核苷酸，第一引物是由序列號16構(gòu)成的寡核苷酸(應(yīng)予說明，第一引物在其5’末端具有啟動子序列)，第二引物是選自序列號 20 25中的一種寡核苷酸，插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針是選自序列號四 31中的一種寡核苷酸；(vi)剪切用寡核苷酸是由序列號10構(gòu)成的寡核苷酸，第一引物是由序列號17構(gòu)成的寡核苷酸(應(yīng)予說明，第一引物在其5’末端具有啟動子序列)，第二引物是選自序列號23 25中的一種寡核苷酸，插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針是由序列號30或31構(gòu)成的寡核苷酸；(vii)剪切用寡核苷酸是由序列號11構(gòu)成的寡核苷酸，第一引物是由序列號18構(gòu)成的寡核苷酸(應(yīng)予說明，第一引物在其5’末端具有啟動子序列)，第二引物是選自序列號23 25中的一種寡核苷酸，插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針是由序列號30或31構(gòu)成的寡核苷酸。在本發(fā)明的存活蛋白mRNA的測定方法中，需要各種酶(具有以單鏈RNA為模板的 RNA依賴DNA聚合酶活性的酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)、具有RNaseH活性的酶、具有以單鏈DNA為模板的DNA依賴DNA聚合酶活性的酶、以及具有RNA聚合酶活性的酶)。各種酶可以使用同時具有幾種活性的酶，也可以使用具有各種活性的多種酶。另外，不僅可以在具有以單鏈RNA為模板的RNA依賴DNA聚合酶活性、RNaseH活性、以及以單鏈DNA為模板的DNA依賴DNA聚合酶活性這三種活性的逆轉(zhuǎn)錄酶中添加具有RNA聚合酶活性的酶，而且可以根據(jù)需要進(jìn)一步添加具有RNaseH活性的酶。上述逆轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)選分子生物學(xué)實驗等中通用的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、 MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、或這些的衍生物，最優(yōu)選AMV逆轉(zhuǎn)錄酶及其衍生物。另外， 作為上述具有RNA聚合酶活性的酶，可以例示分子生物學(xué)實驗等中通用的來自噬菌體的T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、以及它們的衍生物。在本發(fā)明的一個方式中，在試樣中的存活蛋白mRNA中添加上述剪切用寡核苷酸， 通過上述逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性在上述特定堿基序列的5’末端部位剪切上述RNA。以被剪切的上述RNA為模板，在上述第一引物和第二引物的存在下實施利用上述逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，則第二引物與存活蛋白mRNA內(nèi)的特定堿基序列結(jié)合，利用上述逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA 依賴DNA聚合酶活性可以進(jìn)行cDNA合成。得到的RNA-DNA雙鏈通過利用上述逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNase H活性而RNA部分分解、解離，從而第一引物與上述cDNA結(jié)合。接著，利用上述逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA依賴DNA聚合酶活性生成來自特定堿基序列、并且在5’末端具有啟動子序列的雙鏈DNA。該雙鏈DNA在啟動子序列下游含有特定堿基序列，利用上述RNA聚合酶產(chǎn)生來自特定堿基序列的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。該RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物成為用于利用上述第一引物和第二引物合成上述雙鏈DNA的模板，一系列的反應(yīng)連鎖性地進(jìn)行，從而上述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物持續(xù)擴(kuò)增。為了進(jìn)行這樣的連鎖反應(yīng)，作為上述各種酶所必須的已知的要素，至少含有緩沖劑(例如Tris)、鎂鹽、鉀鹽、核苷-三磷酸、核糖核苷-三磷酸是不言而喻的。另外，作為用于調(diào)節(jié)反應(yīng)效率的添加劑，還可以添加二甲基亞砜(DMSO)、二硫蘇糖醇(DTT)、牛血清白蛋白(BSA)、糖等。例如，利用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶的情況下，優(yōu)選在35 65°C的范圍設(shè)定反應(yīng)溫度，特別優(yōu)選在40 50°C的范圍進(jìn)行設(shè)定。上述RNA擴(kuò)增工序在一定溫度進(jìn)行，可以將反應(yīng)溫度設(shè)定在逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶顯示活性的任意溫度。擴(kuò)增的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量可以通過已知的核酸測定方法來測定。作為上述測定方法，可以舉出利用了電泳、液相色譜的方法，利用以可檢測的標(biāo)記進(jìn)行了標(biāo)記的核酸探針的雜交法等。但是，由于這些操作工序多，并且將擴(kuò)增產(chǎn)物拿到體系外進(jìn)行分析，因此成為二次污染原因的擴(kuò)增產(chǎn)物飛散到環(huán)境中的危險性大。為了克服這些課題，優(yōu)選使用設(shè)計成通過與靶核酸互補(bǔ)結(jié)合而熒光特性發(fā)生變化的寡核苷酸探針。作為該寡核苷酸探針可以使用利用了被稱為分子信標(biāo)的FRET的已知的探針，但是從探針設(shè)計的容易性、探針合成的容易性考慮，作為更優(yōu)選的方法，可以舉出以下方法在寡核苷酸探針的存在下，實施上述核酸擴(kuò)增工序，測定熒光特性的變化，所述寡核苷酸探針被設(shè)計成由插入性熒光色素標(biāo)記、并且通過若形成與靶核酸互補(bǔ)的雙鏈，則插入性熒光色素部分插入到上述互補(bǔ)的雙鏈部分，從而熒光特性發(fā)生變化(參照專利文獻(xiàn)4和非專利文獻(xiàn)4)。作為上述插入性熒光色素，并無特別的限定，可以利用通用的0惡唑黃、噻唑橙、溴化乙錠、以及這些的衍生物等。作為上述熒光特性的變化，可以舉出熒光強(qiáng)度的變化。例如 ^惡唑黃的情況，已知通過插入到雙鏈DNA中，從而510nm的熒光(激發(fā)波長490nm)顯著增加。上述插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針是對于上述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的靶RNA互補(bǔ)的寡核苷酸，在末端、磷酸二酯部或堿基部分介由適當(dāng)?shù)倪B接子結(jié)合有插入性熒光色素，進(jìn)而， 以防止自3’末端的羥基的延伸為目的，該3’末端的羥基具有適當(dāng)修飾的結(jié)構(gòu)(參照專利文獻(xiàn)4和非專利文獻(xiàn)4)。對寡核苷酸的插入性熒光色素的標(biāo)記可以用已知的方法在寡核苷酸中導(dǎo)入官能團(tuán)，從而結(jié)合插入性熒光色素(參照專利文獻(xiàn)4和非專利文獻(xiàn)4)。另外，作為上述官能團(tuán)的導(dǎo)入方法，可以使用市售的Label-ON Reagents (Clontech公司制)等。作為本發(fā)明的一個方式，提供以下方法在試樣中添加至少含有5’末端具有T7啟動子序列(序列號34)的第一引物、第二引物、插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針、剪切用寡核苷酸、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶、緩沖劑、鎂鹽、鉀鹽、核苷-三磷酸、核糖核苷_三磷酸、二甲基亞砜(DMSO)的擴(kuò)增試劑，在反應(yīng)溫度35 65°C (優(yōu)選為40 50°C )的一定溫度下進(jìn)行反應(yīng)，并且經(jīng)時性地測定反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度。在上述方式中，由于經(jīng)時性地測定熒光強(qiáng)度，所以能夠在發(fā)現(xiàn)有意義的熒光增加的任意時間結(jié)束測定，并能夠?qū)⒑怂釘U(kuò)增和測定在通常20分鐘以內(nèi)結(jié)束。作為本發(fā)明的一個方式，測定上述試樣中的存活蛋白mRNA，通過比較得到的熒光強(qiáng)度比的信息、和測定已知濃度的存活蛋白RNA時的熒光強(qiáng)度比信息，能夠算出試樣中存在的特定堿基序列的量(成為對象的RNA拷貝數(shù))。特定堿基序列的檢測可以適用例如對進(jìn)行了一定時間上述反應(yīng)的反應(yīng)液使用對特定堿基序列互補(bǔ)地結(jié)合而得到的固定化以及標(biāo)記化探針的夾心法，但是如上所述，優(yōu)選使用與特定堿基序列特異性地結(jié)合的插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針的方法。另外，由于該探針不抑制上述RNA擴(kuò)增反應(yīng)，因此，特別優(yōu)選在其存在下實施上述特定核酸序列的擴(kuò)增，并監(jiān)測特定核酸序列的擴(kuò)增狀態(tài)的方法。另外，在插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針共存下進(jìn)行特定核酸序列的擴(kuò)增的情況下，為了使該探針部分不起到延伸反應(yīng)的引物的作用，優(yōu)選例如在其3’末端添加乙醇酸、生物素等。 并且，可以利用熒光檢測器測定在擴(kuò)增反應(yīng)中該插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針與特定核酸序列結(jié)合而發(fā)出的熒光信號，將從該譜圖得到的信息(例如熒光色素發(fā)出的熒光強(qiáng)度達(dá)到一定強(qiáng)度所需要的反應(yīng)時間等)與從已知量的標(biāo)準(zhǔn)RNA相關(guān)的譜圖得到的信息進(jìn)行比較，由此確認(rèn)特定核酸序列是否存在，或可以從擴(kuò)增的特定核酸序列的量(RNA拷貝數(shù))推定試樣中存在的特定核酸序列的量(成為對象的RNA拷貝數(shù))。另外，可以將上述測定試劑所含有的全部試樣封入單一容器這一點(diǎn)是應(yīng)該特別寫出的。即，只要實施將一定量的試樣分別注入相應(yīng)的單一容器的操作，此后就可以自動測定存活蛋白mRNA。為了例如能夠在外部測定熒光色素發(fā)出的信號，該容器只要至少其一部分由透明材料構(gòu)成即可，從防止污染方面考慮，特別優(yōu)選分別注入試樣后能夠密封的容器。上述方式的RNA擴(kuò)增、測定方法由于能夠以一步操作、在一定溫度下實施，可以說是比RT-PCR簡便且適合自動化的方法。根據(jù)本發(fā)明，使存活蛋白mRNA的高特異性、高靈敏度、迅速、簡便、一定溫度且一步的測定首次成為可能。在本發(fā)明中，在通過以試樣中的靶RNA(存活蛋白基因的mRNA)為基礎(chǔ)合成在5’末端具有DNA依賴性RNA聚合酶的啟動子區(qū)域的雙鏈DNA，并以上述DNA為模板生成大量的單鏈RNA，進(jìn)而，所生成的單鏈RNA量飛躍性地增大，以插入性熒光色素標(biāo)記的寡核苷酸探針與生成的單鏈RNA互補(bǔ)結(jié)合，從而測定熒光增加的工序中，通過解析熒光強(qiáng)度增加的過程， 能夠簡便、且迅速地確定初期RNA量。本發(fā)明的存活蛋白mRNA的測定方法的核酸擴(kuò)增以及測定時間在30分鐘以內(nèi)，這比利用作為現(xiàn)有技術(shù)的RT-PCR法(通常為2小時以上),NASBA 法(90分鐘以上)、以及TMA法(90分鐘以上)進(jìn)行測定更迅速。進(jìn)而，通過提供用于以一步操作擴(kuò)增、檢測存活蛋白基因的mRNA的寡核苷酸，即， 用于擴(kuò)增存活蛋白mRNA的寡核苷酸、以及用于檢測存活蛋白mRNA的寡核苷酸，從而可以向生化學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)療領(lǐng)域提供利用該寡核苷酸的簡便、迅速且高靈敏度的存活蛋白 mRNA表達(dá)細(xì)胞的測定方法、以及測定試劑。實施例以下，通過實施例更具體地說明本發(fā)明，但這些只是例子，本發(fā)明不被這些實施例所限定。實施例1標(biāo)準(zhǔn)RNA的制備后述的實施例中使用的存活蛋白RNA(以后表示為標(biāo)準(zhǔn)RNA)按照(1) ⑵所示的方法實施。(1)克隆GenBank登記的存活蛋白的堿基序列(GenBank Accession Νο·ΝΜ_001012271，27Μ堿基)中第68 13 號的堿基(1261堿基)的雙鏈DNA。(2)以(1)中制備的雙鏈DNA為模板，實施體外轉(zhuǎn)錄，接著通過DNaseI處理完全消化該雙鏈DNA后，精制RNA來進(jìn)行制備。測定該RNA的^Onm下的吸光度來進(jìn)行定量。實施例2插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針的制備制作用插入性熒光色素標(biāo)記的寡核苷酸探針。在序列號觀記載的序列的5’末端起第11位的C、序列號四記載的序列的5’末端起第11位的G、序列號30記載的序列的5’ 末端起第11位的A、序列號31記載的序列的5’末端起第11位的A、序列號32記載的序列的5’末端起第11位的C、序列號33記載的序列的5’末端起第11位的A的位置分別使用 Label-ON Reagents (Clontech公司制)導(dǎo)入氨基，進(jìn)一步將3，末端用生物素進(jìn)行修飾。在上述氨基上標(biāo)記作為插入性熒光色素的〃惡唑黃，從而制備〃惡’唑黃標(biāo)記寡核苷酸探針(序列號 28 33)(參照 Ishiguro, T et al.，Nucleic Acids Res.，24，4992-4997 (1996)(非專利文獻(xiàn)5))。實施例3存活蛋白RNA的測定(其1)
使用表1所示的組合中的組合[1] [38]所示的第一引物、第二引物、插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針(以后表示為INAF探針)、剪切用寡核苷酸，以(1) (4)所示的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)RNA的測定。應(yīng)予說明，表1中的序列號12和13是序列號1的部分序列、序列號14 18是序列號2的部分序列、序列號19 22是序列號3的部分序列、序列號20 25是序列號4的部分序列。[表1]表 權(quán)利要求
1.一種試樣中的存活蛋白mRNA的測定方法，其特征在于，所述測定方法使用了第一引物和第二引物，所述第一引物具有與存活蛋白mRNA中的特定堿基序列的一部分相同的序列，所述第二引物具有與特定堿基序列的一部分互補(bǔ)的序列，其中，第一引物或第二引物的任意一方是其5’末端添加有RNA聚合酶的啟動子序列的引物，并且，所述測定方法包括下述工序(1)以RNA為模板，利用具有RNA依賴性DNA聚合酶活性的酶合成與特定堿基序列互補(bǔ)的cDNA的工序，(2)利用具有核糖核酸酶H(RNaseH)活性的酶，分解所述(1)的反應(yīng)中得到的RNA-DNA 雙鏈的RNA的工序，即，生成單鏈DNA，(3)以所述單鏈DNA為模板，利用具有DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶，生成具有啟動子序列的雙鏈DNA的工序，所述啟動子序列能夠轉(zhuǎn)錄所述特定堿基序列、或與所述特定堿基序列互補(bǔ)的序列的RNA，(4)利用具有RNA聚合酶活性的酶，以所述雙鏈DNA為模板生成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的工序，(5)通過該RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物成為所述(1)的反應(yīng)中的cDNA合成的模板，從而連鎖性地生成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的工序，以及(6)測定所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的工序；并且，所述第一引物和第二引物為以下的任一種(i)所述第一引物是由序列號1所示的堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，所述第二引物是由序列號3所示的堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，( )所述第一引物是由序列號2所示的堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，所述第二引物是由序列號4所示的堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的存活蛋白mRNA的測定方法，其中，所述第一引物和第二引物為以下的任一種(i)所述第一引物是由序列號12或13所示的堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，所述第二引物是由序列號19 22所示的任一堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，( )所述第一引物是由序列號14 18所示的任一堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸，所述第二引物是由序列號20 25所示的任一堿基序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的存活蛋白mRNA的測定方法，其中，所述(6)的工序，即， 測定RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的工序，是通過在熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針共存下測定所述熒光特性的變化而進(jìn)行的，所述熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針設(shè)計成若形成與靶RNA互補(bǔ)的雙鏈則熒光特性發(fā)生變化。
4.根據(jù)權(quán)利要3所述的測定方法，其中，所述熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針是介由連接子結(jié)合有插入性熒光色素的插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測定方法，其中，所述插入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針含有由序列號觀 31所示的任一堿基序列中、或其互補(bǔ)序列中的至少15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項所述的存活蛋白mRNA的測定方法，其中，在所述(1) 的工序之前，即，以RNA為模板，利用具有RNA依賴性DNA聚合酶活性的酶合成與特定堿基序列互補(bǔ)的cDNA的工序之前，進(jìn)行以下工序以存活蛋白mRNA中的特定堿基序列為模板， 利用(i)剪切用寡核苷酸和(ii)具有核糖核酸酶H(RNase H)活性的酶，在所述特定堿基序列的5’末端部位剪切所述RNA ；所述剪切用寡核苷酸具有對所述特定堿基序列中的、與第一引物的相同區(qū)域的5’末端部位重復(fù)的區(qū)域以及從該部位在5’側(cè)鄰接的區(qū)域互補(bǔ)的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測定方法，其中，所述剪切用寡核苷酸是由序列號5 11所示的任一堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸。
8.一種寡核苷酸，其特征在于，是用于特異性地擴(kuò)增或檢測存活蛋白mRNA的寡核苷酸，含有由序列號1 4或序列號觀 31所示的任一堿基序列中或其互補(bǔ)序列中的至少 15個連續(xù)堿基構(gòu)成的寡核苷酸。
9.一種存活蛋白mRNA的測定試劑，其特征在于，至少含有1種權(quán)利要求8所述的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種存活蛋白基因的mRNA的擴(kuò)增、檢測方法，該方法包括在RNA擴(kuò)增工序中，用寡核苷酸探針經(jīng)時性地測定擴(kuò)增的RNA產(chǎn)物量；所述寡核苷酸探針設(shè)計成若形成與擴(kuò)增的RNA互補(bǔ)的雙鏈則信號特性發(fā)生變化；所述RNA擴(kuò)增工序包括以下工序使用由具有與存活蛋白mRNA中的一部分相同的序列的第一引物、具有互補(bǔ)序列的第二引物(第一引物或第二引物的任意一方在其5′末端附加有啟動子序列)構(gòu)成的寡核苷酸的組合，利用逆轉(zhuǎn)錄酶，生成含有啟動子序列的雙鏈DNA，以該雙鏈DNA為模板，并利用RNA聚合酶生成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物繼而成為利用所述逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA合成的模板而生成所述雙鏈DNA。
文檔編號C12N15/09GK102171369SQ200980139729
公開日2011年8月31日 申請日期2009年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日
發(fā)明者大仲悟, 尾本大輔, 林俊典, 齊藤壽一 申請人:東曹株式會社