專利名稱：在樣品中檢測目標(biāo)核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
概括說來本發(fā)明涉及在樣品中檢測目標(biāo)核酸的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及使用熒光探針對在樣品中檢測目標(biāo)核酸的方法，該熒光探針對包括可以用于雜交測定和核酸擴(kuò)增反應(yīng)，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的熒光報道分子以及猝滅劑分子。
背景技術(shù)：
使用熒光探針監(jiān)測核酸擴(kuò)增反應(yīng)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法是本領(lǐng)域已知的。熒光探針的一個實(shí)例是如

圖1中描述的熒光雙標(biāo)記探針。這樣的熒光雙標(biāo)記探針一般由兩種不同染料，也就是報道分子和猝滅劑標(biāo)記的寡核苷酸組成，能與特定的目標(biāo)核酸序列雜交。報道分子是被光激發(fā)時能夠發(fā)射熒光的分子，而猝滅劑是能夠吸收報道分子發(fā)射的熒光的分子。有時候，報道分子位于寡核苷酸的5’末端而猝滅劑位于3’末端。對于這類熒光探針，當(dāng)探針與目標(biāo)核酸序列雜交或者它在PCR反應(yīng)期間斷裂時發(fā)射熒光。PCR 反應(yīng)的監(jiān)測基于當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)行時監(jiān)測熒光隨時間的強(qiáng)度。更具體地說，當(dāng)探針沒有與目標(biāo)核酸序列雜交時它呈無規(guī)卷曲構(gòu)象而報道分子在空間上足夠接近猝滅劑以致發(fā)生從報道分子到猝滅劑的FSrster型共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。在這種情況下，當(dāng)報道分子被適當(dāng)波長的光激發(fā)時，報道分子發(fā)射的熒光被猝滅劑“猝滅“而觀察到相對低的熒光強(qiáng)度。當(dāng)探針與目標(biāo)核酸序列雜交時，探針不再自身折疊，這樣報道分子和猝滅劑之間的距離增加。從而，F(xiàn)RET減少，報道分子發(fā)射的熒光較少地被猝滅劑猝滅而觀察到相對較高的熒光強(qiáng)度。如果在PCR的延伸階段期間探針被DNA聚合酶裂解，報道分子與探針隔斷，這樣在報道分子和猝滅劑之間沒有FRET發(fā)生。于是，熒光強(qiáng)度也相對較高。該過程在PCR反應(yīng)的每一循環(huán)中重復(fù)。由此監(jiān)測熒光強(qiáng)度的變化可以用來定量地監(jiān)測PCR反應(yīng)。有一些與熒光雙標(biāo)記探針的使用相關(guān)的缺陷。特別是，當(dāng)雙標(biāo)記探針用于使用非裂解DNA聚合酶的PCR過程時，熒光信號變化的大小僅僅由染料附著的DNA探針的長度和構(gòu)象控制。因?yàn)樵陔p標(biāo)記探針的情況下，染料附著于相同的DNA片段，它們能夠離開彼此的距離是有限的。熒光雙標(biāo)記探針的應(yīng)用可能被該狀況限制。通過使用雜交探針對，其中熒光染料在不同的寡核苷酸上，染料能夠彼此遠(yuǎn)離，因此增加了熒光變化并產(chǎn)生更大的信號動力學(xué)。如圖2中示意地描述的，在熒光雜交探針對中，第一寡核苷酸用熒光供體染料標(biāo)記而第二寡核苷酸用熒光受體染料標(biāo)記。第一和第二寡核苷酸設(shè)計(jì)成能與一條目標(biāo)核酸序列雜交以便當(dāng)兩種寡核苷酸都與目標(biāo)核酸序列雜交時供體和受體相鄰，或者接近。當(dāng)供體染料被光激發(fā)時，它通過FRET將其全部或部分能量轉(zhuǎn)移給受體。因此受體發(fā)射的光能夠被檢測。相對較高的熒光強(qiáng)度顯示探針與目標(biāo)核酸序列雜交。當(dāng)在PCR反應(yīng)的延伸階段期間探針被DNA聚合酶裂解時，供體和/或受體與探針隔斷并觀察到相對較低的熒光強(qiáng)度。熒光雜交探針對的缺陷是當(dāng)監(jiān)測受體染料的熒光時觀察到熒光供體染料的高熒光背景。由此需要使用熒光探針監(jiān)測PCR反應(yīng)的改進(jìn)的方法，其中排除了高熒光背景并且甚至獲得更大的信號動力學(xué)。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了一種滿足該需要的使用熒光探針監(jiān)測PCR反應(yīng)的方法。在第一方面中，本發(fā)明涉及一種在樣品中檢測目標(biāo)核酸的方法，包括
-在第一和第二寡核苷酸探針與所述目標(biāo)核酸選擇性雜交的條件下把所述樣品與基本上缺少5’-3’核酸酶活性的核酸聚合酶以及第一和第二寡核苷酸探針接觸，其中第一寡核苷酸探針包括熒光報道分子而第二寡核苷酸探針包括猝滅劑以便當(dāng)?shù)谝缓偷诙押塑账崽结樑c目標(biāo)核酸雜交時熒光報道分子的熒光被猝滅劑猝滅，以及當(dāng)?shù)谝缓偷诙押塑账釠]有與目標(biāo)核酸雜交時熒光報道分子的熒光不被猝滅劑猝滅， -用光源激發(fā)熒光報道分子，
-在第一和第二寡核苷酸探針與目標(biāo)核酸雜交的條件下監(jiān)測熒光報道分子的熒光，并將該熒光與在第一和第二寡核苷酸探針沒有與目標(biāo)核酸雜交的條件下獲得的熒光比較。在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種在樣品中檢測目標(biāo)核酸的試劑盒，包括一對 -包括熒光報道分子的第一寡核苷酸探針，
-包括猝滅劑的第二寡核苷酸探針，當(dāng)?shù)谝缓偷诙押塑账崽结樑c目標(biāo)核酸雜交時該猝滅劑有效猝滅熒光報道分子的熒光，和
-基本上缺少5’-3’核酸酶活性的核酸聚合酶。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種反應(yīng)混合物，包括 -樣品中的目標(biāo)核酸，
-基本上缺少5’-3’核酸酶活性的核酸聚合酶， -包括熒光報道分子的第一寡核苷酸探針，和
-包括猝滅劑的第二寡核苷酸探針，當(dāng)?shù)谝缓偷诙押塑账崽结樑c目標(biāo)核酸雜交時該猝滅劑有效猝滅熒光報道分子的熒光。附圖簡述
圖1是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的雙標(biāo)記探針的示意圖。圖2是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的包括包含熒光供體的第一寡核苷酸探針和包含受體的第二寡核苷酸探針的雜交探針對的示意圖。圖3是根據(jù)本發(fā)明的方法的包括包含熒光報道分子的第一寡核苷酸探針和包含猝滅劑的第二寡核苷酸探針的雜交探針對的示意圖。圖4(a_b)顯示由來自根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)包括熒光供體和受體的對照熒光探針的解鏈曲線(4-a)和解鏈峰(4-b)代表的熒光數(shù)據(jù)。圖5(a_b)顯示由根據(jù)本發(fā)明的方法的包括包含熒光報道分子的第一寡核苷酸探針和包含猝滅劑的第二寡核苷酸探針的探針對激發(fā)的解鏈曲線(5-a)和解鏈峰(5-b)代表的熒光數(shù)據(jù)。圖6顯示圖4(b)和5(b)的熒光數(shù)據(jù)的疊加。定義
對于便于本公開的理解，下列定義可能是有用的。如本文使用的，“樣品“指的是包含或推測包含核酸的任何物質(zhì)。這包括從單個或復(fù)數(shù)個個體分離的組織或液體樣品，包括但不限于，例如，皮膚、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、淚液、血細(xì)胞、器官、腫瘤，以及體外細(xì)胞培養(yǎng)組分樣品(包括但不限于由細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長的產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基、重組細(xì)胞和細(xì)胞組分)。如本文使用的，術(shù)語“核酸“、“多核苷酸“和“寡核苷酸“可互換地使用。這些術(shù)語僅僅涉及分子的一級結(jié)構(gòu)。因此，這些術(shù)語包括雙鏈和單鏈DNA，以及雙鏈和單鏈RNA。 寡核苷酸可以由與指定核苷酸序列的一個區(qū)域相應(yīng)的至少大約6個核苷酸的序列組成，例如至少大約10-12個核苷酸，或至少大約15-20個核苷酸。“相應(yīng)“表示與指定序列一致或互補(bǔ)。寡核苷酸不是必須實(shí)際上來源于任何存在的或天然的序列，而是可以以任何方式產(chǎn)生，包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、逆轉(zhuǎn)錄或其組合。術(shù)語“引物“指的是一條或一條以上引物，并且指的是當(dāng)置于催化與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物合成的條件下時能夠作為沿著互補(bǔ)鏈合成的起始點(diǎn)的寡核苷酸，無論天然存在的，如在純化的限制酶切消化中，或合成產(chǎn)生的。如本文使用的核酸序列的互補(bǔ)物指的是當(dāng)與核酸序列對準(zhǔn)以便一條序列的5 ’末端與另一條的3 ’末端配對時處于“反向平行結(jié)合"的寡核苷酸?；パa(bǔ)不需要是完美的； 穩(wěn)定的雙螺旋可以包含錯配堿基對或不匹配堿基。核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠考慮若干變量包括，例如，寡核苷酸的長度，堿基組成和寡核苷酸的序列，離子強(qiáng)度，以及錯配堿基對的發(fā)生率憑經(jīng)驗(yàn)確定雙螺旋穩(wěn)定性。如本文使用的，術(shù)語"目標(biāo)序列"、“目標(biāo)核酸“或"“目標(biāo)核酸序列"指的是要擴(kuò)增、檢測或它們兩者的寡核苷酸區(qū)域。目標(biāo)序列殘基位于用于擴(kuò)增的兩引物序列之間。如本文使用的，術(shù)語“探針“指的是由于探針中的至少一條序列與目標(biāo)區(qū)域中的序列的互補(bǔ)，與目標(biāo)核酸中的序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)的標(biāo)記的寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，探針不包含與用于起始聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的序列互補(bǔ)的序列。術(shù)語“探針對“指的是如上文描述的一對探針。如本文使用的術(shù)語“標(biāo)記“指的是可用于提供可檢測的(優(yōu)選可定量的)信號，并且能夠附著于核酸或蛋白質(zhì)的任何原子或分子。標(biāo)記可以提供可被熒光、放射性、比色法、 重量分析法、X射線衍射或吸收、磁性、酶活性等檢測的信號。術(shù)語“雜交的“和“雜交“指的是一條寡核苷酸與另一條寡核苷酸(一般是反向平行的多核苷酸)的堿基配對相互作用以致引起雙螺旋或其它更高級結(jié)構(gòu)，一般被稱為雜交復(fù)合物的形成。兩條多核苷酸具有在它們?nèi)L上的100%互補(bǔ)不是實(shí)現(xiàn)雜交的必要條件。在一些方面中雜交復(fù)合物可以由分子間相互作用形成，或者可以由分子內(nèi)相互作用形成。反之，表述“未雜交的“代表“雜交“沒有或還沒有發(fā)生的狀態(tài)。如本文使用的，術(shù)語〃互補(bǔ)的〃或〃互補(bǔ)〃與Watson-Crick和Hoogsteen型堿基配對規(guī)則涉及的反向平行多核苷酸鏈有關(guān)。例如，序列5’-AGTTC-3'與序列5’-GAACT-3' 是互補(bǔ)的。術(shù)語“完全互補(bǔ)的“或"100%互補(bǔ)的“等指的是在反向平行鏈之間具有完美的 Watson-Crick堿基配對(在多核苷酸雙螺旋中沒有錯配)的互補(bǔ)序列。然而，互補(bǔ)不需要是完美的；穩(wěn)定的雙螺旋，例如可以包含錯配堿基對或不匹配堿基。術(shù)語"部分互補(bǔ)"、“部分互補(bǔ)的"、“非完全互補(bǔ)“或“非完全互補(bǔ)的“等指的是反向平行多核苷酸鏈之間的任何堿基比對小于100%完美的(例如，在多核苷酸雙螺旋中存在至少一個錯配或不匹配堿基)。例如，反向平行多核苷酸鏈之間的堿基比對可以是至少99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、 60%、55%或50%，或之間的任何值。如本文使用的，術(shù)語"FRET"(熒光共振能量轉(zhuǎn)移或FSrster型共振能量轉(zhuǎn)移)及相當(dāng)?shù)男g(shù)語通常指的是兩個染料分子的電子狀態(tài)之間的動態(tài)距離依賴的相互作用，其中能量從供體染料分子轉(zhuǎn)移到受體染料分子而沒有來自供體分子的光子發(fā)射。FRET的效率取決于染料之間的分子間距的倒數(shù)，使得它在與生物大分子尺寸相當(dāng)?shù)木嚯x上是有用的。通常，F(xiàn)RET提供成像、動力學(xué)分析和/或局部化分子的定量或單個分子中的構(gòu)象變化，具有超過常規(guī)光學(xué)顯微鏡極限的空間分辨率。通常，F(xiàn)RET要求，(a)供體和受體分子必須緊密地接近(一般，例如10-100A)，(b)受體的吸收光譜必須與供體的熒光發(fā)射光譜重疊，以及(c) 供體和受體躍遷偶極取向必須是大致并行的。在大部分FRET應(yīng)用中，供體和受體染料或報道分子和猝滅劑是不同的，在該情況下FRET可以通過受體敏化熒光的出現(xiàn)或供體熒光的猝滅來檢測。在某些情況下，供體和受體或報道分子和猝滅劑是相同的，而FRET可以通過產(chǎn)生的熒光消偏振來檢測。例如，2004 年 5 月 20 日公布的 I^ackard 和 Komoriya 的題為〃COMPOSITIONS FOR THE DETECTION OF ENZYME ACTIVITY IN BIOLOGICAL SAMPLES AND METHODS OF USE THEREOF"的公布的美國專利申請?zhí)?004/00969 描述了 FRET系統(tǒng)中單一供體/受體或報道分子/猝滅劑分子的使用。FRET已經(jīng)成為研究以分子接近中的變化為特征的多種生命現(xiàn)象的重要技術(shù)。如今FRET技術(shù)在許多生物實(shí)驗(yàn)室中盛行，并且已經(jīng)適合于在多種生物系統(tǒng)中使用，包括但不限于，核酸雜交的檢測，實(shí)時PCR測定和SNP檢測，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，蛋白質(zhì)復(fù)合物的空間分布和裝配，報道分子/配體相互作用，免疫測定，探測單個分子的相互作用，核酸的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，用于檢測突變的引物延伸測定，自動化DNA測序，脂類的分布和轉(zhuǎn)運(yùn)，膜融合測定(膜融合的脂類混合測定)，膜電位傳感，熒光探針蛋白酶底物，和環(huán)AMP和鋅的指示物。如本文使用的，術(shù)語"FRET報道分子“一般指的是產(chǎn)生可檢測的輻射，例如熒光或發(fā)光輻射，的發(fā)射的部分，該發(fā)射可以被轉(zhuǎn)移給足夠接近的適當(dāng)?shù)腇RET猝滅劑。通常，這樣的分子是染料。表述〃FRET報道分子〃可以與〃報道分子〃或〃FRET標(biāo)記〃或〃FRET標(biāo)記部分〃可互換地使用。如本文使用的，術(shù)語“猝滅劑“通常指的是減少和/或能夠減少可檢測的輻射，例如但不限于熒光或發(fā)光輻射，的發(fā)射的部分，該輻射來自否則已經(jīng)發(fā)射該輻射的來源。通常，猝滅劑指的是能夠減少光發(fā)射的任何部分。猝滅的程度本身沒有限制，除了猝滅效應(yīng)最低限度應(yīng)該是可通過任何使用的檢測儀器檢測的。在某些方面，猝滅劑減少來源發(fā)射的可檢測的輻射至少50%，可選擇地至少80%，并且可選擇地和最優(yōu)選至少90%。在一些實(shí)施方案中，猝滅劑導(dǎo)致來自報道分子的熒光發(fā)射減少，由此報道分子/猝滅劑形成FRET對，并且該猝滅劑被稱為〃FRET猝滅劑“而該報道分子為〃FRET報道分子〃。這不意味著術(shù)語“猝滅劑“限于FRET猝滅劑。例如，猝滅可以包括任何類型的能量轉(zhuǎn)移，包括但不限于光電子轉(zhuǎn)移，質(zhì)子偶合電子轉(zhuǎn)移，緊密設(shè)置的熒光基團(tuán)之間的二聚體形成，瞬時激發(fā)態(tài)相互作用， 碰撞猝滅，或非熒光基態(tài)族的形成。在一些實(shí)施方案中，猝滅劑指的是能夠減少光發(fā)射的分子。熒光基團(tuán)和猝滅劑之間不需要光譜的重疊。如本文使用的，"猝滅"包括任何類型的猝滅，包括動態(tài)(FSrster-Dexter能量轉(zhuǎn)移等)和靜態(tài)的(基態(tài)復(fù)合物)。還可選擇地，猝滅劑可以除光外的形式，例如熱，散失從熒光染料中吸收的能量。在一些實(shí)施方案中，某些猝滅劑能夠以可同F(xiàn)RET報道分子發(fā)射區(qū)分的波長或信號類型，和以該猝滅劑特征的波長或信號類型重新發(fā)射從FRET報道分子吸收的能量，在這方面，猝滅劑也可以是“標(biāo)記“。
對于熒光探針系統(tǒng)的使用的一般討論，參見，例如!Principles of Fluorescence Spectroscopy, Joseph R. Lakowicz, Plenum Publishing Corporation,第二版(1999年 7月 1 日)和 Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Richard P. Haugland, Molecular Probes 出版，第 6 版(1996 年)。已經(jīng)開發(fā)了與其它試劑和檢測/成像儀器一起用于FRET分析的多種染料、熒光染料、猝滅劑和熒光蛋白質(zhì)，它們是市場上可以普遍地買到的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道用于任何特定分析的適當(dāng)?shù)腇RET流程、試劑和儀器。術(shù)語"監(jiān)測"表示通過探針監(jiān)測發(fā)射的熒光。這還可以包括檢測和測定熒光強(qiáng)度， 采集和記錄熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，例如在本領(lǐng)域已知的類型的電腦可讀介質(zhì)上。進(jìn)一步的步驟包括數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)處理，其使用或不適用電腦的分析和說明。術(shù)語"基本上缺少5’ -3’核酸酶活性的核酸聚合酶"或"5’ -3’核酸酶缺陷的酶"， 或簡單起見“核酸酶缺陷的酶“指的是具有天然Taq DNA聚合酶的50%或更少5’ _3’活性的聚合酶。測定5’-3’核酸酶活性的方法和測定的條件已經(jīng)描述于美國專利號5，466，591 中。缺少5’-3’核酸酶活性的聚合酶的實(shí)例包括Taq DNA聚合酶的Moffel片段(美國專利號5，466，591)，Thermus africanus DNA聚合酶的突變體(美國專利號5，968，799)，海棲熱袍菌(Thermotoga maritima) DNA聚合酶的突變體(美國專利號5，624，833和5，420, 029), 棲熱菌屬(Thermus)物種spsl7和棲熱菌屬物種Z05 DNA聚合酶的突變體(美國專利號 5，466，591和5，405，774)。5’ -3’核酸酶缺陷的酶還可以是由來源于一個以上物種的結(jié)構(gòu)域組成并且具有消除5’ -3’核酸酶活性的突變的嵌合體，即嵌合蛋白質(zhì)(例如美國專利號 5，795，762 和 6，228，628 中描述的)。如本文使用的，術(shù)語“Tm"用于指代“解鏈溫度“。解鏈溫度是同源雙鏈或異源雙鏈中的雙鏈多核苷酸或核苷堿基寡聚體(例如雜交復(fù)合物)群的一半解離成單鏈的溫度。雙鏈體多核苷酸的Tm的預(yù)測考慮了堿基序列以及其它因素，包括結(jié)構(gòu)和序列特征以及寡聚物連鎖的特性。預(yù)測和實(shí)驗(yàn)確定Tm的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，傳統(tǒng)上通過解鏈曲線確定 Tm，其中雙鏈體核酸分子在控制溫度程序中加熱，監(jiān)測該雙鏈體中的兩條單鏈的結(jié)合/解離狀態(tài)并圖示直到達(dá)到兩條鏈完全解離的溫度。1從該解鏈曲線中讀出?？蛇x擇地，Tm可以通過退火曲線確定，其中雙鏈體核酸分子被加熱到兩條鏈完全解離的溫度。然后在控制溫度程序中降低溫度，監(jiān)測該雙鏈體中的兩條單鏈的結(jié)合/解離狀態(tài)并圖示直到達(dá)到兩條鏈完全退火的溫度。Tm從該退火曲線中讀出。除非另有指示，本發(fā)明的實(shí)施可以使用化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA 技術(shù)的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍之內(nèi)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中充分地解釋。參見， 例如 Sambrookj Fritsch & Maniatisj Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二 版(1989) Oligonucleotide Synthesis (Μ. J. Gait, ed.，1984) ；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higginsj eds.，1984) ；A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbalj 1984)；禾口 Methods in Enzymology 系列(Academic Press, Inc.)。發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了一種使用熒光探針監(jiān)測PCR反應(yīng)的方法。在第一方面中，本發(fā)明涉及一種在樣品中檢測目標(biāo)核酸的方法，包括在第一和第二寡核苷酸探針與所述目標(biāo)核酸選擇性雜交的條件下把所述樣品與基本上缺少5’ -3’核酸酶活性的核酸聚合酶和第一和第二寡核苷酸探針接觸；其中第一寡核苷酸探針包括熒光報道分子而第二寡核苷酸探針包括猝滅劑以便當(dāng)?shù)谝缓偷诙押塑账崽结樑c目標(biāo)核酸雜交時熒光報道分子的熒光被猝滅劑猝滅；以及當(dāng)?shù)谝缓偷诙押塑账釠]有與目標(biāo)核酸雜交時熒光報道分子的熒光不被猝滅劑猝滅；用光源激發(fā)熒光報道分子；在第一和第二寡核苷酸探針與目標(biāo)核酸雜交的條件下監(jiān)測熒光報道分子的熒光；和將在第一和第二寡核苷酸探針與目標(biāo)核酸雜交的條件下獲得的熒光與在第一和第二寡核苷酸探針沒有與目標(biāo)核酸雜交的條件下獲得的熒光比較。在本發(fā)明的方法中當(dāng)用光激發(fā)時報道分子染料發(fā)射熒光，該熒光被直接監(jiān)測。當(dāng)猝滅劑在空間上足夠接近報道分子時使報道分子的熒光衰減。這不同于現(xiàn)有技術(shù)使用具有供體和受體的熒光雜交對的方法，其中，當(dāng)通過光激發(fā)時，供體通過FRET轉(zhuǎn)移能量給依次發(fā)射熒光的受體。然后監(jiān)測受體的熒光。根據(jù)本發(fā)明的方法通過監(jiān)測報道分子直接發(fā)射的熒光，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在供體-受體探針對中供體的不希望的高熒光背景可以避免。這在存在具有一個供體的許多寡核苷酸探針的多路測定中是特別有益的。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)與能量轉(zhuǎn)移相反從直接激發(fā)中獲得更多的信號或更大的信號動力學(xué)。通常在FRET中用作為報道分子或猝滅劑的分子包括，例如但不限于，熒光素染料 (例如FAM、JOE和HEX)，羅丹明染料(例如R6G、TAMRA, R0X)，和花青染料(例如Cy3、Cy3. 5、 Cy5、Cy5. 5和Cy7)。其它實(shí)例包括DABCYL和EDANS。熒光染料作為報道分子或猝滅劑是通過其激發(fā)和發(fā)射光譜，以及通過與其成對的熒光染料確定的。例如，F(xiàn)AM被488 nm波長的光最有效地激發(fā)，發(fā)射500至650 nm光譜的光，發(fā)射最大值為525 nm。FAM與作為猝滅劑的例如TAMRA —起使用是適當(dāng)?shù)膱蟮婪肿訕?biāo)記，TAMRA的激發(fā)最大值在514 nm。消散從熒光染料吸收的能量的非熒光或暗猝滅劑(dark quencher)的實(shí)例包括Biosearch Technologies, Inc. ( Novato, CA, USA)銷售的 Black Hole Quenchers 。Black Hole Quenchers 是包括至少三個選自取代的或未取代的芳基或雜芳基化合物，或其組合的基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，其中至少兩個殘基通過環(huán)外的重氮鍵連接(參見，例如Cook等的2001年11月15 日公布的題為〃DARK QUENCHERS FOR DONOR-ACCEPTOR ENERGY TRANSFER〃的國際
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