一種能裂解大腸桿菌的噬菌體融合裂解酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供一種能裂解大腸桿菌的噬菌體融合裂解酶，用于殺滅致病性大腸桿 菌，本發(fā)明還公開了上述融合裂解酶的構(gòu)建及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近幾十年，由于在畜牧生產(chǎn)過程中，廣泛的使用抗生素，致使大量的"超級(jí)細(xì) 菌"（多耐藥性、高致病性的細(xì)菌）產(chǎn)生。近十多年才投入市場(chǎng)的新抗生素，比如氟苯尼考、 頭孢喹肟等新獸藥，也被細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，這些耐藥性能通過各種途徑快速在細(xì)菌之間 傳播，許多很普通的細(xì)菌性疾病現(xiàn)在已很難控制。2011年"超級(jí)大腸桿菌"引發(fā)了全國(guó)范圍 內(nèi)高發(fā)病率、高致死性仔豬腹瀉，致使當(dāng)年生豬生產(chǎn)量下降20%，豬肉價(jià)格暴漲。同時(shí)，細(xì) 菌的耐藥性也嚴(yán)重危害著公共衛(wèi)生安全。據(jù)報(bào)道，2011年德國(guó)發(fā)生的無藥可治的大腸桿菌 病，也與細(xì)菌的耐藥性有關(guān)。因此，研究出一種能殺滅"超級(jí)細(xì)菌"，不產(chǎn)生抗藥性的制劑，具 有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 對(duì)噬菌體及其裂解酶制劑的研究越來越受到科研人員的關(guān)注?，F(xiàn)在已經(jīng)有比較成 熟的制劑走向市場(chǎng)，應(yīng)用于臨床。比如針對(duì)體外傷口、消化道、呼吸道感染的G+細(xì)菌研發(fā)的 裂解酶制劑（金葡萄球菌、鏈球菌的噬菌體及裂解酶制劑在國(guó)外已經(jīng)用于燒燙傷的治療）。 針對(duì)(T細(xì)菌的裂解酶制劑雖然也有極少數(shù)報(bào)道，但也僅限于研究。這些制劑同時(shí)還存在其 它不足，比如噬菌體捕食細(xì)菌具有地域、菌株的特異性；裂解酶裂解細(xì)菌的屬、種、株的特異 性等等。這些不足限制了噬菌體及其裂解酶制劑的作用與發(fā)展。但這些信息也給我們提供 了一個(gè)思路，只要讓裂解酶通過(T細(xì)菌的外膜，在周質(zhì)間隙與肽聚糖發(fā)生作用，裂解酶就 有可能破壞(T細(xì)菌細(xì)胞壁。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是公開一種能裂解大腸桿菌的融合裂解酶，解決了當(dāng)前裂解酶不能 裂解致病性大腸桿菌的問題。
[0005] 本發(fā)明還提供了上述融合裂解酶的構(gòu)建及制備方法，可作為一種備選藥物。
[0006] 本發(fā)明的能裂解大腸桿菌的融合裂解酶，是通過改造噬菌體裂解酶結(jié)構(gòu)，裂解酶 的C端加上具有疏水性多肽，該肽可以改變大腸桿菌的細(xì)胞外膜的電位差，進(jìn)而改變細(xì)胞 外膜的結(jié)構(gòu)，加大細(xì)胞外膜蛋白的間隙，裂解酶就可以進(jìn)入大腸桿菌的周質(zhì)空間，與(T細(xì) 菌的肽聚糖相作用，破壞(T細(xì)菌壁，而起到殺滅細(xì)菌的作用。
[0007] 本發(fā)明能裂解大腸桿菌的融合裂解酶的制備方法如下：
[0008] 構(gòu)建噬菌體融合裂解酶，裂解酶通過(T細(xì)菌的外膜，在周質(zhì)間隙與肽聚糖發(fā)生作 用，裂解酶就能夠破壞(T細(xì)菌細(xì)胞壁。設(shè)計(jì)引物，PCR方法克隆目的基因，把它連接到酵 母菌表達(dá)載體pPICAa-A上，構(gòu)建成pPICAa-A-Lyase真核表達(dá)重組質(zhì)粒，把該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化到畢赤酵母菌GS115感受態(tài)細(xì)胞中，表達(dá)出pPICAa-A-Lyase噬菌體融合裂解酶，蛋白 純化后，采用點(diǎn)滴法測(cè)定裂解范圍，同樣用綠膿桿菌ATCC27853、綠膿桿菌CMCC、大腸桿菌 DH5a、大腸桿菌078、大腸桿菌CC11以及金黃色葡萄球菌ATCC27853作為指示菌株，結(jié)果顯 示Lys印3-D8對(duì)大腸桿菌078有極為明顯的裂解活性，作用時(shí)間從2h至24h持續(xù)有效。發(fā) 明可控制高致病性的細(xì)菌（大腸桿菌）耐藥性及耐藥性能通過各種途徑快速在細(xì)菌之間的 傳播。具有特異性強(qiáng)，靈敏度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，對(duì)大腸桿菌的控制、殺滅具有重要意義和 實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0009] 圖1為高裂解噬菌體形成的噬菌斑圖及噬菌體電鏡照片
[0010] 圖2為pPICAa-A-Lyase噬菌體融合裂解酶體外殺菌結(jié)果圖片
【具體實(shí)施方式】
[0011] 下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解 至IJ，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明的任何平行改變和改動(dòng)都將落入本 發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
[0012] 實(shí)施例1
[0013] 噬菌體的分離
[0014] 1. 1污染物的采集
[0015] 分別從長(zhǎng)春附近豬養(yǎng)殖場(chǎng)各采集污水1000ml
[0016] 1.2細(xì)菌的培養(yǎng)
[0017] 取豬源致病性E.coli菌種（最好多采取幾株大腸桿菌，如果有可能，最好分離到 多抗藥性、高致病性大腸桿菌），用接種環(huán)釣取劃線于固體LB平板，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒 置過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落接種到盛有LB培養(yǎng)液的試管中，37°C搖床中振蕩（180rpm)培養(yǎng) 16h，得到細(xì)菌菌懸液。
[0018] 1.3噬菌體的分離與增殖
[0019] 分別加入10倍濃縮蛋白胨水10mL，并一次性加入致病性大腸桿菌菌液，每種菌液 各加0. 2mL，置37度培養(yǎng)24h，取培養(yǎng)液5mL于滅菌試管中，56度水浴lh，而后4000r/min 離心30min，取上清液經(jīng)0. 22um微孔濾膜過濾，所得濾液為噬菌體混合液，即初分離的噬 菌體.
[0020] 1.4噬菌體的分離鑒定
[0021] 噬菌體的鑒定：采用雙板平板法（二）雙層瓊脂培養(yǎng)基：下層培養(yǎng)基：液體LB培 養(yǎng)基+1. 5%瓊脂粉；上層培養(yǎng)基：液體LB培養(yǎng)基+0. 7%瓊脂粉）來測(cè)定，將1. 5%的下層 培養(yǎng)基作為底層瓊脂，置于4度備用，臨用前置于37度半個(gè)小時(shí)左右。將0.lml的噬菌體 原液和等量大腸桿菌培養(yǎng)液混合均勻，37度孵育20分鐘，將混合液加入到已融化好的保溫 的上層培養(yǎng)基中，充分混勻，迅速倒入已準(zhǔn)備好的下層培養(yǎng)基上，旋轉(zhuǎn)平皿使其分布均勻， 凝固后，37度倒置培養(yǎng)10h后，觀察有無噬菌斑。若觀察到蠶蝕狀的空斑，則說明有裂解性 噬菌體的存在
[0022] 1. 4. 1噬菌體純化
[0023] 因?yàn)槌醮畏蛛x到的噬菌斑大小形態(tài)不一，所以需要進(jìn)一步純化。具體的操作方法 如下：（一）用滅菌的20yL槍頭挑取直徑較大的噬菌斑，放于裝有l(wèi)mLSM保存液的離心管 中，吹打數(shù)次，然后放置于4°C冰箱3h，用0. 22ym濾膜過濾，將濾液用SM保存液作10倍 梯度稀釋，取最后3個(gè)稀釋梯度用雙層平板法作單噬斑培養(yǎng)。二）培養(yǎng)4~6小時(shí)后，用 高壓滅菌的20yL槍頭從平皿中挑取直徑比較大的單個(gè)噬斑，置于含宿主菌液（含菌量約 為109CFU/mL)的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)，吹打數(shù)次，然后放于37°C恒溫振蕩器中75rpm振蕩培 養(yǎng)6h作少量增殖。（三）增殖后，將混合液8000rpm離心20min，取出細(xì)菌碎片，上清液用 0. 22ym微孔濾膜過濾，濾液再用雙層平板法觀察噬斑的形態(tài)。（四）重復(fù)以上操作3~5 次后，即可得形狀和大小一致的噬菌斑，挑取單個(gè)噬斑置于裝有l(wèi)mLSM保存液的離心管中， 放于 4°C冰箱保存（SM保存液：取MgS04.7H20 2.0g，NaCl5.8g，lMTris.C(lpH7.5)50mL， 2%明膠5mL，加雙蒸水至1000mL，121°C高壓滅菌20min，4°C保存。）
[0024] 1.4.2噬菌體的保存
[0025] 短期4°C保存，長(zhǎng)期保存則將噬菌體增殖液5, 000g離心lOmin，收集含噬菌體的上 清，采用兩種方法保存：（1)在噬菌體懸液中加甘油至終濃度30%，分裝多管，-70°C保存； (2)將噬菌體懸液分裝在無菌EP管中，每管滴加一滴氯仿，4°C保存。
[0026] 1.4.3噬菌體的液體增殖
[0027] 純化后的噬菌體的效價(jià)一般都不高，需要進(jìn)行進(jìn)一步的增殖，本實(shí)驗(yàn)我們采用液 體增殖法進(jìn)行增殖。具體的方法如下：將噬菌體液按一定比例加入到培養(yǎng)12h的宿主菌液 中（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期），再于37°C振蕩培養(yǎng)10h，將混合液8000rpm離心15min，去處細(xì)菌碎片， 上清液用〇. 22ym的濾器過濾，再將該含噬菌體的濾液按原比例加入到培養(yǎng)12h的宿主菌 液中，再放入37°C振蕩培養(yǎng)10h，反復(fù)操作3~5次，即可獲得效價(jià)較高的噬菌體液。
[0028] 1. 4. 4增殖后效價(jià)的測(cè)定
[0029] 噬菌體效價(jià)表示每毫升樣品中所有的具有侵染性的噬菌體數(shù)，又稱噬菌斑形成單 位數(shù)（plaque-formingunit，pfu)。將增殖后的菌體液用SM保存液作10倍倍比稀釋 至10的7次方，取最后3個(gè)稀釋梯度各100yL與宿主菌液100yL混勻，37°C溫育20min， 加入到47°C保溫的上層培養(yǎng)基中，混合均勻，迅速倒在底層培養(yǎng)基的表面，旋轉(zhuǎn)平板，使混 合液均勻涂布于平板上，然后放于37°C溫箱倒置培養(yǎng)4~6h后作噬菌斑計(jì)數(shù)，每個(gè)梯度做 三個(gè)平行，取平均值，計(jì)算出菌體效價(jià)。菌體效價(jià)（pfu/ml)=平均菌斑數(shù)X稀釋倍 數(shù)X10
[0030] 噬菌體裂解譜的測(cè)定：采用單斑法[40]來測(cè)定噬菌體的裂解譜。本試驗(yàn)的細(xì)菌菌 株有。挑取細(xì)菌的單菌落分別接種于盛有3mLLB的試管中，37°C震蕩培養(yǎng)8h，制得各株細(xì) 菌菌液，取200yL菌懸液分別均勻涂布于普通瓊脂平板上，分別取10yL噬菌體懸液滴于 平板的不同位置上，加樣時(shí)，各種噬菌體懸液間不能有接觸，以免影響試驗(yàn)結(jié)果。待自然干 燥后37 °C培養(yǎng)6~8h，觀察結(jié)果。
[0031] 形態(tài)結(jié)構(gòu)。）
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 全基因測(cè)序
[0034] 2. 1噬菌體顆粒的濃縮
[0035] 取50mL的錐形瓶加入10mL液體LB滅菌后接入宿主菌的一個(gè)單菌落，于37°C振 蕩培養(yǎng)過夜；再取