一株能夠通過口服入血的噬菌體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領域，尤其設及一株能夠通過口服入血的隧菌體及其應用。
【背景技術】
[0002] 隧菌體是一類感染細菌的病毒，可從污水或糞便等自然環(huán)境樣本中分離得到。隧 菌體具有嚴格的宿主特異性，大腸桿菌隧菌體只侵襲大腸桿菌，對人和動物細胞、植物細胞 沒有感染作用，所W隧菌體對人類或動植物沒有感染性，也不會污染環(huán)境，安全性較高。隧 菌體與相應的宿主菌接觸后，就會觸發(fā)隧菌體的吸附及胞內(nèi)增殖過程，并通過宿主菌的裂 解釋放更多的隧菌體。隧菌體可通過運種途徑在環(huán)境中通過殺滅特異的宿主菌得到自身的 大量擴增，具有指數(shù)增殖特征，能作為一種具有殺菌作用的生物消毒劑和抗生素替代品。
[0003] 許多肉雞養(yǎng)殖場采用地面散養(yǎng)模式，肉仔雞飼養(yǎng)到20日齡左右往往就會發(fā)生大 腸桿菌病，抗生素治療只能暫時控制其癥狀，并不能完全治愈，因此大腸桿菌病在肉仔雞的 飼養(yǎng)周期中持續(xù)不斷地發(fā)生，給養(yǎng)殖業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失?？股刂委熗媾R細菌耐 藥性的問題，許多大腸桿菌的臨床分離株表現(xiàn)為對多種抗菌藥物同時耐藥；肉雞發(fā)生大腸 桿菌病，會通過糞便排出致病性大腸桿菌，污染墊料，加上肉雞地面散養(yǎng)過程中地面消毒的 限制性，使大腸桿菌在環(huán)境中大量存在，增加了肉雞感染大腸桿菌病的機會。
[0004] 隧菌體消毒試驗有過報道，但是口服后能入血且持續(xù)存在14h的隧菌體，且該隧 菌體還能對雞糞中的細菌總數(shù)及大腸桿菌數(shù)有明顯消毒作用的隧菌體未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一株能夠通過口服入血的隧菌體及其應用，旨在解決抗生素治療肉 雞大腸桿菌病面臨的耐藥性難題。肉雞大腸桿菌病的抗生素治療面臨嚴重的細菌耐藥性問 題，地面散養(yǎng)的肉雞場，其墊料的消毒常常無法進行。國內(nèi)的研究者都做過很多類似的隧菌 體消毒試驗，但具有環(huán)境消毒作用且能通過口服入血的隧菌體未見報道。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一株具有口服入血能力的隧菌體，該隧菌體單體為大腸桿 菌隧菌體，拉下名E. coli地age,被命名為化4,對大腸桿菌具有廣譜的殺菌能力，隧菌體 Bp4保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物學中屯、，保藏日期為2014年6月10 日，保藏編號為CGMCCNo. 9248。
[0007] 該隧菌體對大腸桿菌具有強烈的裂解作用，為工業(yè)化生產(chǎn)隧菌體及用于環(huán)境消毒 和隧菌體治療提供了隧菌體來源。
[0008] 該隧菌體可用于工業(yè)生產(chǎn)，可由宿主菌大腸桿菌特異性擴增，可作為生物消毒劑 應用于雞場環(huán)境消毒及大腸桿菌病的隧菌體治療。
[0009] 該隧菌體Bp4作為消毒劑噴灑消毒于雞糞時，它對雞糞中的細菌總數(shù)及大腸桿菌 數(shù)有明顯的消毒效果，該隧菌體作為消毒劑用于雞糞消毒且有明顯的消毒效果。
[0010] 該隧菌體可通過口服途徑給肉雞使用，能在14h內(nèi)在血液中存在，為治療雞大腸 桿菌病提供潛在的抗生素替代品。
[0011] 隧菌體Bp4經(jīng)雙層平板法w 24株雞致病性大腸桿菌為對象，測定出隧菌體Bp4可 W裂解24株致病性大腸桿菌中的8株，寬隧率為33%，運一結果說明該隧菌體是多價烈性隧 菌體且具有較強的廣譜性，在臨床治療上具有良好的應用前景。
[0012] 本發(fā)明提供了一株能通過口服入血的隧菌體及其應用，該隧菌體對大腸桿菌具有 強烈的裂解作用，為工業(yè)化生產(chǎn)隧菌體及用于雞糞消毒及隧菌體治療提供了隧菌體來源； 該隧菌體可W用于工業(yè)生產(chǎn)，可由宿主菌大腸桿菌特異性擴增；該隧菌體還可作為一種安 全的生物消毒劑用于環(huán)境消毒，從而治理動物養(yǎng)殖場污染；該隧菌體還可作為一種抗生素 替代品用于肉雞大腸桿菌病的防治。
【具體實施方式】
[0013] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，W下結合實施例，對本發(fā)明 進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用 于限定發(fā)明。
[0014] A、隧菌體的篩選和純化 (一）樣品的采集 本發(fā)明中的雞糞樣品采自山東省濰坊市高密某商品雞場。
[0015] (二）樣品中針對大腸桿菌隧菌體的特異性擴增 取2g樣品加入預先已擴增好的大腸桿菌(宿主菌加入比例為1 : 10)，將其置于恒溫搖 床 37°C，200r/min 培養(yǎng) 6-化。
[001引（3雙層平板試驗檢測特異性隧菌體的存在 高壓滅菌瓊脂含量為2%的營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，室溫放置至約40-60°C后取10-15mL 傾倒至培養(yǎng)皿內(nèi)，均勻鋪于皿底，室溫放置30min使其凝固，將此營養(yǎng)瓊脂平板作為底層瓊 脂平板。取上述經(jīng)大腸桿菌擴增后的隧菌體擴增樣本ImL，4000巧m離屯、5min后，取上清液 經(jīng)0. 22化濾膜過濾除菌。濾液裝于無菌管中。取10化大腸桿菌懸液與50化上述濾液，混 勻后，40°C水浴作用15min，再將混合液加入已高壓滅菌并冷卻至55° C的5血瓊脂含量為 0. 7%的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，手磋試管混勻后，迅速倒入己準備好的底層瓊脂平板上，旋轉平 皿使其分布均勻成上層瓊脂。待瓊脂凝固后，37°C倒置培養(yǎng)6-化后，觀察有無隧斑。如果 有則進行步驟（四）。W上操作均為無菌條件。
[0017](四）隧菌體樣品的純化與擴增 無菌挑取在步驟(=)的大腸桿菌雙層平板中出現(xiàn)的單個隧斑，置于盛有800化生理鹽 水的無菌EP管中，40°C水浴作用30min，40(K)r/min離屯、lOmin，得到隧菌體浸出液。各取 100化大腸桿菌菌液與隧菌體浸出液加入5mL無菌的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫搖 床20化/min培養(yǎng)3-地，待混合液變澄清，得到隧菌體增殖液。將隧菌體增殖液經(jīng)雙層平板 法進行進一步隧斑純化，重復3-5次，得到隧菌體單克隆單體，并將該隧菌體命名為化4。 [001引（五）隧菌體保存液的制備 將隧菌體增殖液與已高壓滅菌的含60%甘油的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基: 1的比例混 合，即得到隧菌體保存液。隧菌體保存液4°C保存。
[0019] B、隧菌體形態(tài)的觀察： 將隧菌體增殖液5血經(jīng)5000巧m高速離屯、lOmin后，將上清液裝入透析袋內(nèi)進行陽G 濃縮至0. 5-1血左右，最后加入2倍體積2. 5%的戊二醒固定，此樣品進行透射電鏡觀察。
[0020] 結果可見隧菌體Bp4有一個多面體立體對稱的頭部，直徑約60nm，有一個長約 30nm的尾部。
[0021] C、隧菌體穩(wěn)定性的檢測 (一）隧菌體計數(shù)方法(效價） 將所得的隧菌體樣品用無菌生理鹽水按10倍比例稀釋，取其中一定比例的樣品稀釋 液10化與大腸桿菌菌液20化混合均勻后，用A步驟(=)中的方法制備雙層平