專利名稱：分泌型堿性磷酸酶示蹤ta克隆真核表達載體及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種真核表達載體，具體地說是一種分泌型堿性磷酸酶示蹤TA克隆 真核表達載體。
背景技術：
真核基因在細胞內(nèi)的臨時表達對于研究基因在細胞內(nèi)的功能具有重要意義，在當 今大多數(shù)高水平的論著中多用真核表達質(zhì)粒來實現(xiàn)，然而由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細胞的效率與 轉(zhuǎn)染試劑、細胞類型、細胞狀態(tài)等有很大的關系。其轉(zhuǎn)染效率從低到小于到高達90%以 上不等。而轉(zhuǎn)染效率又直接影響到后續(xù)的研究結(jié)果。一般低于10%的轉(zhuǎn)染效率就很難達到 預期的效果，不僅浪費了材料而且導致研究失敗。目前現(xiàn)階段轉(zhuǎn)染效率很難估計，通常需要轉(zhuǎn)染大量熒光蛋白基因用以分選轉(zhuǎn)染細 胞。同時由于在同一實驗中不同的轉(zhuǎn)染效率差異直接影響到結(jié)果的可比性，因此構建一個 具有示蹤作用的真核轉(zhuǎn)染質(zhì)粒具有重要意義。分泌型堿性磷酸酶在科研上被廣泛用于啟動子研究的報告基因，是一個很好的真 核轉(zhuǎn)染示蹤蛋白。目前被廣泛應用的基因表達示蹤蛋白為EGFP，可通過熒光顯微鏡直接觀 測轉(zhuǎn)染效率，但不能進行定量分析。另外還有半乳糖苷酶基因，通過化學顯色或ELISA 進行半定量且操作復雜，還有熒光蛋白酶等。但所有上述現(xiàn)有技術都需要基于細胞或細胞 裂解物進行研究。還有通過示蹤基因載體和目的基因載體共轉(zhuǎn)染的辦法來評估細胞轉(zhuǎn)染效 率，而這種方法很不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種分泌型堿性磷酸酶示蹤TA克隆真核表達載體。本發(fā)明的另一目的在于提供上述示蹤載體的構建方法。本發(fā)明的發(fā)明思路基于下述兩方面的考慮。第一，在科學研究中，廣泛使用真核表 達載體進行瞬間轉(zhuǎn)染來研究基因的功能，而載體的轉(zhuǎn)染效率直接影響到研究的結(jié)果。好多 真實的基因功能因為轉(zhuǎn)染效率低或不一致而被掩蓋，因此選擇一個能清楚得知轉(zhuǎn)染效率的 示蹤物非常重要。分泌型堿性磷酸酶作為示蹤物正好能滿足這一要求；第二，多數(shù)研究的基 因是通過RT-PCR直接從組織細胞獲得，而普通Taq酶具有3’末端腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶活性，因此 PCR產(chǎn)物往往在其3’末端突出一個Α，結(jié)果導致PCR產(chǎn)物不能直接插入平端質(zhì)粒載體，而需 要插入3’末端有T突出的載體即“Τ載體”。我們把分泌型堿性磷酸酶示蹤真核表達載體 構建成一個能把目的基因插入到由CMV啟動子調(diào)控的TA克隆位點，從而構成一個分泌型堿 性磷酸酶示蹤TA克隆真核表達載體。為實現(xiàn)這一目標，我們將含雙AhdI酶切位點的寡核 苷酸插入到CMV啟動子的下游，從而構建了一個分泌型堿性磷酸酶示蹤的T載體。該TA克 隆位點直接位于真核表達啟動子(CMV)的下游和BGH多聚腺嘌呤轉(zhuǎn)錄終止子的上游，因此 當質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入細胞后，CMV啟動子可直接啟動插入PCR序列全長的轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)目的基因的表達。為了達成本發(fā)明上述目的，本發(fā)明采用如下具體技術方案本發(fā)明提供了一種分泌型堿性磷酸酶示蹤TA克隆真核表達載體，所述載體是在 真核表達啟動子下游和BGH多聚腺嘌呤轉(zhuǎn)錄終止子的上游插入堿性磷酸酶示蹤TA克隆位
點ο本發(fā)明所述載體的堿基序列如SEQ ID No. 10所示。本發(fā)明分泌型堿性磷酸酶示蹤TA克隆真核表達載體是利用下述方法構建的，步 驟為1、原核TA克隆載體把TA位點引入pUC19載體構建成pUC19_TA載體；所述步驟具體為1. 1首先合成兩條含AhdI酶切位點的寡核苷酸，退火形成雙鏈DNA ；TA-o ligo-s 5’ P-AATTCACTAGTGGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCGG-3’ ；TA-o Ii go-as 5’ P-AATTCCGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCCACTAGTG-3’EcoRI酶切pUC19質(zhì)粒，與上述DNA雙鏈連接形成前T載體；序列如SEQ IDNo. 1所 示；1.2制備間隔DNA引物aspp2-xhoI-s CCATCTCGAGCCCATCATACCCATCCAAGaspp2-xhoI-as TTCCTCGAGCGATACGCTCTGAGCCAG以本實驗室構建的pcDNA4-ASPP2模板擴增，pcDNA4_ASPP2模板序列如SEQ ID No. 11所示，擴增片段中不含常用的限制性酶切位點，擴增序列如SEQ IDNo. 2所示；1. 3XhoI酶切步驟1. 2制備的間隔DNA后，插入到前T載體中；1. 4 設計突變引物 AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT, Ahdl-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT 把 ampicilin 抗性基因中的 AhdI 酶切位點 GACTCCCCGTC 突 變?yōu)镚ACTCCCCGTG，形成pUC19_TA前T載體，序列如SEQ ID No. 3所示。1. 5AhdI酶切pUC19-TA前T載體，回收大片段，即為pUC19_TA載體，第89堿基處 為開放性T末端，序列如SEQ ID No. 4所示。2、把pUC19-TA載體的TA序列克隆入pcDNA4 His載體中得到pcDNA5_TA克隆載 體；所述步驟具體為2. 1以PUC19-TA前T載體為模板，擴增片段如SEQ ID No. 5所示，引物為TA-HindIII-S :GCCGCGGGAAGCTtATATCACTAGTGAATTCTA-XbaI-AS :GGTCGACCTCTAGACGGCCGCGAATTCCGAC2. 2HindIII 和 XbaI 雙酶切 SEQ ID No. 5，定向連接到 pcDNA4 His vector 上，用 引物AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT,Ahdl-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位點GACTCCCCGTC突變?yōu)镚ACTCCCCGTG，形成pcDNA5-TA前T載體，如SEQ ID No. 6所示；2. 3AhdI酶切上述pcDNA5-TA前T載體，回收大片段即為pcDNA5_TA載體，第946 堿基處為開放性T末端，如SEQ ID No. 7所示。3、把pcDNA5-TA克隆載體上的CMV-TA-poly A序列經(jīng)PCR得到后克隆到 pSEAP2-C0ntr0l載體中構建成具有真核表達功能并外分泌堿性磷酸酶(AP)的TA載體 pcDNA5AP-TA。3. 1以pcDNA5-TA前T載體為模板，擴增片段，如SEQ ID No. 8所示，引物為CMV-NotI GCATGAAGCGGCCGCTTAGGGTTAGGCGTTpolyA-Notl :AGCTGGTTGCGGCCGCCTCAGAAGCCAT3. 2NotI酶切后，插入到pSEAP2-C0ntr0l載體上，測序驗證反向插入的為正確克 降，引物為AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGATAhdI-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT3. 3 把 ampicilin 抗性基因中的 AhdI 酶切位點 GACTCCCCGTC 突變?yōu)?GACTCCCCGTG， 形成pcDNA5AP-TA前T載體，如SEQ ID No. 9所示；3. 4AhdI酶切回收大片段，即為pcDNA5AP-TA載體，第5245堿基處為開放性T末 端，如SEQ ID No. 10所示。本發(fā)明可廣泛用于基因功能的研究，使研究易于操作，結(jié)果更可靠，同時可潛在用 于藥物作用基因篩查的功能。本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果(1)本發(fā)明提供的是一個分泌型堿性磷酸酶示蹤載體，可利用培養(yǎng)基上清進行檢 測；(2)可利用化學發(fā)光儀器進行檢測，不僅靈敏度高而且可以根據(jù)標準堿性磷酸酶 的對照進行定量；(3)發(fā)明人把目的基因插入位點改造成TA克隆載體位點，因此可以把PCR產(chǎn)物直 接插入到報告基因載體，既節(jié)省了時間又節(jié)省了科研成本。


圖1為將兩條含AhdI酶切位點的寡核苷酸退火形成的雙鏈DNA酶切示意圖；圖2為pucl9-TA載體結(jié)構圖；圖3為pcDNA5-TA載體結(jié)構圖；圖4為pcDNA5AP-TA載體結(jié)構圖；圖5為EGFP綠色熒光水平與SEAP-表達水平。
具體實施例方式實施例lpcDNA5AP_TA質(zhì)粒的構建pcDNA5AP-TA載體的構建步驟主要產(chǎn)生一個3，末端突出“T”的線性載體。傳統(tǒng)的 方法是在平末端的雙鏈DNA 3，-末端通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶加入“T”。為了降低成本和便于 操作，我們利用AhdI切割GACNNN/NNGTC的特點，弓丨入正向重復序列，通過AhdI切割產(chǎn)生3，
6末端突出“T”的線性載體。但是由于在載體的氨芐抗性篩選基因的下游存在一個AhdI切 點，我們首先通過DNA點突變的方法在不改變氨基酸編碼的情況下突變掉AhdI切割位點。具體步驟如下1、原核TA克隆載體把TA位點引入pUC19載體構建成pUC19_TA載體；1. 1首先合成兩條含AhdI酶切位點的寡核苷酸，退火形成雙鏈DNA ；TA-oligo-s :5’ -P-AATTCACTAGTGGACATT/ATGTCTCGAGACATA/ATGTCGG-3’TA-o 1 i go-as 5，P-AATTCCGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCCACTAGTG-3 ’EcoRI酶切pUC19質(zhì)粒，與上述DNA雙鏈連接形成前T載體；序列如SEQ IDNo. 1所 示；如圖1所示。1.2制備間隔DNA引物aspp2-xhoI-s CCATCTCGAGCCCATCATACCCATCCAAGaspp2-xhoI-as TTCCTCGAGCGATACGCTCTGAGCCAG以本實驗室構建的pcDNA4_ASPP2(SEQ ID No. 11所示)為模板擴增，擴增片段中 不含常用的限制性酶切位點(BamHl，EcoRI，HindIII，NotI，XhoI, XbaI, ApaI等)，擴增序 列如SEQ ID No. 2所示；反應條件94°C 15秒，55°C 30秒，72°C 30秒擴增30個循環(huán)。1. 3)(h0I酶切步驟1. 2制備的間隔DNA后，插入到前T載體的BioI位點，該位點位 于兩個AhdI切點的中間(CTCGAG)；1. 4 設計突變引物 AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT, Ahdl-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT 把 ampicilin 抗性基因中的 AhdI 酶切位點 GACTCCCCGTC 突 變?yōu)镚ACTCCCCGTG，形成pUC19_TA前T載體，序列如SEQ ID No. 3所示。1. 5AhdI酶切pUC19-TA前T載體，回收大片段，即為pUC19_TA載體，第89堿基處 為開放性T末端，序列如SEQ ID No. 4所示。如圖2所示。2、把pUC19-TA載體的TA序列克隆入pcDNA4 His載體中得到pcDNA5_TA克隆載 體；2. 1以pUC19-TA前T載體(SEQ ID No. 3)為模板，擴增片段如SEQ ID No. 5所示， 引物為TA-HindIII-S :GCCGCGGGAAGCTtATATCACTAGTGAATTCTA-XbaI-AS :GGTCGACCTCTAGACGGCCGCGAATTCCGAC2. 2HindIII 和 XbaI 雙酶切 SEQ ID No. 5，定向連接到 pcDNA4 His vector 上，用 引物AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGATAhdl-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位點GACTCCCCGTC突變?yōu)镚ACTCCCCGTG，形 成pcDNA5-TA前T載體，如SEQ ID No. 6所示；2. 3AhdI 酶切上述pcDNA5-TA前T載體(SEQ ID No. 6)，回收大片段即為 pcDNA5_TA 載體，第946堿基處為開放性T末端，如SEQ ID No. 7所示，結(jié)構如圖3所示。3、把 pcDNA5-TA 前 T 載體(SEQ ID No. 6)上的 CMV-TA-poly A 序列經(jīng)PCR(94°C 15 秒，55°C 30秒，72°C 1分30秒擴增30個循環(huán))得到后克隆到pSEAP載體中構建成具有真 核表達功能并外分泌堿性磷酸酶(AP)的TA載體pcDNA5AP-TA，具體步驟
3. 1以pcDNA5-TA前T載體為模板，擴增片段，如SEQ ID No. 8所示，引物為CMV-NotI GCATGAAGCGGCCGCTTAGGGTTAGGCGTTpolyA-Notl :AGCTGGTTGCGGCCGCCTCAGAAGCCAT3. 2NotI酶切后，插入到pSEAP2_control載體上，測序驗證反向插入的為正確克 隆，引物為AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGATAhdI-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT3. 3 把 ampicilin 抗性基因中的 AhdI 酶切位點 GACTCCCCGTC 突變?yōu)?GACTCCCCGTG， 形成pcDNA5AP-TA前T載體，如SEQ ID No. 9所示；3. 4AhdI酶切回收大片段，即為pcDNA5AP-TA載體，第5245堿基處為開放性T末 端，如SEQ ID No. 10所示，結(jié)構如圖4所示。實施例2載體應用驗證1、所用弓丨物EGFP-s TAGTGGAAGCTTGACCATGGTGAGCAAGGGCGAG,
EGFP-as GCTTGGGATCCAATTCTTACTTGTACAGCTCG2、方法應用rTaq酶，以pCMS-EGFP載體(clontech)為模板擴增EGFP編碼片段。 應用實施例1構建的pcDNA5AP-TA載體實現(xiàn)TA克隆連接，測序驗證方向。轉(zhuǎn)染細胞 后，熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光，可見光分析儀檢測堿性磷酸酶分泌水平，發(fā)現(xiàn)兩者水平 呈正相關。3、結(jié)果如圖5所示，圖5為EGFP綠色熒光水平與SEAP-表達水平。從結(jié)果看出 上清的SEAP化學發(fā)光水平與目的基因EGFP (細胞顯綠色熒光)呈顯著正相關。當DNA轉(zhuǎn) 染濃度為SOOng時，60%的細胞有綠色熒光，同時SEAP的化學發(fā)光值較陰性對照升高了近 24 倍(5932288/250395)。
權利要求
1.一種分泌型堿性磷酸酶示蹤TA克隆真核表達載體，其特征在于，所述載體是在真核 表達啟動子(CMV)下游和BGH多聚腺嘌呤轉(zhuǎn)錄終止子的上游插入堿性磷酸酶示蹤TA克隆 位點。
2.根據(jù)權利要求1所述的分泌型堿性磷酸酶示蹤TA克隆真核表達載體，其特征在于， 所述載體的堿基序列如SEQ ID No. 10所示。
3.根據(jù)權利要求1所述的分泌型堿性磷酸酶示蹤TA克隆真核表達載體，其特征在于， 所述載體結(jié)構如圖4所示。
4.一種分泌型堿性磷酸酶示蹤TA克隆真核表達載體的構建方法，其特征在于，所述方 法包括下述步驟(1)原核TA克隆載體把TA位點引入pUC19載體構建成PUC19-TA載體；(2)把pUC19-TA載體的TA序列克隆入pcDNA4His載體中得到pcDNA5_TA克隆載體；(3)把pcDNA5-TA克隆載體上的CMV_TA-polyA序列經(jīng)PCR得到后克隆到pSEAP載體中 構建成具有真核表達功能并外分泌堿性磷酸酶(AP)的TA載體pcDNA5AP-TA。
5.根據(jù)權利要求4所述的分泌型堿性磷酸酶示蹤TA克隆真核表達載體的構建方法，其 特征在于，所述步驟(1)為1)首先合成兩條含AhdI酶切位點的寡核苷酸，退火形成雙鏈DNA；TA-oligo-s 5' P-AATTCACTAGTGGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCGG-3'；TA-oIigo—as 5 ’ P-AATTCCGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCCACTAGTG-3’EcoRI酶切pUC19質(zhì)粒，與上述DNA雙鏈連接形成前T載體；序列如SEQID No. 1所示；2)制備間隔DNA引物aspp2-xhoI-s CCATCTCGAGCCCATCATACCCATCCAAG aspp2-xhoI-as :TTCCTCGAGCGATACGCTCTGAGCCAG以pcDNA-ASPP2質(zhì)粒為模板擴增，如SEQ ID No. 11所示，擴增片段中不含常用的限制 性酶切位點，擴增序列如SEQ ID No. 2所示；3)BioI酶切步驟2)制備的間隔DNA后，插入到前T載體中；4)設計突變引物AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT, Ahdl-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT 把 ampicilin 抗性基因中的 AhdI 酶切位點 GACTCCCCGTC 突 變?yōu)镚ACTCCCCGTG，形成pUC19_TA前T載體，序列如SEQ ID No. 3所示。5)AhdI酶切pUC19-TA前T載體，回收大片段，即為pUC19_TA載體，第89堿基處為開放 性T末端，序列如SEQ ID No. 4所示。
6.根據(jù)權利要求4所述的分泌型堿性磷酸酶示蹤TA克隆真核表達載體的構建方法，其 特征在于，所述步驟為1)以pUC19-TA前T載體為模板，擴增片段如SEQID No. 5所示，引 物為:TA-HindIII-S GCCGCGGGAAGCTtATATCACTAGTGAATTCTA-XbaI-AS GGTCGACCTCTAGACGGCCGCGAATTCCGAC2)HindIII和XbaI雙酶切SEQID No. 5，定向連接到pcDNA4 His vector上，用引物AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGATAhdI-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位點GACTCCCCGTC突變?yōu)镚ACTCCCCGTG，形成 pcDNA5-TA 前 T 載體，如 SEQ ID No. 6 所示；3) AhdI酶切上述pcDNA5-TA前T載體，回收大片段即為pcDNA5_TA載體，第946堿基處 為開放性T末端，如SEQ ID No. 7所示。
7.根據(jù)權利要求4所述的分泌型堿性磷酸酶示蹤TA克隆真核表達載體的構建方法，其 特征在于，所述步驟(3)為1)以pcDNA5-TA前T載體為模板，擴增片段，如SEQID No.8所示，引物為 CMV-NotI GCATGAAGCGGCCGCTTAGGGTTAGGCGTTpo IyA-Not I AGCTGGTTGCGGCCGCCTCAGAAGCCAT2)NotI酶切后，插入到pSEAP2-Control載體上，測序驗證反向插入的為正確克隆，引物為AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT AhdI-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT3)把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位點GACTCCCCGTC突變?yōu)镚ACTCCCCGTG，形成 pcDNA5AP-TA前T載體，如SEQ ID No. 9所示；4) AhdI酶切回收大片段，即為pcDNA5AP_TA 載體，第5245堿基處為開放性T末端，如SEQ ID No. 10所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分泌型堿性磷酸酶示蹤TA克隆真核表達載體，其是在真核表達啟動子(CMV)下游和BGH多聚腺嘌呤轉(zhuǎn)錄終止子的上游插入堿性磷酸酶示蹤TA克隆位點。本發(fā)明所述載體可利用培養(yǎng)基上清進行檢測；可利用化學發(fā)光儀器進行檢測，不僅靈敏度高而且可以根據(jù)標準堿性磷酸酶的對照進行定量；發(fā)明人把目的基因插入位點改造成TA克隆載體位點，因此可以把PCR產(chǎn)物直接插入到報告基因載體，既節(jié)省了時間又節(jié)省了科研成本。
文檔編號C12N15/79GK102071213SQ201010107709
公開日2011年5月25日 申請日期2010年2月3日 優(yōu)先權日2010年2月3日
發(fā)明者喬錄新, 孫玉, 張洪海, 張玉林, 李寧, 陳德喜, 魏飛力 申請人:首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院