專利名稱：一種區(qū)分馬立克氏病病毒疫苗毒株與強(qiáng)毒株的鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物學(xué)領(lǐng)域，具體是一種區(qū)分馬立克氏病病毒疫苗毒株與強(qiáng)毒株的鑒別 方法。
背景技術(shù)：
馬立克氏病是由馬立克氏病病毒引起的一種具有高度傳染性、淋巴組織增生性腫 瘤疾病。近年來在國內(nèi)對馬立克氏病的預(yù)防主要是用保護(hù)效果比較好的馬立克氏病病毒血 清1型人工致弱毒的荷蘭毒株CVI988和中國哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的中國特有的自然弱 毒疫苗株814。存在的問題是首先雛雞在免疫之后的7-10天才產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫和體 液免疫應(yīng)答的能力，而一般情況下雛雞免疫完就暴露在可能存在馬立克氏病強(qiáng)毒株的環(huán)境 里，其次免疫接種不能阻止強(qiáng)毒感染和給雞提供完全保護(hù)，疫苗毒與強(qiáng)毒可以在雞體內(nèi)長 期共存。馬立克氏病病毒血清1型CVI988和814株的使用給馬立克氏病的確切診斷帶來 很大的困難，研究區(qū)分馬立克氏病病毒疫苗株與野毒株的鑒別診斷一直受到極大的關(guān)注。 CVI988株pp38基因上游啟動(dòng)子序列有連續(xù)5個(gè)核苷酸缺失，其它毒株包過814株沒有發(fā)現(xiàn) 這樣的缺失，針對這缺失區(qū)序列設(shè)計(jì)兩對引物，一對引物只能擴(kuò)增出CVI988，另外一對引物 能擴(kuò)增出除了 CVI988以外包過814的其它毒株，可以通過PCR方法把CVI988與其它包括 814在內(nèi)的毒株區(qū)別開，但未能將814株與其它強(qiáng)毒株區(qū)分開，因此在生產(chǎn)及科研上不能對 曾經(jīng)使用過814疫苗株的雞群進(jìn)行馬立克氏病確定性的診斷。通過實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測 雞外周血淋巴細(xì)胞馬立克氏病病毒基因組DNA載量證實(shí)強(qiáng)、弱毒株的復(fù)制動(dòng)力學(xué)存在一定 差別，作為馬立克氏病用于早期診斷的標(biāo)準(zhǔn)，但是這種方法比較難運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足本發(fā)明提供一種區(qū)分馬立克氏病病毒疫苗毒株與強(qiáng)毒 株的鑒別方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下1. 一種可用于區(qū)分馬立克氏病病毒疫苗毒株與強(qiáng)毒株的鑒別方法，采用PCR技 術(shù)，對馬立克氏病病毒血清1型疫苗株CVI988、814、CVI988回歸雞體內(nèi)一代分離株CVI988/ BP1 和特超強(qiáng)毒株 648A、超強(qiáng)毒株 G2、N 以及強(qiáng)毒株 YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、 GX070079、GX070092、GX080036、GX08005U GX080059 等 16 個(gè)毒株進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，并對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列的測定得到了確認(rèn)，具體操作步驟如下1)設(shè)計(jì)并合成引物根據(jù)GenBank登錄號為AF243438的馬立克氏病病毒Md5株的序列設(shè)計(jì)合成一對 引物，上游引物 USF CTAACCACAGCGTGTCTCC,下游引物 USR TGTATCTTTCCTCTGCCTTG,使用前 用超純水溶解，濃度為25pmol，置于-20°C保存?zhèn)溆茫?)毒株的處理從液氮中取出凍存毒株馬立克氏病病毒血清1型活疫苗CVI988和814株、CVI988回歸雞體內(nèi)一代分離毒CVI988/BP1株、10個(gè)強(qiáng)毒分離株分別為YL040920、GXY1、 GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059，迅速放入 37°C 水浴鍋使其融化，在室溫1500r/min的條件下離心5min，棄去上清，用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM lmL重新懸浮，進(jìn)行細(xì)胞基因組總DNA的提?。?)DNA 的提取a.抽提液的制備，將 pH8. 01mol/L Tris-Cl 4u L, pH8. 00. 5mol/L EDTA80 u L, 20 u g/ml 胰 RNA 酶 0. 8 ii L、重量濃度 10 % SDS 20 u L、20mg/mL 蛋白酶 K3 ii L 和超純水 42.2UL混合均勻，得到抽提液；b.取步驟2)的各細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮液250 iiL分別置于13個(gè)1.5mL離心管中，每管 加配制好的150 u L抽提液，混合均勻后置55°C水浴2小時(shí)；c.從水浴中取出消化后的樣品，在每管中加入飽和苯酚400 yL，充分震蕩搖勻后 在室溫12000r/min的條件下離心8分鐘；d.取上步驟的上清液400 ii L然后加入200 ii L的飽和苯酚和200 ii L的氯仿溶液， 震蕩搖勻后在室溫12000r/min的條件下離心8分鐘；e.取上步驟的上清液400 u L再加入體積40 y L pH5. 23mol/L的乙酸鈉和_20°C 條件下保存的無水乙醇800 y L，震蕩搖勻，然后在室溫12000r/min的條件下離心8分鐘；f.棄去上步驟的上清液，加入lmL 75%的酒精洗滌一次后，將所得核酸沉淀物放 在42°C烘箱內(nèi)烘干，得到DNA;g.在每管中加入20ii L的超純水，溶解DNA，獲得的DNA樣品置_20°C保存?zhèn)溆茫?)PCR反應(yīng)體系采用50 y L的反應(yīng)體系，在冰浴條件下，按下列試劑用量在16個(gè)PCR反應(yīng)管中 分別加入各成分10 XBuffer 5. 0uL,10mM dNTP 2. 0 y L，上、下游引物各 1. 0 y L，5U/y L Taq DNA聚合酶0. 5 y L，各個(gè)反應(yīng)管分別加入2. 0 y L的648A、G2、N株的基因組DNA和步驟 2)各樣品模板DNA，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至總體積為50y L ；4)PCR反應(yīng)條件將PCR反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行循環(huán)，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95°C預(yù)變性3min ；30個(gè) 循環(huán)94°C變性 30sec、60°C退火 30sec、72°C延伸 lmin ；72°C延伸 5min，得到 PCR 產(chǎn)物；5)PCR產(chǎn)物的檢測取8 ii L PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1 P L重量濃度10%溴酚藍(lán)染料混合，放入含溴化乙錠 0.5ug/mL重量濃度為瓊脂糖凝膠孔中，在80V電壓的條件下電泳1小時(shí)后，在紫外透 射儀下觀察PCR產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照、并記錄試驗(yàn)結(jié) 果；6)結(jié)果與判定在紫外燈下觀察并于標(biāo)準(zhǔn)分子量相對照，所有毒株都只擴(kuò)增出一條帶，CV1988、 814、CVI988/BP1、648A、G2、N、YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、 GX080036、GX080051、GX080059 出現(xiàn)的片段分別是 738bp、735bp、738bp、818bp、952bp、 951bp、968bp、972bp、974bp、968bp、970bp、966bp、970bp、1187bp、1185bp、1188bp。7) PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下切下步驟6)判定的片段，用SIGEMA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收；
8)PCR產(chǎn)物的克隆將PCR產(chǎn)物與載體pMD18-T Vector進(jìn)行連接，按常規(guī)方法將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感 受態(tài)細(xì)胞，挑取白色單個(gè)菌落接種至含氨芐青霉素培養(yǎng)基中，37°C恒溫震蕩增菌培養(yǎng)12 16h ；9)對步驟8)菌液PCR鑒定a.反應(yīng)體系的配制，在PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入lOXBuffer 5. 0 u L, 10mM dNTP2. 0 ii L，上、下游引物各1. 0 ii L，5U/ u L Taq DNA聚合酶0. 5 y L，步驟8)的菌液 1. 0 u L，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至總體積為50 y L ；b. PCR反應(yīng)條件與步驟4)相同、結(jié)果判定與步驟6)相同；10)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定與比較分析將步驟9)篩選到的陽性克隆交由廣州Irwitrogen有限公司和上海生物工程有限 公司進(jìn)行DNA序列測定，并把所測得序列在GenBank進(jìn)行Blast分析，確定PCR擴(kuò)增所得的 核苷酸序列屬于馬立克氏病病毒基因組。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較的益效是馬立克氏病病毒血清1型疫苗株與強(qiáng)毒株的致 病性差異很大，但是基因組很相似，CVI988和814疫苗株的使用給馬立克氏病的確切診斷 帶來很大的困難。本專利所建立的方法能區(qū)分馬立克氏病病毒疫苗CV1988和814株與強(qiáng) 毒株的鑒別方法。解決目前還未能解決的區(qū)分馬立克氏病病毒血清1型疫苗毒與強(qiáng)毒特別 是超強(qiáng)毒和特超強(qiáng)毒株的難題，可以對國內(nèi)外廣泛使用疫苗株CV1988以及814的養(yǎng)殖場進(jìn) 行腫瘤病毒的檢測與疾病的診斷以及實(shí)驗(yàn)研究中這些病毒株的相互鑒別。這對于調(diào)查雞群 出現(xiàn)馬立克氏病免疫失敗的原因、調(diào)查雞群早期感染強(qiáng)毒、疾病的流行病學(xué)以及臨床腫瘤 病的確切診斷、環(huán)境病毒的檢測和馬立克氏病的預(yù)防與控制均具有十分重要的意義及應(yīng)用 價(jià)值。


圖 1 是本發(fā)明具體實(shí)施例中 PCR 檢測 CV1988、814、CVI988/BP1、648A、G2、N、 YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、 GX080059毒株的電泳結(jié)果。圖中1 :DL2000bp Ladder DNA Marker ；2 :CVI988 ；3 814 ；4 :CVI988/BP1 ；5 648A ；6 :G2 ；7 :N ；8 :YL040920 ；9 :GXY1 ；10 :GXY2 ；11 :GXYL1 ；12 :GX070060 ；13 :GX070079 ； 14 :GX070092 ；15 :GX080036 ；16 :GX080051 ；17 :GX080059 ；18 :150bp Ladder DNAMarker。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。1)設(shè)計(jì)并合成引物根據(jù)GenBank登錄號為AF243438的馬立克氏病病毒Md5株的序列設(shè)計(jì)合成一對 引物，上游引物 USF CTAACCACAGCGTGTCTCC,下游引物 USR TGTATCTTTCCTCTGCCTTG,使用前 用超純水溶解，濃度為25pmol，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?)毒株的處理從液氮中取出凍存毒株馬立克氏病病毒血清1型活疫苗CVI988和814株、CVI988回歸雞體內(nèi)一代分離毒CVI988/BP1株、10個(gè)強(qiáng)毒分離株分別為YL040920、GXY1、 GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059，迅速放入 37°C 水浴鍋使其融化，在室溫1500r/min的條件下離心5min，棄去上清。用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM lmL重新懸浮，進(jìn)行細(xì)胞基因組總DNA的提取。3)DNA 的提取a.抽提液的制備，將 pH8. 01mol/L Tris-Cl 4 ii L、pH8. 00. 5mol/L EDTA80 u L, 20 u g/ml 胰 RNA 酶 0. 8 ii L、重量濃度 10 % SDS 20 u L、20mg/mL 蛋白酶 K3 ii L 和超純水 42.2UL混合均勻，得到抽提液；b.取步驟2)的各細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮液250 iiL分別置于13個(gè)1.5mL離心管中，每管 加配制好的150 u L抽提液，混合均勻后置55°C水浴2小時(shí)；c.從水浴中取出消化后的樣品，在每管中加入飽和苯酚400 yL，充分震蕩搖勻后 在室溫12000r/min的條件下離心8分鐘；d.取上步驟的上清液400 u L然后加入200 u L的飽和苯酚和200 u L的氯仿溶液， 震蕩搖勻后在室溫12000r/min的條件下離心8分鐘；e.取上步驟的上清液400 u L再加入體積40 ii L pH5. 23mol/L的乙酸鈉和_20°C 條件下保存的無水乙醇800 y L，震蕩搖勻，然后在室溫12000r/min的條件下離心8分鐘；f.棄去上步驟的上清液，加入lmL 75%的酒精洗滌一次后，將所得核酸沉淀物放 在42°C烘箱內(nèi)烘干，得到DNA;g.在每管中加入20 ii L的超純水，溶解DNA，獲得的DNA樣品置_20°C保存?zhèn)溆茫?)PCR反應(yīng)體系采用50 y L的反應(yīng)體系，在冰浴條件下，按下列試劑用量在16個(gè)PCR反應(yīng)管中 分別加入各成分10 XBuffer 5. 0uL,10mM dNTP 2. 0 y L，上、下游引物各 1. 0 y L，5U/y L Taq DNA聚合酶0. 5 y L，各個(gè)反應(yīng)管分別加入2. 0 y L的648A、G2、N株的基因組DNA和步驟 2)各樣品模板DNA，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至總體積為50yL。4) PCR反應(yīng)條件將PCR反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行循環(huán)，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95°C預(yù)變性3min ；30個(gè) 循環(huán)94°C變性 30sec、60°C退火 30sec、72°C延伸 lmin ；72°C延伸 5min，得到 PCR 產(chǎn)物。5)PCR產(chǎn)物的檢測取8 ii L PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1 P L重量濃度10%溴酚藍(lán)染料混合，放入含溴化乙錠 0.5ug/mL重量濃度為瓊脂糖凝膠孔中，在80V電壓的條件下電泳1小時(shí)后，在紫外透 射儀下觀察PCR產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照、并記錄試驗(yàn)結(jié)果。6)結(jié)果與判定在紫外燈下觀察并于標(biāo)準(zhǔn)分子量相對照，所有毒株都只擴(kuò)增出一條帶，CV1988、 814、CVI988/BP1、648A、G2、N、YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、 GX080036、GX080051、GX080059 出現(xiàn)的片段分別是 738bp、735bp、738bp、818bp、952bp、 951bp、968bp、972bp、974bp、968bp、970bp、966bp、970bp、1187bp、1185bp、1188bp。7) PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下切下步驟6)判定的片段，用SIGEMA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收；8)PCR產(chǎn)物的克隆
將PCR產(chǎn)物與載體pMD18-T Vector進(jìn)行連接，按常規(guī)方法將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感 受態(tài)細(xì)胞，挑取白色單個(gè)菌落接種至含氨芐青霉素培養(yǎng)基中，37°C恒溫震蕩增菌培養(yǎng)12 16h。9)對步驟8)菌液PCR鑒定a.反應(yīng)體系的配制，在PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入10 XBuffer 5. 0 u L, 10mM dNTP2. 0 ii L，上、下游引物各1. 0 ii L，5U/ u L Taq DNA聚合酶0. 5 y L，步驟8)的菌液 1. 0 u L，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至總體積為50 u L。b. PCR反應(yīng)條件與步驟4)相同、結(jié)果判定與步驟6)相同。10)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定與比較分析將步驟9)篩選到的陽性克隆交由廣州Irwitrogen有限公司和上海生物工程有限 公司進(jìn)行DNA序列測定，并把所測得序列在GenBank進(jìn)行Blast分析。確定PCR擴(kuò)增所得 的核苷酸序列屬于馬立克氏病病毒基因組。
權(quán)利要求
一種區(qū)分馬立克氏病病毒疫苗毒株與強(qiáng)毒株的鑒別方法，其特征在于，采用PCR技術(shù)對馬立克氏病病毒血清1型疫苗株CVI988、814、CVI988回歸雞體內(nèi)一代分離株CVI988/BP1和特超強(qiáng)毒株648A、超強(qiáng)毒株G2、N以及強(qiáng)毒株YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059等16個(gè)毒株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列的測定得到了確認(rèn)，具體操作步驟如下1)設(shè)計(jì)并合成引物根據(jù)GenBank登錄號為AF243438的馬立克氏病病毒Md5株的序列設(shè)計(jì)合成一對引物，上游引物USFCTAACCACAGCGTGTCTCC，下游引物USRTGTATCTTTCCTCTGCCTTG，使用前用超純水溶解，濃度為25pmol，置于-20℃保存?zhèn)溆茫?)毒株的處理從液氮中取出凍存毒株馬立克氏病病毒血清1型活疫苗CVI988和814株、CVI988回歸雞體內(nèi)一代分離毒CVI988/BP1株、10個(gè)強(qiáng)毒分離株分別為YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059，迅速放入37℃水浴鍋使其融化，在室溫1500r/min的條件下離心5min，棄去上清，用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 1mL重新懸浮，進(jìn)行細(xì)胞基因組總DNA的提?。?)DNA的提取a.抽提液的制備，將pH8.01mol/L Tris-Cl 4μL、pH8.00.5mol/L EDTA80μL、20μg/ml胰RNA酶0.8μL、重量濃度10％SDS 20μL、20mg/mL蛋白酶K3μL和超純水42.2μL混合均勻，得到抽提液；b.取步驟2)的各細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮液250μL分別置于13個(gè)1.5mL離心管中，每管加配制好的150μL抽提液，混合均勻后置55℃水浴2小時(shí)；c.從水浴中取出消化后的樣品，在每管中加入飽和苯酚400μL，充分震蕩搖勻后在室溫12000r/min的條件下離心8分鐘；d.取上步驟的上清液400μL然后加入200μL的飽和苯酚和200μL的氯仿溶液，震蕩搖勻后在室溫12000r/min的條件下離心8分鐘；e.取上步驟的上清液400μL再加入體積40μL pH5.23mol/L的乙酸鈉和-20℃條件下保存的無水乙醇800μL，震蕩搖勻，然后在室溫12000r/min的條件下離心8分鐘；f.棄去上步驟的上清液，加入1mL 75％的酒精洗滌一次后，將所得核酸沉淀物放在42℃烘箱內(nèi)烘干，得到DNA；g.在每管中加入20μL的超純水，溶解DNA，獲得的DNA樣品置-20℃保存?zhèn)溆茫?)PCR反應(yīng)體系采用50μL的反應(yīng)體系，在冰浴條件下，按下列試劑用量在16個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入各成分10×Buffer 5.0μL，10mM dNTP 2.0μL，上、下游引物各1.0μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，各個(gè)反應(yīng)管分別加入2.0μL的648A、G2、N株的基因組DNA和步驟2)各樣品模板DNA，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至總體積為50μL；4)PCR反應(yīng)條件將PCR反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行循環(huán)，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95℃預(yù)變性3min；30個(gè)循環(huán)94℃變性30sec、60℃退火30sec、72℃延伸1min；72℃延伸5min，得到PCR產(chǎn)物；5)PCR產(chǎn)物的檢測取8μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1μL重量濃度10％溴酚藍(lán)染料混合，放入含溴化乙錠0.5μg/mL重量濃度為1％瓊脂糖凝膠孔中，在80V電壓的條件下電泳1小時(shí)后，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照、并記錄試驗(yàn)結(jié)果；6)結(jié)果與判定在紫外燈下觀察并于標(biāo)準(zhǔn)分子量相對照，所有毒株都只擴(kuò)增出一條帶，CV1988、814、CVI988/BP1、648A、G2、N、YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059出現(xiàn)的片段分別是738bp、735bp、738bp、818bp、952bp、951bp、968bp、972bp、974bp、968bp、970bp、966bp、970bp、1187bp、1185bp、1188bp。7)PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下切下步驟6)判定的片段，用SIGEMA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收；8)PCR產(chǎn)物的克隆將PCR產(chǎn)物與載體pMD18-T Vector進(jìn)行連接，按常規(guī)方法將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取白色單個(gè)菌落接種至含氨芐青霉素培養(yǎng)基中，37℃恒溫震蕩增菌培養(yǎng)12～16h；9)對步驟8)菌液PCR鑒定a.反應(yīng)體系的配制，在PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入10×Buffer 5.0μL，10mM dNTP2.0μL，上、下游引物各1.0μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，步驟8)的菌液1.0μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至總體積為50μL；b.PCR反應(yīng)條件與步驟4)相同、結(jié)果判定與步驟6)相同；10)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定與比較分析將步驟9)篩選到的陽性克隆交由廣州Invitrogen有限公司和上海生物工程有限公司進(jìn)行DNA序列測定，并把所測得序列在GenBank進(jìn)行Blast分析，確定PCR擴(kuò)增所得的核苷酸序列屬于馬立克氏病病毒基因組。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種區(qū)分馬立克氏病病毒疫苗毒株與強(qiáng)毒株的鑒別方法。該方法采用PCR技術(shù)對馬立克氏病病毒血清1型疫苗株CVI988、814、CVI988回歸雞體內(nèi)一代分離株CVI988/BP1和特超強(qiáng)毒株648A、超強(qiáng)毒株G2、N以及強(qiáng)毒株YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059等16個(gè)毒株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列的測定得到了確認(rèn)。本發(fā)明所建立的方法可以對國內(nèi)外廣泛使用疫苗株CV1988以及814的養(yǎng)殖場進(jìn)行腫瘤病毒檢測與疾病診斷以及實(shí)驗(yàn)研究這些病毒株的相互鑒別。它對雞群早期感染強(qiáng)毒、疾病的流行病學(xué)以及臨床腫瘤病的確切診斷、環(huán)境病毒的檢測和馬立克氏病的預(yù)防與控制均具有十分重要的意義及應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12Q1/70GK101875978SQ20101010779
公開日2010年11月3日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者滕麗瓊, 韋平 申請人:廣西大學(xué)