專利名稱：：生物催化法生產(chǎn)他汀類藥物中間體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物催化法生產(chǎn)他汀類藥物中間體(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物的方法，以及生產(chǎn)過(guò)程中所用到的菌株。
背景技術(shù)：
：他汀類藥物是目前治療高血壓、高血脂等心血管疾病最有效的藥物。瑞舒伐他汀，又稱超級(jí)他汀，作為一種新型的療效更好的他汀類藥物，已日益受到人們的關(guān)注。但由于其手性側(cè)鏈的合成工藝還不完善，使其制備成本相比其他他汀類藥物要高出許多，所以銷售價(jià)格一直居高不下，制約了其市場(chǎng)的開(kāi)拓和發(fā)展，同時(shí)也妨礙了心血管疾病的有效控制和治療。因?yàn)樵谒☆愃幬锏暮铣珊椭苽涔に囍?，高光學(xué)純度(>99%)的手性側(cè)鏈的合成是關(guān)鍵步驟，同時(shí)也是難點(diǎn)，而其母體合成則相對(duì)比較簡(jiǎn)單。(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物作為合成瑞舒伐他汀側(cè)鏈的關(guān)鍵中間體，其合成的收率和光學(xué)純度的高低已成為整個(gè)瑞舒伐他汀合成工藝的瓶頸。如能以較少的步驟和較低的成本合成高光學(xué)純度的(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物，瑞舒伐他汀的合成將會(huì)更加完善，而且成本會(huì)大大降低。但是目前為止，手性純的(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物的合成還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)。利用傳統(tǒng)的化學(xué)合成的方法，由于(R)-3_羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物的碳鏈長(zhǎng)度比較短，而且含有羥基、羧基和酯基等活潑基團(tuán)，而化學(xué)反應(yīng)的條件又比較苛亥IJ，經(jīng)常需要高溫高壓，很容易破壞產(chǎn)物分子的結(jié)構(gòu)，所以化學(xué)方法不適合該產(chǎn)物的合成，也未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。在已報(bào)道的生物法制備中，主要是利用商品酶進(jìn)行催化轉(zhuǎn)化。例如，Jacobsen等利用商品化的脂肪酶、酯酶和α-糜乳蛋白酶等催化水解3-羥基戊二酸二乙酯來(lái)制備(R)-3-羥基戊二酸乙酯(JMolCatalB-Enzym,21:55_58；Tetrahedronlett.255235-5238)，但產(chǎn)率(80%)和產(chǎn)物的ee值(91%)都不是很高，更為重要的是商品酶的購(gòu)置成本很高，因此也不適合應(yīng)用于(R)_3-羥基戊二酸乙酯的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。腈化合物在自然界中大量的以無(wú)機(jī)腈和有機(jī)腈的形式存在。同時(shí)，其作為一種大宗商品也可以通過(guò)化學(xué)合成的方法生產(chǎn)得到。而從這些廉價(jià)的腈化合物出發(fā)可以制備高附加值、具有生物活性的有機(jī)酸類物質(zhì)。例如消旋的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯或其羥基取代衍生物的化學(xué)法制備工藝相當(dāng)成熟，而且成本低廉。而通過(guò)水解其分子結(jié)構(gòu)中的氰基，可以由4-氰基-3-羥基丁酸乙酯或其羥基取代衍生物制備得到(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物。但是同樣的該物質(zhì)分子中含有活潑的羥基、羰基和羧基，利用化學(xué)水解方法很容易產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的副產(chǎn)物，造成分離的困難。而通過(guò)微生物腈水解酶細(xì)胞選擇性催化水解4-氰基-3-羥基丁酸乙酯或其羥基取代衍生物可以一步制備得到高光學(xué)純度的(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物(反應(yīng)式見(jiàn)下)，該水解反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，條件溫和，而且腈水解酶的立體選擇性也非常高。然而，由于底物4-氰基-3-羥基丁酸乙酯或其羥基取代衍生物都含有一個(gè)酯基，而一般含水解酶微生物細(xì)胞中都會(huì)含有水解酯基的酯酶或脂肪酶，所以該生物催化劑的篩選也是一大難題，迄今為止，也未見(jiàn)該腈水解酶菌株的相關(guān)報(bào)道。這些因素使得光學(xué)純的(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物的合成難以實(shí)現(xiàn)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)手性拆分外消旋的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯或其羥基取代衍生物制備合成具有高光學(xué)活性的(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物的方法，并提供了一株從大自然的土壤及污水中篩選得到含有立體選擇性腈水解酶酶活且不含有水解4-氰基-3-羥基丁酸乙酯或其羥基取代衍生物中酯基的酯酶的紅平紅球菌新菌株。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種生物催化法生產(chǎn)(R)-3_羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物的方法，所述方法包括一種生物催化法生產(chǎn)(R)_3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物的方法，所述(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物結(jié)構(gòu)如式(I)所示，所述方法包括在以式(II)所示化合物為底物，以紅平紅球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo=M209194發(fā)酵培養(yǎng)獲得的酶為催化劑的反應(yīng)體系中，于1050°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到相應(yīng)的式(I)所示(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(II)式(I)、(II)中式(I)、(II)中R1為-H、-C(0)CH3、-C(0)CH2OCH3、-CH2OCH3(CH3)2(甲基異丙基醚)、TMDS(四甲基二硅醚)或TBDMS(叔丁基二甲基硅醚)。所述酶來(lái)自紅平紅球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo:M209194經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含酶菌體細(xì)胞。所述酶可直接以發(fā)酵液形式參與反應(yīng)，也可將發(fā)酵液過(guò)濾獲得的含酶菌體細(xì)胞加入反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，所述菌體細(xì)胞也可經(jīng)固定化后用于反應(yīng)。通常，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在pH7.O8.O的緩沖液中進(jìn)行。優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為120mmol/L，含酶菌體細(xì)胞初始濃度為1IOgDCW/L(干菌體濃度)。所述含酶菌體細(xì)胞由如下方法制備得到將紅平紅球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo=M209194接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C下振蕩培養(yǎng)13天，獲得含有含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖O20g，蛋白胨O10g，己內(nèi)酰胺O5g,K2HPO4O2.Og,MgSO4·7H20O0.5g,NaClO2g,FeSO4·7H20O0.2g，溶劑為水，pH38。所述分離純化方法如下反應(yīng)液離心，取上清液用1lOmol/L的HCl溶液調(diào)pH為24，再用乙酸乙酯或正己烷萃取15次，合并乙酸乙酯或正己烷有機(jī)相，減壓蒸餾蒸去乙酸乙酯或正己烷，即得到所述(R)_3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物。具體的，所述方法如下(1)將紅平紅球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo=M209194接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C下振蕩培養(yǎng)13天，獲得含有含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖020g，蛋白胨0IOg,己內(nèi)酰胺05g，K2HPO402.0g,MgSO4·7H2000.5g,NaCl02g,FeSO4·7H2000.2g，溶劑為水，pH38；(2)步驟(1)發(fā)酵液離心，取沉淀以生理鹽水洗滌13次，得到的菌體細(xì)胞用1050mmol/L、pH69的Tris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖液配制成1IOgDCW/L的菌懸液；(3)取步驟(2)菌懸液，加入底物(II)(4-氰基-3-羥基丁酸乙酯或其衍生物)至濃度為120mmol/L，于30°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心，取上清液用110mol/L的HCl溶液調(diào)pH為24，再用乙酸乙酯或正己烷萃取15次，合并乙酸乙酯或正己烷有機(jī)相，減壓蒸餾蒸去乙酸乙酯或正己烷，即得到所述(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物。本發(fā)明篩選獲得的新菌株為紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)ZJB-0910，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCCNo:M209244，保藏日期2009年10月26日。本發(fā)明涉及的另一株菌株為紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)ZJB-09149，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCCNo=M209194，保藏日期2009年9月4日，已在在先申請(qǐng)CN200910154891.5中作為新菌株予以保護(hù)。本發(fā)明利用一種腈水解酶的快速篩選方法，即鈷離子顯色法篩選得到的兩株目標(biāo)腈水解酶菌種，艮口RhodococcuserythropolisZJB-0910禾口RhodococcuserythropolisZJB-09149。其中ZJB-0910酶活較高。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化和16SrDNA鑒定，兩菌株均屬于紅球菌屬(Rhodococcus)的紅平(erythropolis)種。本發(fā)明菌株篩選方法如下用滅菌水將試樣配成懸浮液，取0.510.Oml懸浮液到裝有1100ml的富集培養(yǎng)基的三角瓶中，在2040°C，100300rpm的搖床上培養(yǎng)。每升富集培養(yǎng)基的成分為葡萄糖020g,K2HPO402.0g,MgSO4·7H2000.5g，NaCl02g，F(xiàn)eSO4·7H2000.2g，pH38，接種前加入經(jīng)過(guò)濾除菌的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯至0.052%。富集培養(yǎng)數(shù)天后，取產(chǎn)生渾濁的培養(yǎng)液再按上法依次循環(huán)培養(yǎng)05次，涂布至固體平板培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基成分除含13%的瓊脂外，其余與富集培養(yǎng)基成分相同。從平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接至1100ml發(fā)酵培養(yǎng)基，在2040°C，100300rpm的搖床上培養(yǎng)數(shù)天。每升發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為葡萄糖020g，蛋白胨010g，己內(nèi)酰胺05g,K2HPO402.0g,MgSO4·7H2000.5g,NaCl02g,FeSO4·7H2000.2g,溶劑為水，PH38。培養(yǎng)結(jié)束后，用0IOOOOrpm離心機(jī)離心020min，離心得到的樣品用00.8%的生理鹽水潤(rùn)洗13次，得到被測(cè)樣品。取該被測(cè)樣品溶于pH為69的Tris-HCl緩沖液中，最終樣品濃度為1IOgDCW/L(干菌體濃度)；添加底物4-氰基-3-羥基丁酸乙酯開(kāi)始反應(yīng)，使其終濃度為20150mmol/L。該反應(yīng)體系于2050°C下反應(yīng)，反應(yīng)30240min后，加入等體積的含Co2+離子濃度為10100mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(PH69)進(jìn)行顯色反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為120min。若反應(yīng)體系由品紅色變?yōu)辄S色，則表明該被測(cè)樣品含有能催化水解4-氰基-3-羥基丁酸乙酯氰基的腈水解酶；如顏色不變，則被測(cè)樣品中不含有該腈水解酶。陽(yáng)性菌株再用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行復(fù)篩，經(jīng)復(fù)篩確定該腈水解酶整體細(xì)胞沒(méi)有水解產(chǎn)物中的酯鍵。具體操作方法和條件為取反應(yīng)液lml,IOOOOrpm離心棄菌體細(xì)胞終止反應(yīng)，并得到上清液。取1020μ1該上清液進(jìn)樣作HPLC分析。分析條件為流動(dòng)相05%(ν/ν)的三乙胺溶液乙腈(41)，檢測(cè)波長(zhǎng)為220275nm，流速為12ml/min。在該條件下，產(chǎn)物(R)_3_羥基戊二酸乙酯的保留時(shí)間為4.05min(詳見(jiàn)圖1)。通過(guò)HPLC的復(fù)篩及驗(yàn)證后，確定以上兩株具有目標(biāo)腈水解酶活力的陽(yáng)性株RhodococcuserythropolisZJB-0910和ZJB-09149。取經(jīng)以上兩種經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體若干，用50mmolL—1、pH7.5的磷酸鹽緩沖液配成1IOgDCW/L的菌懸液。配制濃度為20mmolL—1的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯水溶液100ml，取520ml該底物溶液加入到520ml菌體溶液中，在1050°C、100200rpm條件下反應(yīng)60300min。反應(yīng)完畢后，IOOOOrpm離心得到上清液。HPLC分析得到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。然后用1ION的HCl溶液將上清液調(diào)成酸性，再用乙酸乙酯萃取15次，合并有機(jī)相。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在060°C條件下蒸去乙酸乙酯得到黃色液體。產(chǎn)物的比旋光度([a]D22)經(jīng)測(cè)定為_(kāi)1.9(c11.5，丙酮)，和文獻(xiàn)值對(duì)比確定其立體構(gòu)型為R型(JAmChemSoc，83:4228_4233，1961)。該產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)由紫外光譜、核磁共振1H和13C譜、ESI-MS和紅外光譜鑒定。從以上結(jié)果確定該產(chǎn)物為(R)-3-羥基戊二酸乙酯。該產(chǎn)物的ee值(^99%)利用正相色譜對(duì)經(jīng)衍生化后的差向異構(gòu)體分離后進(jìn)行測(cè)定(Chromatographia，71:85-89，2010)。該菌體細(xì)胞同樣適合于4-氰基-3-羥基丁酸乙酯β位羥基取代衍生物的立體選擇性水解，產(chǎn)物的產(chǎn)率用氣相色譜法分析。具體的，篩選方法如下(1)將用無(wú)菌水配制0.52%的土樣懸浮液和污水懸浮液，分別接種15ml到50ml富集培養(yǎng)基中，在30°C，150rpm的搖床上培養(yǎng)13天。富集培養(yǎng)基的成分為葡萄糖020g/L,K2HPO402.0g/L,MgSO4·7H2000.5g/L,NaCl02g/L,FeSO4·7H2000.2g/L，pH38。分裝后，在0.IMPa下滅菌1030min，接種前加入經(jīng)除菌過(guò)濾的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯至0.052%(ν/ν)0培養(yǎng)結(jié)束后，取產(chǎn)生渾濁的培養(yǎng)液再分別接種15ml到50ml富集培養(yǎng)基中，在30°C，150rpm的搖床上培養(yǎng)13天，如此循環(huán)35次。取長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較好的培養(yǎng)液涂布分離平板，30°C培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)13天。平板培養(yǎng)基成分除加入13%的瓊脂外，其余與富集培養(yǎng)基成分相同。(2)在平板培養(yǎng)基上挑取單菌落至50ml發(fā)酵培養(yǎng)基，在30°C，150rpm的搖床上培養(yǎng)13天。每L發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為葡萄糖020g，蛋白胨010g，己內(nèi)酰胺05g,K2HPO402.0g,MgSO4·7H2000.5g,NaClO2g，F(xiàn)eSO4·7H2000.2g，溶劑為水，pH38。培養(yǎng)結(jié)束后，用0IOOOOrpm離心機(jī)離心020min，離心得到的樣品用00.8%的生理鹽水潤(rùn)洗13次，得到的菌體用1050mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH69)配制成1IOgDCW/L(干菌體濃度)的菌懸液。(3)Co2+離子顯色法的具體操作步驟如下取步驟(2)中配制而成的1IOgDCff/L(干菌體濃度)的菌懸液10100μ1于96孔板中，添加底物4-氰基-3-羥基丁酸乙酯開(kāi)始反應(yīng)，使其終濃度為20150mmol/L。該反應(yīng)體系于2050°C下反應(yīng)，反應(yīng)30240min后，加入等體積的含Co2+離子濃度為10lOOmmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH69)進(jìn)行顯色反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為120min。在反應(yīng)過(guò)程中，若反應(yīng)體系由品紅色變?yōu)辄S色，則表明該被測(cè)樣品含有能催化水解4-氰基-3-羥基丁酸乙酯氰基的腈水解酶；如顏色不變，則被測(cè)樣品中不含有該腈水解酶。含陽(yáng)性菌的反應(yīng)液可用紫外分光光度計(jì)在370nm下連續(xù)測(cè)量其吸光度，并減去空白對(duì)照值，其陽(yáng)性菌的吸光度值介于0.20.8之間，用未加菌體的反應(yīng)液作為空白對(duì)照。(4)HPLC復(fù)篩及驗(yàn)證經(jīng)Co2+離子顯色法篩選得到的菌株按步驟(2)制成菌懸液。加入此菌懸液520ml于50ml的三角瓶中，添加底物4-氰基-3-羥基丁酸乙酯開(kāi)始反應(yīng)，使其終濃度為20150mmol/L。該反應(yīng)體系于2050°C下反應(yīng)，反應(yīng)60240min后，取Iml該反應(yīng)液在IOOOOrpm下離心棄菌體細(xì)胞終止反應(yīng)，并得到上清液。取1020μ1該上清液進(jìn)樣作HPLC分析。高效液相色譜儀的型號(hào)為L(zhǎng)C-IOA7(VP)(Shimadzu,Japan),色譜柱型號(hào)為HypersilODSC18(250mmX4.6mm，5μm)，紫外檢測(cè)器型號(hào)為Spd-10AVpplus(Shimadzu，Japan)。分析條件為流動(dòng)相:05%(ν/ν)的三乙胺溶液乙腈(41)，檢測(cè)波長(zhǎng)為220275nm，流速為12ml/min。在該條件下，產(chǎn)物(R)_3_羥基戊二酸乙酯的保留時(shí)間為4.05min(詳見(jiàn)圖1)。如果有產(chǎn)物吸收峰出現(xiàn)，那么就說(shuō)明該菌株確實(shí)為陽(yáng)性菌。(5)取篩選得到的兩株菌株做生理生化和分子鑒定。最后經(jīng)鑒定均為Rhodococcuserythropolis。(6)取經(jīng)以上兩種經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體若干，用50mmolΙ^、ρΗ7.5的磷酸鹽緩沖液配成1IOgDCW/L的菌懸液。配制濃度為20mmol廠1的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯水溶液100ml，取520ml該底物溶液加入到520ml菌體溶液中，在1050°C、100200rpm條件下反應(yīng)60300min。反應(yīng)完畢后，IOOOOrpm離心得到上清液。HPLC分析得到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。然后用110N的HCl溶液將上清液調(diào)成酸性，再用乙酸乙酯萃取15次，合并有機(jī)相。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在060°C條件下蒸去乙酸乙酯得到黃色液體。產(chǎn)物的比旋光度([a]D22)經(jīng)測(cè)定為_(kāi)1.9(c11.5，丙酮)，和文獻(xiàn)值對(duì)比確定其構(gòu)型為R型(JAmChemSoc，83:4228_4233，1961)。該產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)由紫外光譜、核磁共振1H和13C譜、ESI-MS和紅外光譜鑒定。從以上結(jié)果確定該產(chǎn)物為(R)-3-羥基戊二酸乙酯。產(chǎn)物的ee值經(jīng)測(cè)定為99%以上(Chromatographia，71:85_89，2010)。(7)配制各種不同的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的羥基取代衍生物溶于無(wú)水乙醇(濃度為0lOOmmolL—1)，然后取0.5ml加入到9.5ml含有菌體的磷酸鹽緩沖液(pH7.5，菌體濃度為1IOgDCW/L)開(kāi)始反應(yīng)。在1050°C、100200rpm條件下反應(yīng)612h。反應(yīng)結(jié)束后，IOOOOrpm離心得到上清液。GC分析得到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。(8)步驟(7)中反應(yīng)的各種產(chǎn)物的氣相色譜(GC)分析方法如下氣相色譜儀的型號(hào)為HP6890N,色譜柱型號(hào)為AT.FFAP毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度為320°C，檢測(cè)器溫度為320°C，柱溫升溫程序?yàn)?0°C開(kāi)始，以10°C/min的速率升至220°C，然后保持IOmin。載氣流速為lml/min。產(chǎn)物的ee值的測(cè)定方法與步驟(6)相同。本發(fā)明篩選得到的紅平紅球菌RhodococcuserythropolisZJB-0910和ZJB-09149為新發(fā)現(xiàn)的能手性拆分外消旋的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯來(lái)制備(R)_3_羥基戊二酸乙酯的腈水解酶菌株，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。同時(shí)，也首次報(bào)道了利用紅平紅球菌的腈水解酶細(xì)胞立體選擇性催化水解消旋的脂肪類β“羥基腈化合物或其衍生物為手性有機(jī)酸類物質(zhì)。該腈水解酶的發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了從消旋的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯或其羥基取代衍生物一步催化水解得到高光學(xué)純度的(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物，不水解底物中的酯基，不產(chǎn)生任何副產(chǎn)物，克服了傳統(tǒng)的合成方法如化學(xué)法在水解過(guò)程中所帶來(lái)的副產(chǎn)物多、目標(biāo)產(chǎn)物收率低和光學(xué)純度不高等缺點(diǎn)。由于產(chǎn)物(R)_3-羥基戊二酸乙酯無(wú)法購(gòu)買得到，因此本專利首次制備得到了高光學(xué)純度的(R)_3-羥基戊二酸乙酯(ee彡99%)，并對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。圖1為(R)-3-羥基戊二酸乙酯的高效液相色譜圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1運(yùn)用Co2+離子顯色法篩選能選擇性催化水解4-氰基-3-羥基丁酸乙酯為(R)-3-羥基戊二酸乙酯的腈水解酶菌株(1)將用無(wú)菌水配制1%的土樣懸浮液和污水懸浮液，分別接種5ml到45ml富集培養(yǎng)基中，在30°C，150rpm的搖床上培養(yǎng)2天。每升富集培養(yǎng)基的成分為葡萄糖5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H200.5g，NaCl0.lg，F(xiàn)eSO4·7H200.02g，溶劑為水，pH6.5。分裝后，在0.IMPa下滅菌20min，接種前加入經(jīng)除菌過(guò)濾的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯至(ν/ν)。培養(yǎng)結(jié)束后，取產(chǎn)生渾濁的培養(yǎng)液再分別接種Iml到49ml富集培養(yǎng)基中，在30°C，150rpm的搖床上培養(yǎng)2天，如此循環(huán)富集4次。取長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較好的培養(yǎng)液涂布分離平板，30°C培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)2天。平板培養(yǎng)基成分除加入2%的瓊脂外，其余與富集培養(yǎng)基成分相同。(2)在平板培養(yǎng)基上挑取單菌落至50ml發(fā)酵培養(yǎng)基，在30°C，150rpm的搖床上培養(yǎng)2天。每升發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為葡萄糖10g，蛋白胨5g，己內(nèi)酰胺2g，K2HPO40.5g,MgSO4·7Η200.2g，NaCllg，F(xiàn)eSO4·7Η200·02g，溶劑為水，pH6.8。在0.IMPa下滅菌20min。培養(yǎng)結(jié)束后，用IOOOOrpm離心機(jī)離心lOmin，離心得到的樣品用0.8%的生理鹽水潤(rùn)洗2次，得到的菌體用40mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)配制成10gDCW/L(干菌體濃度)的菌懸液。(3)Co2+離子顯色法的具體操作步驟如下取步驟(2)中配制而成的IOgDCW/L(干菌體濃度)的菌懸液100μ1于96孔板中，添加底物4-氰基-3-羥基丁酸乙酯開(kāi)始反應(yīng)，使其終濃度為40mmol/L。該反應(yīng)體系于35°C下反應(yīng)，反應(yīng)240min后，加入等體積的含Co2+離子濃度為lOmmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.0)進(jìn)行顯色反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為5min。在反應(yīng)過(guò)程中，若反應(yīng)體系由品紅色變?yōu)辄S色，則表明該被測(cè)樣品含有能催化水解4-氰基-3-羥基丁酸乙酯氰基的腈水解酶；如顏色不變，則被測(cè)樣品中不含有該腈水解酶。含陽(yáng)性菌的反應(yīng)液可用紫外分光光度計(jì)在370nm下連續(xù)測(cè)量其吸光度，并減去空白對(duì)照值，取吸光度最大樣品作HPLC復(fù)篩和驗(yàn)證，用未加菌體的反應(yīng)液作為空白對(duì)照。紫外分光光度計(jì)的型號(hào)為BeckmanDU800。(4)HPLC復(fù)篩及驗(yàn)證經(jīng)Co2+離子顯色法篩選得到的菌株按步驟(2)制成菌懸液。加入此菌懸液9ml于50ml的三角瓶中，添加底物4-氰基-3-羥基丁酸乙酯開(kāi)始反應(yīng)，使其終濃度為100mmol/L。該反應(yīng)體系于35°C下反應(yīng)，反應(yīng)240min后，取Iml該反應(yīng)液在IOOOOrpm下離心棄菌體細(xì)胞終止反應(yīng)，并得到上清液。取10μ1該上清液進(jìn)樣作HPLC分析。高效液相色譜儀的型號(hào)為L(zhǎng)C-IOA7(VP)(Shimadzu,Japan)，色譜柱型號(hào)為HypersilODSC18(250mmX4.6mm，5ym)，紫外檢測(cè)器型號(hào)為Spd-10AVpplus(Shimadzu,Japan)。分析條件為流動(dòng)相05%(ν/ν)的三乙胺溶液乙腈(41)，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，流速為lml/min。在該條件下，產(chǎn)物(R)_3_羥基戊二酸乙酯的保留時(shí)間為4.05(詳見(jiàn)圖1)。如果有產(chǎn)物吸收峰出現(xiàn)，那么就說(shuō)明該菌株確實(shí)為陽(yáng)性菌。(5)取篩選得到的兩株菌株做生理生化和分子鑒定。最后經(jīng)鑒定均為Rhodococcuserythropolis。實(shí)施例2生物催化劑R.erythropolisCCTCCNO:M209244細(xì)胞制備從本發(fā)明選育得到的新腈水解酶產(chǎn)生菌種R.erythropolisCCTCCN0=M209244的試管斜面上挑取一環(huán)菌體，接種至50ml無(wú)菌種子培養(yǎng)基中，在30°C，150rpm的搖床上培養(yǎng)24h，得種子液。每升種子培養(yǎng)基的成分為葡萄糖8g，蛋白胨5g，K2HPO40.5g,MgSO4·7H200.2g，溶劑為水，pH自然，在0.IMPa下滅菌20min。種子液以3%(ν/ν)接種量轉(zhuǎn)接至裝有100.Oml無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，150rpm的搖床上培養(yǎng)48h。每升發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為葡萄糖20g，蛋白胨10g，己內(nèi)酰胺IgjK2HPO40.5g，MgSO4·7Η200.2g，溶劑為水，pH7.0。在0.IMPa下滅菌20min。培養(yǎng)結(jié)束后，按實(shí)施例1制得菌懸液，干細(xì)胞濃度為(3.0g/L)，其中緩沖溶液由pH7.0的Tris-HCl換成pH7.5的磷酸鹽緩沖液(50mmol/L)。實(shí)施例3生物催化劑R.erythropolisCCTCCNO=M209149細(xì)胞制備該整體細(xì)胞催化劑的制備方式同實(shí)施例2。實(shí)施例4利用CCTCCNO:M209244細(xì)胞選擇性催化水解外消旋4_氰基_3_羥基丁酸乙酯為(R)-3-羥基戊二酸乙酯配制濃度為20mmolL—1的4_氰基-3-羥基丁酸乙酯水溶液100ml，取IOml該底物溶液加入到IOml按實(shí)施例2法制備得到的菌體溶液中，在30°C，ISOrpm條件下反應(yīng)240min。反應(yīng)結(jié)束經(jīng)檢測(cè)，(R)_3_羥基戊二酸乙酯(ee^99%)的轉(zhuǎn)化率為46.5%，說(shuō)明基本上(R)_4-氰基-3-羥基丁酸乙酯已經(jīng)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，而剩下的就是(S)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯。實(shí)施例5利用CCTCCNO:M209149細(xì)胞選擇性催化水解外消旋4-氰基-3-羥基丁酸乙酯為(R)-3-羥基戊二酸乙酯配制濃度為20mmolL—1的4_氰基_3_羥基丁酸乙酯水溶液100ml，取IOml該底物溶液加入到IOml按實(shí)施例3法制備得到的菌體溶液中，在30°C，ISOrpm條件下反應(yīng)240min。反應(yīng)結(jié)束經(jīng)檢測(cè)，(R)_3_羥基戊二酸乙酯(ee彡99%)的轉(zhuǎn)化率為35.6%。說(shuō)明利用該菌體細(xì)胞也能實(shí)現(xiàn)消旋的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的拆分，但轉(zhuǎn)化率不如CCTCCNo:M209244o實(shí)施例6產(chǎn)物(R)-3-羥基戊二酸乙酯的結(jié)構(gòu)表征取乙酸乙酯萃取后的產(chǎn)物，分別做紫外光譜、核磁共振1H和13C譜、ESI-MS和紅外光譜鑒定。產(chǎn)物的立體構(gòu)型采用測(cè)定比旋光度的方法來(lái)確定。紫外最大吸收波長(zhǎng)為220nm(水溶液中)，峰形規(guī)則光滑，沒(méi)有其他雜峰。1HNMR:1.30(3H,t)，2.58(2H，d)，2.62(2H，d)，4.20(2H，q)，4·50(lH，m)，13CNMR13.8,40.3,40.5,60.8,64.5，171.8，175.7。ESI-MS(正離子模式):[M+H]+，177.5;[M+Na]+，199.1；[M+K]+，214.0，產(chǎn)物的實(shí)際分子量為176.19。紅外光譜(IR)的結(jié)果為=3443.6(σ0Η),2985,2938(σC_H),1726(σc=0),1412(δ。H)，1213，1085(oc_。)。從測(cè)得的產(chǎn)物的比旋光度[[α]D22-1.9(c11.5，丙酮)]可以確定該產(chǎn)物構(gòu)型為R型(JAmChemSoc，83:4228_4233，1961)。從以上鑒定結(jié)果看，該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與(R)_3-羥基戊二酸乙酯相同，證明確實(shí)為(R)-3-羥基戊二酸乙酯。實(shí)施例711利用M209244菌體細(xì)胞立體選擇性催化水解4_氰基_3_羥基丁酸乙酯的各種羥基取代衍生物為相應(yīng)的產(chǎn)物酸配制各種不同的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的羥基取代衍生物溶于無(wú)水乙醇(濃度為IOOmmol廠1)，然后取0.5ml加入到9.5ml含有菌體的磷酸鹽緩沖液(pH7.5，菌體濃度為5gDCW/L)開(kāi)始反應(yīng)。在30°C、180rpm條件下反應(yīng)612h。反應(yīng)結(jié)束后，IOOOOrpm離心得到上清液。GC分析得到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求一種生物催化法生產(chǎn)他汀類藥物中間體(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物的方法，所述(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物結(jié)構(gòu)如式(I)所示，所述方法包括在以式(II)所示化合物為底物，以紅平紅球菌CCTCCNoM209244或CCTCCNoM209194發(fā)酵培養(yǎng)獲得的酶為催化劑的反應(yīng)體系中，于10～50℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到相應(yīng)的式(I)所示(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物；式(I)、(II)中R1為-H、-C(O)CH3、-C(O)CH2OCH3、-CH2OCH3(CH3)2、TMDS或TBDMS。FSA00000012111900011.tif2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述酶來(lái)自紅平紅球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo=M209194經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含酶菌體細(xì)胞。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在pH7.O8.O的緩沖液中進(jìn)行。4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為120mmol/L，含酶菌體細(xì)胞初始濃度為1IOgDCW/L。5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述含酶菌體細(xì)胞由如下方法制備得到將紅平紅球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo:M209194接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C下振蕩培養(yǎng)13天，獲得含有含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖O20g，蛋白胨O10g，己內(nèi)酰胺O5g，K2HP04O2.Og，MgSO4·7H20O0.5g，NaClO2g,FeSO4·7H20O0.2g，溶劑為水，pH38。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下反應(yīng)液離心，取上清液用1lOmol/L的HCl溶液調(diào)pH為24，再用乙酸乙酯或正己烷萃取15次，合并有機(jī)相，減壓蒸餾蒸去乙酸乙酯或正己烷得到所述(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)將紅平紅球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo=M209194接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C下振蕩培養(yǎng)13天，獲得含有含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖020g，蛋白胨0IOg,己內(nèi)酰胺05g，K2HPO402.0g,MgSO4·7H2000.5g，NaCl02g,FeSO4·7H2000.2g，溶劑為水，pH38；(2)步驟(1)發(fā)酵液離心，取沉淀以生理鹽水洗滌13次，得到的菌體細(xì)胞用1050mmol/L、pH69的Tris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖液配制成1IOgDCW/L的菌懸液；(3)取步驟(2)菌懸液，加入底物化合物(II)至濃度為120mmol/L，于30°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心，取上清液用1lOmol/L的HCl溶液調(diào)pH為24，再用乙酸乙酯或正己烷萃取15次，合并有機(jī)相，減壓蒸餾蒸去乙酸乙酯或正己烷，得到所述(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物。8.紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)ZJB-0910，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCCNo=M209244，保藏日期2009年10月26日。全文摘要本發(fā)明提供了一種通過(guò)手性拆分外消旋的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯或其羥基取代衍生物制備合成具有高光學(xué)活性的他汀類藥物中間體(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物的方法及菌株，所述方法包括在以式(II)所示化合物為底物，以紅平紅球菌CCTCCNoM209244或CCTCCNoM209194發(fā)酵培養(yǎng)獲得的酶為催化劑的反應(yīng)體系中，于10～50℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到式(I)所示化合物。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了從消旋的4-氰基-3-羥基丁酸乙酯或其羥基取代衍生物一步催化水解得到高光學(xué)純度的(R)-3-羥基戊二酸乙酯或其羥基取代衍生物，不水解底物中的酯基，不產(chǎn)生任何副產(chǎn)物，克服了傳統(tǒng)的合成方法如化學(xué)法在水解過(guò)程中所帶來(lái)的副產(chǎn)物多、目標(biāo)產(chǎn)物收率低和光學(xué)純度不高等缺點(diǎn)。文檔編號(hào)C12N1/20GK101805756SQ20101010748公開(kāi)日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年1月30日優(yōu)先權(quán)日2010年1月30日發(fā)明者沈寅初,董華平,鄭裕國(guó)申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)