專利名稱：一種食品過(guò)敏原甲殼類基因的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食品過(guò)敏源甲殼類基因的快速檢測(cè)技術(shù)，適合于食品過(guò)敏源甲殼 類基因成分的定性檢測(cè)。
背景技術(shù)：
食品過(guò)敏是食品引起的機(jī)體對(duì)免疫系統(tǒng)的異常反應(yīng)，多因人體對(duì)某些外來(lái)食品成 分的反應(yīng)過(guò)火或?qū)δ承┑鞍踪|(zhì)以及某些食品成分缺乏消化能力所致。常見的食品過(guò)敏與免 疫球蛋白E有關(guān)；而致敏物即為某些蛋白。食品過(guò)敏目前還沒有很好的治療手段。常見的 易過(guò)敏食品有甲殼類、花生、樹堅(jiān)果、雞蛋、牛奶、小麥制品、豆制品等，其中甲殼類海鮮食 品是最嚴(yán)重的過(guò)敏源之一。近年來(lái)針對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)在甲殼類基 因檢測(cè)方面得到的應(yīng)用，是目前甲殼類食品過(guò)敏源基因檢測(cè)的主要方法，目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng) 上已經(jīng)有了關(guān)于甲殼類食品過(guò)敏源基因檢測(cè)試劑盒，但是其檢測(cè)都需要數(shù)目較多且價(jià)格昂 貴的一系列儀器，尤其不適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)與基層單位的廣泛應(yīng)用；且容易造成假陽(yáng)性 等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確、靈敏、快速地檢測(cè)食品過(guò)敏原甲殼類基因的恒 溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。本發(fā)明提供一種食品過(guò)敏原甲殼類基因的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包括如下部分a) DNA 裂解液pH8. 0、濃度為lOmmol/L的Tris-HCl緩沖液，含有質(zhì)量濃度為1 %的chelex樹脂；b)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液包含正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、一條交叉擴(kuò)增引物、 1 X ThermoIbuffer、MgSO4、dNTPs、Bst DNA 聚合酶和無(wú)菌雙蒸水；其中所述的正向外圍引物序列為5，-GATTAAGTTACTTTAG-3，；所述的反向外圍引物序列為5，-GATTTAAAGGTCGAACAG-3，；所述的兩條探針的序列分別為5’ -TTCAACATCGAGGTCGC-3’ 和 5，-TGTCGATATGAACTCTC-3，，其中一條探針的5，端標(biāo)記生物素(Biotin)，另外一條探針5， 端標(biāo)記 FitC(FitC)；所述的交叉引物為5，-TTCAACATCGAGGTCGCTTTAGGGATAACAGCGT-3，；所述的IXThermol buffer 含有摩爾濃度為 20mM 的 Tris_HCl、10mM 的 KClUOmM 的(NH4) 2S04、2mM 的 MgSO4 以及質(zhì)量濃度為 0. 的 Triton X-100，pH 8. 8。所述恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，還包含陽(yáng)性對(duì)照模板，該陽(yáng)性對(duì)照模板為含有甲殼類 食品過(guò)敏源16S rRNA基因片段的質(zhì)粒。
本發(fā)明還提供用所述恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒檢測(cè)食品過(guò)敏原甲殼類基因的方法，包 括下列步驟a)用DNA裂解液從待檢測(cè)的標(biāo)本中提取DNA ；b)將步驟a)提取的DNA作為模板，加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，在 58°C下擴(kuò)增反應(yīng)80分鐘；對(duì)照PCR管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板和標(biāo)準(zhǔn)陰性模板，其中，陽(yáng)性 對(duì)照模板為含有甲殼類食品過(guò)敏源16S rRNA基因，所述陰性對(duì)照模板為無(wú)菌雙蒸水；c)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸防污染檢測(cè)裝置(申請(qǐng)?zhí)?200610109620. 4)中 進(jìn)行檢測(cè)，15min以后判讀結(jié)果，當(dāng)試紙條的檢測(cè)線呈陽(yáng)性時(shí)，說(shuō)明樣品中含有甲殼類食品 過(guò)敏源核酸。本試劑盒的工作原理在本發(fā)明提供本試劑盒中，有兩條外圍引物，一條交叉引物引物和兩條檢測(cè)探針。 本試劑盒中的5條寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的鏈置換特性，使得鏈置 換DNA合成不斷的自我循環(huán)。步驟b)的擴(kuò)增反應(yīng)中包含兩個(gè)階段第1階段為起始階段，任何一條引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)， 另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈。交叉引物可與本身置換出來(lái)的單鏈形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，形成發(fā)夾 狀結(jié)構(gòu)的單鏈，該結(jié)構(gòu)為基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。第2階段是擴(kuò)增循環(huán)階段，以發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)為模板，兩條探針可以與發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)中 的環(huán)結(jié)合，開始鏈置換合成反應(yīng)，解離出的由探針擴(kuò)增出來(lái)的單鏈可以重新解鏈成為擴(kuò)增 的模板。同時(shí)兩條探針可以形成一個(gè)雙鏈雜交復(fù)合物。當(dāng)擴(kuò)增出目的序列時(shí)，由于該目的序列上同時(shí)標(biāo)記了 Biotin和FitC，因此試紙條 的檢測(cè)線上呈陽(yáng)性。在本發(fā)明提供的食品過(guò)敏源甲殼類基因的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中，對(duì)不同的反應(yīng) 條件進(jìn)行了優(yōu)化，如引物和探針的濃度，Mg2+濃度，反應(yīng)溫度等的優(yōu)化，并將本發(fā)明與核酸檢 測(cè)試紙條檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，建立了食品過(guò)敏源甲殼類核酸恒溫?cái)U(kuò)增定性檢測(cè)的方法。該試劑 盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出10拷貝，可以滿足快速檢測(cè)甲殼類食品過(guò)敏源的要求。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果
1.特異性好，靈敏度高步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高；
2.反應(yīng)速度快，單個(gè)樣本從樣本處理到完成檢測(cè)，僅需2小時(shí)；
3.整個(gè)擴(kuò)增和檢測(cè)過(guò)程中不需要打開PCR管蓋，減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)
4.滿足高通量和低通量的樣品檢測(cè)；
5.整個(gè)反應(yīng)過(guò)程不需要復(fù)雜的儀器。
6.檢測(cè)成本大大降低，適于檢測(cè)一線或基層單位的應(yīng)用。


圖1表示本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)食品過(guò)敏源甲殼類核酸的靈敏度。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1食品過(guò)敏源甲殼類核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒組成與配制一 .試劑盒組成a) DNA提取試劑(裂解液):10mmol/L的Tris-HCl (ρΗ8· 0)，其中含有質(zhì)量濃度為 的chelex樹脂；b)反應(yīng)液兩條外圍引物(0.05μπιΟ1)，兩條探針(0. δμπιο )，和一條交叉引物 (0. 5 μ mol)，1 X Thermol buffer, MgSO4 (6mmol)，dNTPs 溶液(0. 4mmol)，Bst DNA 聚合酶 (IOU)和無(wú)菌雙蒸水組成。兩條外圍引物包括正向外圍引物序列為5，-GATTAAGTTACTTTAG-3’，反向外圍引物序列為5，-GATTTAAAGGTCGAACAG-3，。交叉引物5，-TTCAACATCGAGGTCGCTTTAGGGATAACAGCGT-3，。兩條探針的序列為分別為“5，-TTCAACATCGAGGTCGC-3，” 和 “5，-TGTCGATATGAACTCTC-3，”，其中一條探針的5，端標(biāo)記生物素(Biotin)，另外一條探針 5’端標(biāo)記FitC(異硫氰酸熒光素)。IXThermol buffer 的組成20mM 的 Tris-HCl (pH 8. 8)，IOmM 的 KCl，IOmM 的 (NH4)2S04,2mM 的 MgS04，質(zhì)量濃度為 0. 的 Triton X-100。所有的引物和探針均由上海生工生物有限公司合成。c)陽(yáng)性對(duì)照含有食品過(guò)敏源甲殼類16S rRNA基因[NCBI gene bank number C000219-1 (367-509)]的pUCm_Teasy載體，該載體可在大腸桿菌DH5 α中增殖。該載體的制備步驟利用兩條外圍擴(kuò)增引物以河蝦的基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò) 增獲得目的基因；用PR0MEGA的PCR純化試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；將純化后的擴(kuò) 增產(chǎn)物連接到質(zhì)粒中；將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，然后將該大腸桿菌DH5 α 進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)行質(zhì)粒提取。用分光光度計(jì)測(cè)A26tl定量并稀釋至IO6拷貝/ μ L，-20°C保存。d)陰性對(duì)照無(wú)菌超純水。實(shí)施例2用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)食品過(guò)敏源甲殼類核酸的具體方法a)用DNA裂解液從待檢測(cè)的標(biāo)本中提取DNA 在標(biāo)本試管中加入40 μ L的DNA提 取試劑，再往標(biāo)本試管中加0. 5-0. Ig的蝦片標(biāo)本，直接沸水浴lOmin，IOOOOg離心5min，上 清液為標(biāo)本DNA。b)取標(biāo)本DNA作為模板加入到裝有反應(yīng)液的PCR管中，在58°C進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)80min， 其中標(biāo)本DNA4 μ 1，反應(yīng)液16 μ L ；對(duì)照PCR管中分別加入陽(yáng)性對(duì)照模板和陰性對(duì)照模板。c)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸防污染檢測(cè)裝置中進(jìn)行檢測(cè)，15min以后判讀結(jié) 果。當(dāng)樣本中含有食品過(guò)敏源甲殼類核酸時(shí)，試紙條的檢測(cè)線上呈陽(yáng)性。反復(fù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明本試劑盒不同批次之間的檢測(cè) 結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。上述實(shí)施例說(shuō)明，用本發(fā)明的試劑盒來(lái)檢測(cè)重復(fù)性 好，且對(duì)樣本的檢測(cè)僅僅需要2小時(shí)就能完成，大大縮短檢測(cè)時(shí)間。同時(shí)本試劑盒只需要1 個(gè)人就可以完成所有的操作過(guò)程，可一次性檢測(cè)一個(gè)到數(shù)百個(gè)樣本，減少了人力的浪費(fèi)，節(jié) 約了綜合檢測(cè)成本。實(shí)施例3用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)食品過(guò)敏源甲殼類核酸的專一性
按照實(shí)施例2的方法檢測(cè)帶魚、跳魚、水蟾、青魚、草魚、龍蝦、小蝦米、蛤利、米蝦、 青蟹、河蝦、羅氏沼蝦、對(duì)蝦、河蟹是否含有甲殼類食品過(guò)敏源核酸。其結(jié)果如下表 注“ _ ”表示陰性，“ + ”表示陽(yáng)性從上表測(cè)試結(jié)果可見，用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)食品過(guò)敏源甲殼類核酸具有很強(qiáng)的專一性。實(shí)施例4用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)甲殼類食品過(guò)敏源核酸的靈敏度提取河蝦的DNA，對(duì)其進(jìn)行定量，分別稀釋至濃度為IO4拷貝/μ L、103拷貝/μ L、 IO2拷貝/ μ LUO1拷貝/ μ L，采用實(shí)施例2中所述方法來(lái)確定本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)甲殼 類食品過(guò)敏源核酸的靈敏度。結(jié)果如圖1所示，圖中1-4分別表示IO4拷貝/ μ L、103拷貝/ μ L、IO2拷貝/ μ L、 10拷貝/ μ L，5是陰性對(duì)照，可以發(fā)現(xiàn)該試劑盒可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出10個(gè)拷貝，具有很 高的靈敏度，可以滿足快速檢測(cè)甲殼類食品過(guò)敏源的要求。
權(quán)利要求
一種食品過(guò)敏原甲殼類基因的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征是包括如下部分a)DNA裂解液pH8.0、濃度為10mmol/L的Tris HCl緩沖液，含有質(zhì)量濃度為1％的chelex樹脂；b)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液包含正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、一條交叉擴(kuò)增引物、1×Thermolbuffer、MgSO4、dNTPs、Bst DNA聚合酶和無(wú)菌雙蒸水；其中所述的正向外圍引物序列為5’ GATTAAGTTACTTTAG 3’；所述的反向外圍引物序列為5’ GATTTAAAGGTCGAACAG 3’；所述的兩條探針的序列分別為5’ TTCAACATCGAGGTCGC 3’和5’ TGTCGATATGAACTCTC 3’，其中一條探針的5’端標(biāo)記生物素，另外一條探針5’端標(biāo)記FitC；所述的交叉引物為5’ TTCAACATCGAGGTCGCTTTAGGGATAACAGCGT 3’；所述的1×Thermol buffer含有摩爾濃度為20mM的Tris HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及質(zhì)量濃度為0.1％的Triton X 100，pH 8.8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食品過(guò)敏原甲殼類基因的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征是包 含陽(yáng)性對(duì)照模板，該陽(yáng)性對(duì)照模板為含有甲殼類食品過(guò)敏源16S rRNA基因片段的質(zhì)粒。
3.—種權(quán)利要求1的食品過(guò)敏原甲殼類基因的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒檢測(cè)食品過(guò)敏原 甲殼類基因的方法，其特征是包括下列步驟a)用DNA裂解液從待檢測(cè)的標(biāo)本中提取DNA；b)將步驟a)提取的DNA作為模板，加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，在58°C下 擴(kuò)增反應(yīng)80分鐘；對(duì)照PCR管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板和標(biāo)準(zhǔn)陰性模板，其中，陽(yáng)性對(duì)照模 板為含有甲殼類食品過(guò)敏源16S rRNA基因，所述陰性對(duì)照模板為無(wú)菌雙蒸水；c)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸防污染檢測(cè)裝置中進(jìn)行檢測(cè)，15min以后判讀結(jié)果，當(dāng) 試紙條的檢測(cè)線呈陽(yáng)性時(shí)，說(shuō)明樣品中含有甲殼類食品過(guò)敏源核酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種食品過(guò)敏原甲殼類基因的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。該試劑盒，包括DNA裂解液和恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液；所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液包括正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、一條交叉擴(kuò)增引物、1×Thermol buffer、MgSO4、dNTPs、Bst DNA聚合酶和無(wú)菌雙蒸水；本發(fā)明還提供用所述試劑盒檢測(cè)食品過(guò)敏原甲殼類基因的方法，包括下列步驟用DNA裂解液從待檢測(cè)的標(biāo)本中提取DNA；進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；檢測(cè)。該檢測(cè)方法準(zhǔn)確、靈敏，能夠快速地檢測(cè)食品過(guò)敏原甲殼類基因，適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101899501SQ20101010838
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者吳亞君, 吳斌, 尤其敏, 張睿, 徐高連, 楊海榮, 沈崇鈺, 石建華, 祝長(zhǎng)青, 胡林, 蔣原, 袁飛, 邵景東, 陳穎 申請(qǐng)人:江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心;中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所;杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司