基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌的方法、其引物組合物及檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利說明】基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌的方 法、其引物組合物及檢測(cè)試劑盒 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明基因檢測(cè)診斷領(lǐng)域，具體涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)胡蘿卜軟 腐果膠桿菌的方法，其涉及的引物組合物、所述引物組合物的應(yīng)用及胡蘿卜軟腐果膠桿菌 的檢測(cè)試劑盒。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum)是引起蔬菜細(xì)菌性軟腐病 的一種世界性流行病害，其宿主范圍十分廣泛，可以引起多種園藝作物例如芹菜、胡蘿卜、 番茄、黃瓜、馬鈴薯、甜瓜等發(fā)生軟腐病并帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于胡蘿卜軟腐果膠桿菌 的致病性較強(qiáng)，病害一但發(fā)生很難防治，且市場(chǎng)上缺乏針對(duì)細(xì)菌性軟腐病的專一性殺菌劑， 因此目前該病害的防治以預(yù)防為主。對(duì)于預(yù)防病害的發(fā)生，早期的病原菌檢測(cè)技術(shù)顯得尤 為重要。
[0003] 植物病原微生物檢測(cè)通常采用形態(tài)學(xué)、生理生化及分子技術(shù)手段。隨著生物信息 及DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，分子檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用正在向檢測(cè)廣度及深度多層次進(jìn)行深入。目 前常用的病原菌分子檢測(cè)技術(shù)包括：普通PCR、熒光定量PCR、免疫測(cè)定法等。這些檢測(cè)技術(shù) 的應(yīng)用通常因昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器及苛刻的實(shí)驗(yàn)條件而受到一定的限制，很難實(shí)現(xiàn)病害病原微 生物的田間現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
[0004] 目前用于檢測(cè)軟腐果膠桿菌的方法包括普通PCR、巢式PCR及熒光定量PCR等，該 類檢測(cè)方法需要依賴精密的溫度循環(huán)裝置，檢測(cè)過程復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不能滿足病原菌 快速檢測(cè)的需要。
[0005] 例如中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)CN 102559901A公開了一種特異性檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠 桿菌的PCR方法，以致病菌果膠裂解酶基因特異的引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后 電泳鑒定。并公開其特異性引物包括正向引物：5' -CTATAGCGGTAATGAAG-3'，反向引物： 5' -TTACCGACGCCAGCATAG-3'。
[0006] 然而，該技術(shù)中所用引物未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，也沒有對(duì)引物進(jìn)行靈敏性檢測(cè)，且特異 性檢測(cè)中僅涉及了 3種其它對(duì)照菌株，其靈敏性及特異性存在爭(zhēng)議。而且，其PCR擴(kuò)增方法 只能對(duì)菌株提取后的DNA進(jìn)行檢測(cè)，不能實(shí)現(xiàn)菌懸液的直接檢測(cè)。更重要的是該方法檢測(cè) 所需要的時(shí)間在2小時(shí)以上，擴(kuò)增產(chǎn)物不能直接目視檢測(cè)，必須通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行 檢測(cè)，操作繁復(fù)。
[0007] 2000年，日本榮研化學(xué)株式會(huì)社開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法即環(huán)介導(dǎo)等 溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-Mediated IsothermalAmplification，LAMP)，其特點(diǎn)是針對(duì)革E基因的 6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（63°C左右）保溫60分 鐘左右，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP反應(yīng)的結(jié)果可以通過電泳檢測(cè)形成梯形條帶，也可以 通過加入不同種類的核酸染料進(jìn)行目視觀察。然而，目前尚缺乏將LAMP技術(shù)應(yīng)用于胡蘿卜 軟腐果膠桿菌檢測(cè)的技術(shù)的設(shè)想及驗(yàn)證。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0008] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，針對(duì)現(xiàn)有的胡蘿卜軟腐果膠桿菌的生物學(xué)檢 測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、準(zhǔn)確性差等缺陷，并針對(duì)PCR檢測(cè)技術(shù)必須依賴熱循環(huán)儀器、因 此無法快速檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌從而存在推廣困難的問題，提供了一種胡蘿卜軟腐果 膠桿菌的新型檢測(cè)方法及實(shí)現(xiàn)該方法的特異性引物及檢測(cè)試劑盒。
[0009] 本發(fā)明基于將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用至胡蘿卜軟腐果膠桿菌檢測(cè)的思路，提供 了用于檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovor um)的引物組合物，所述引 物組合物由以下組成：
[0010] 正向內(nèi)引物 FIP: 5 ' -CCTGAGAGCCGGCTTTCAGCTGCTGACGCCGAAAGAGT-3 '，
[0011] 反向內(nèi)引物 BIP: 5' -CCTGGAACGATGACCCGTCTTCCTTGTGACGCAGATTGTGGA-3'，
[0012] 正向外引物 F3:5 ' -GCTGGATGACAAGCCAGTG-3 '，
[0013] 反向外引物 B3:5' -CGGATGCGGTCTTTCCCTA-3'，
[0014] 環(huán)引物 LOOP: 5 ' -ACCAGGCGGGACAGTATCG-3 '。
[0015] 本發(fā)明還涉及上述引物組合物在檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌中的應(yīng)用。
[0016] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供上述引物組合物在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中檢測(cè)軟腐果膠桿 菌的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明還提供一種胡蘿卜軟腐果膠桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)試劑盒，所述 試劑盒含有上述的引物組合物。
[0018] 優(yōu)選地，所述試劑盒包含檢測(cè)溶液以及熒光染料；其中，所述檢測(cè)溶液含有40 μΜ 正向內(nèi)引物FIP、40yM反向內(nèi)引物ΒΙΡ、5μΜ正向外引物F3、5yM反向外引物Β3、20μΜ 環(huán)弓丨物 L00P、0.23mM dNTPs、0.83mM Tris - HCl(pH8.8)、0.41mM KCl、0.33mM MgS04、 0· 41mM(NH4)2S04、33. 3mM 三甲銨乙內(nèi)酯、0· 2wt% Tween20、8U Bst DNA 聚合酶。
[0019] 在本發(fā)明中，所述熒光染料可采用鈣黃綠素。
[0020] 本發(fā)明的試劑盒具有良好的特異性和敏感度，特別對(duì)胡蘿卜軟腐果膠桿菌DNA樣 本的檢測(cè)靈敏度達(dá)到I. 92X 10 3ng/μ 1，或?qū)}卜軟腐果膠桿菌菌懸液的檢測(cè)靈敏度達(dá) 到 1. 27 X 104cfu/ml〇
[0021] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌的方法，取待檢微生物DNA或菌懸 液，以該DNA或菌懸液為模板，通過上述引物組合物及含有所述引物組合物的檢測(cè)溶液進(jìn) 行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，通過擴(kuò)增結(jié)果得到檢測(cè)結(jié)果。
[0022] 優(yōu)選地，在進(jìn)行上述檢測(cè)時(shí)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為63°C，60min。
[0023] 本發(fā)明還提供胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種pmrA基因序列作為靶標(biāo)在環(huán)介導(dǎo) 等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中檢測(cè)軟腐果膠桿菌的應(yīng)用。
[0024] 以下將更詳細(xì)地闡述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0025] 1、提取病原菌總DNA和植物總DNA
[0026] 采用細(xì)菌DNA提取試劑盒（購(gòu)買自北京天根公司）提取胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿 卜亞種病原菌總DNA，利用離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒（購(gòu)買自北京天根公司）由 發(fā)病植株組織提取總DNA，提取DNA保存于-20°C備用。
[0027] 2、特異性引物設(shè)計(jì)
[0028] 為避免LAMP反應(yīng)中出現(xiàn)假陽性結(jié)果或?qū)Ψ悄繕?biāo)菌株產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，本發(fā)明 通過系統(tǒng)分析胡蘿卜軟腐果膠桿菌的總基因組序列信息，篩選并明確采用胡蘿卜軟腐果 膠桿菌胡蘿卜亞種特異性PmrA基因序列作為靶標(biāo)，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件http:// primerexplorer. jp/e/針對(duì)該序列設(shè)計(jì)了胡蘿卜軟腐果膠桿菌特異性LAMP引物組。通過 Blastn program (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)比較所設(shè)計(jì)的引物序列與 其它生物種屬?zèng)]有顯著同源性。上述各引物在胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種特異性PmrA 基因序列上的具體位置如下：
[0029] 表1:引物序列信息
[0031] 其中正向外引物F3和反向外引物B3在普通PCR反應(yīng)及熒光定量PCR反應(yīng)下擴(kuò) 增片段大小為17〇bp。胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)的pmrA基因序列已向公眾公開，在GenBank中的登錄號(hào)為 AB447882. 1。
[0032] 3、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（LAMP反應(yīng)）
[0033] LAMP反應(yīng)體系為：總體系為25 μ 1，其中濃度為20 μ mol/L的正向內(nèi)引物FIP和反 向內(nèi)引物BIP各2 μ 1、濃度為10 μ mol/L的環(huán)引物L(fēng)OOP 2 μ 1、濃度為10 μ mol/L的正向外 引物 F3 和反向外引物 B3 各 0· 5 μ 1、0· 23mM dNTPs、0. 83mMTris - HCl (ρΗ8· 8)、0· 41mMKCl、 0.33mMMgS04、0. 4ImM (NH4)2SO4'33. 3mMBetaine(三甲銨乙內(nèi)酯）、0· 2% Tween20、8U Bst DNA聚合酶I μ I (BstDNAPolymerase)、鈣黃綠素核酸染料I μ 1，加入超純凈水制備得到。 LAMP反應(yīng)程序?yàn)椋汉銣?3°C，60min。
[0034] 4、胡蘿卜軟腐果膠桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒的制備
[0035] 基于胡蘿卜軟腐果膠桿菌LAMP檢測(cè)技術(shù)的試劑盒包括胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿 卜亞種標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液。
[0036] 標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行DNA提取獲 得。
[0037] 本發(fā)明提供的胡蘿卜軟腐果膠桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒，針對(duì)胡蘿卜軟腐果膠桿菌 胡蘿卜亞種特異性PmrA基因設(shè)計(jì)引物。采用恒溫裝置，可用于胡蘿卜軟腐果膠桿菌靈敏、 快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。此LAMP檢測(cè)方法多次重復(fù)試驗(yàn)誤差值小，復(fù)現(xiàn)性良好，引物組合物的檢 測(cè)靈敏度極限為〇. 19fg/ μ L菌株DNA。
[0038] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0039] 1)特異性高，鑒定速度快
[0040] 引物擴(kuò)增胡蘿卜軟腐果膠桿菌的特異性序列，LAMP檢測(cè)特異性高。普通PCR及 熒光定量PCR的檢測(cè)周期需要2h以上，本發(fā)明擴(kuò)增全程僅需60min，檢測(cè)速度快，明顯優(yōu)于 PCR方式。
[0041] 2)操作簡(jiǎn)便、成本低廉
[0042] 與傳統(tǒng)PCR相比，本發(fā)明的LAMP檢測(cè)方法結(jié)果不需要進(jìn)一步進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)，在反應(yīng)前添加鈣黃綠素?zé)晒馊玖峡梢灾苯邮菇Y(jié)果可視化，操作更加簡(jiǎn)單。此外該LAMP 檢測(cè)只需要在恒溫裝置上便能完成反應(yīng)，不需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，檢測(cè)成本低廉。
[0043] 3)實(shí)用性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣
[0044] 可以檢測(cè)多種植物發(fā)病組織總DNA中的胡蘿卜軟腐果膠桿菌，且可對(duì)胡蘿卜軟腐 果膠桿菌菌懸液進(jìn)行直接檢測(cè)，為病害的田間直接診斷奠定基礎(chǔ)，且為病害的早期預(yù)測(cè)預(yù) 報(bào)提供方法和依據(jù)。 【【附圖說明】】
[0045] 圖1為引物組合物特異性檢測(cè)的結(jié)果；
[0046] 其中，LAMP擴(kuò)增曲線中縱軸為渾濁度，橫軸為反應(yīng)時(shí)間；
[0047] 其中，1-28為胡蘿卜軟腐果膠桿菌DNA (菌株編號(hào)見表2) ;29~31為黃單胞桿菌、 32-33為丁香假單胞桿菌、34為菊苣假單胞桿菌、35為菊歐文式菌、36為密執(zhí)安棒形桿菌、 37為勞爾氏菌、38為是嗜酸菌屬甜瓜種、39為茄病鐮刀菌、40為核盤菌、41為芹菜尾孢菌的 對(duì)應(yīng)DNA、42為無菌水對(duì)照；
[0048] 圖2為引物組合物靈敏性檢測(cè)的結(jié)果；
[0049] 其中，LAMP擴(kuò)增曲線中縱軸為渾濁度，橫軸為反應(yīng)時(shí)間；
[0050] 其中，1-8為軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種的DNA，濃度分別為I. 92X IO1ng/ μ 1-5. 8 X 10 6ng/ μ I ;N為無菌水對(duì)照；
[0051] 圖3為芹菜組織中胡蘿卜軟腐果膠桿菌的LAMP檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 2%瓊脂糖凝 膠中進(jìn)行電泳的結(jié)果；
[0052] 其中，1-3為分別為北京、河北、河南田間采集得到的芹菜軟腐病病樣組織總DNA， 4-10為接種不同病原菌的芹菜發(fā)病組織總DNA(菌株編號(hào)見表3)，11為健康芹菜組織DNA， M為5000bp