一種改進型恒溫指數(shù)擴增技術(shù)及其在microRNA檢測中的應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子檢測領域，具體涉及一種改進型恒溫指數(shù)擴增技術(shù)及其在 mi croRNA檢測中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 恒溫指數(shù)擴增反應（Isothermal Exponential Amplification Reaction，EXPAR) 技術(shù)是由D. J. Galas等在2003年建立起來的一種基于DNA聚合酶和切口酶設計的高效核 酸擴增技術(shù)。該技術(shù)的原理如圖1所示：應用一條中間包含切口酶識別序列，3'端與5'端 序列完全相同的模板，當引物與模板的3'端雜交后，在聚合酶的作用下進行線型擴增。擴 增后，內(nèi)切酶識別并切割5'端擴增出來的片段，該片段在DNA聚合酶的鏈置換作用下被釋 放出來，進一步與另一條模板的3'端進行雜交和擴增，形成指數(shù)形式的擴增。該方法可以 在恒溫條件下對短鏈核酸（10-25堿基）進行高效、快速的指數(shù)擴增，一般在幾分鐘內(nèi)可對 目標核酸放大1〇 6_1〇9倍。與PCR擴增技術(shù)相比，恒溫指數(shù)擴增方法所需時間短，不需要精 確的熱循環(huán)裝置，其擴增倍數(shù)足以與PCR技術(shù)媲美。因此，恒溫指數(shù)擴增反應技術(shù)已被廣泛 應用于短核酸的檢測，特別是對microRNA (miRNA)的定量分析。
[0003] MiRNA是一類對基因表達具有調(diào)控作用的非編碼小分子RNA( 18-24堿基)。它在動 植物生長、發(fā)育、分化和生殖等過程中發(fā)揮著重要作用。人類約30%的基因受miRNA調(diào)控， 且miRNA的表達水平與人類重大疾病密切相關。對miRNA的定量檢測有助于深入理解其作 用機制，對疾病的診斷與治療以及相關基因藥物的開發(fā)等具有重要意義。由于miRNA的序 列短，在細胞或者體液內(nèi)的表達水平非常低、易降解且同源miRNA之間僅相差1-2個堿基， 一般方法難以實現(xiàn)檢測。Northern印跡技術(shù)是當前分析miRNA的標準方法，但該方法操作 繁瑣、耗時長、靈敏度低，分析檢測時需要大量的樣品及分離富集步驟，且對RNase污染非 常敏感，實驗中任何一步操作不當都會影響分析結(jié)果。Microarray方法可實現(xiàn)高通量、多 組分miRNA同時檢測，但該方法的特異性和靈敏度較低，并且微陣列芯片的制備和檢測成 本很高。RT-PCR是靈敏檢測miRNA的有效方法，但由于miRNA序列短，不適合直接使用PCR 擴增，需要依賴多種技術(shù)先將miRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行擴增，導致方法操作復雜，耗時長； 另外該方法需要精確的控溫儀器，增加測定成本。恒溫擴增檢測miRNA的方法如滾環(huán)擴增 (RCA)、線性擴增、指數(shù)擴增(EXPAR)等由于能在恒溫條件下獲得高效的擴增，成為研究和應 用熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 由于現(xiàn)有的恒溫指數(shù)擴增反應中的擴增模板的5'端和3'端的序列完全相同，弓丨 物在兩端雜交的幾率和速率也相同。雜交在3'端的引物能夠正常擴增，而雜交在5'端的 引物無法擴增，因此，常規(guī)的恒溫指數(shù)擴增反應損失了 50%的擴增效率。本發(fā)明通過對現(xiàn)有 指數(shù)擴增技術(shù)進行改進，抑制引物在擴增模板5'端的雜交，從而提高恒溫指數(shù)擴增反應的 擴增效率，目標建立一種更為快速、高效和靈敏的恒溫指數(shù)擴增技術(shù)并應用于短鏈核酸的 靈敏檢測。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種改進型恒溫指數(shù)擴增模板，其包括3'端序列、5'端序列，以及3'端序列和5'端 序列之間的切口酶識別序列；所述3'端序列和5'端序列相同，均與待檢核酸序列互補；5' 端序列至少有一個堿基上修飾有biotin。
[0006] 進一步地，優(yōu)選在5'端序列l(wèi)-10bp的至少一個堿基上修飾biotin。
[0007] 更進一步地，優(yōu)選在5'端序列第2個堿基上修飾biotin。
[0008] -種用于檢測miRNA let_7a的恒溫指數(shù)擴增模板，其序列為： 5'-AACTATACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3'，其第 1-23 bp 至少有一個堿基修飾有biotin。
[0009] 進一步地，優(yōu)選在其序列的第1-10 bp的至少一個堿基上修飾biotin。
[0010] 更進一步地，優(yōu)選在5'端序列第2個堿基上修飾biotin。
[0011] -種改進型恒溫指數(shù)擴增試劑盒，其包括： (1) 恒溫指數(shù)擴增模板； (2) DNA聚合酶； (3) 內(nèi)切酶； (4) 鏈酶親和素。
[0012] 進一步優(yōu)選地，所述試劑盒中還包括：dNTP、SYBR Green I熒光染料、酶緩沖液。
[0013] 一種改進型恒溫指數(shù)擴增技術(shù)，包括如下步驟： (1) 將恒溫指數(shù)擴增模板、dNTP、RNase抑制劑、待檢樣品和鏈酶親和素混合制成A反應 液； (2) 將DNA聚合酶、內(nèi)切酶、SYBR Green I熒光染料混合制成B反應液； (3) 將A反應液和B反應液混合后進行指數(shù)擴增反應； (4) PCR儀上監(jiān)控擴增曲線，求得P0I值，根據(jù)建立的標準曲線求得目標核酸序列的濃 度。
[0014] 指數(shù)擴增反應體系含有：0. 5XNt. BstNBI緩沖液、0. 1 y M恒溫指數(shù)擴增模板、250 yMdNTP、0. 8 U/yL RNase抑制劑、待檢樣品、0. 2 yM鏈酶親和素SA、lXThermoPol聚合酶 緩沖溶液、0.05 U/yL Vent(exo-)聚合酶、0.4 U/yL 切 口酶、0.4XSYBR Green I 熒光染 料、DEPC水；所述0? 5XNt. BstNBI 緩沖液含有：25 mMtris-HCl, pH 7. 90, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl, 0. 5 mM EDTA ;所述 lXThermoPol 聚合酶緩沖溶液含有：10mMKCl，10 mM (NH4)2S04, 20 mMTris-HCl pH 8.8,2 mM MgS04,0. 1% Triton X-100〇
[0015]本發(fā)明的技術(shù)原理為： 根據(jù)待測miRNA序列設計擴增模板(如圖2所示)。該模板包含三段序列：序列1和序 列3完全相同，且與目標miRNA序列互補；序列2為切口酶的識別序列；另外：在靠近模板 5'端的堿基上修飾一個生物素（biotin)，當溶液中加入鏈霉親和素（SA)時，SA與biotin 結(jié)合可使擴增模板5'端的Tm值降低，在恒溫指數(shù)擴增條件下，能提高目標miRNA序列與模 板3'端的結(jié)合效率，同時加速被切口酶剪切后的DNA片段從模板5'端離去的速度，從而提 高了指數(shù)擴增技術(shù)的擴增效率與靈敏度。其具體步驟如圖3所示。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明通過在常規(guī)指數(shù)擴增模板的5'端與引物互補的區(qū)域內(nèi)的一堿基上修飾一生物 素來調(diào)節(jié)引物與擴增模板3'端和5'端的雜交速度，建立了改進型恒溫指數(shù)擴增方法。該 方法較常規(guī)恒溫指數(shù)擴增方法，具有以下優(yōu)點： 1、 擴增效率更高，速度更快，縮短分析時間； 2、 標準曲線的線性范圍更寬，特異性更好，靈敏度更高； 3、 方法具有很好的精確性，重復性和穩(wěn)定性，可發(fā)展成為試劑盒并向市場推廣。
【附圖說明】
[0017] 圖1為恒溫指數(shù)擴增反應原理圖。
[0018] 圖2為改進型恒溫指數(shù)擴增方法模板設計示意圖。
[0019] 圖3為改進型恒溫指數(shù)擴增方法示意圖。
[0020] 圖4為不同位點擴增曲線圖。
[0021] 圖5為不同聚合酶量（A)和不同內(nèi)切酶量（B)條件下let_7a擴增反應P0I值與 空白實驗P0I值之差；（C) - (F)擴增反應在不同模板量條件下對let_7a和空白的擴增曲 線圖。
[0022] 圖6為標準曲線圖。
[0023] 圖7為方法特異性分析圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面以檢測miRNA let-7家族中l(wèi)et_7a為例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說 明，但并不局限于此。
[0025] 實施例1 一種用于檢測miRNA let_7a的改進型恒溫指數(shù)擴增模板的設計 miRNA let-7a 的序列為：5'-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGUU-3'（SEQ ID N0. 1)。
[0026] 根據(jù)miRNA let_7a的序列，并以Nt. BstNBI為切口酶設計擴增模板如下： 5'端互補序列切口酶識別序列3'端互補序列 5' -AA (biotin) CTATACAACCTACTACCTCAA - ACAGACTCA - AACTATACAA CCTACTACCTCAA-3' （SEQ ID N0.2) 模板5'端的第二個A堿基上修飾有biotin。
[0027] 實施例2恒溫指數(shù)擴增方法檢測條件的優(yōu)化 (1)最佳修飾biotin位點的選擇 制備不同標記的擴增模板如下： SiteO:5' -AACTATACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3' S i te2:5? -AA (b i 〇t in)CTATACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTC AA-3' Site6:5' -AACTAT(biotin)ACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTC