專利名稱：一種用微波輔助環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成改性甜菊糖苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
—種用微波輔助環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)催化合成改性甜菊糖苷的方 法，具體地說是以甜菊糖水溶液和淀粉水解液為原料，在微波反應(yīng)裝置中經(jīng)微波輻射與 CGTase酶催化的共同作用，合成改性甜菊糖苷。涉及有機(jī)化合物的生物合成技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甜菊糖是繼甘蔗和甜菜糖之后，第三種有開發(fā)價(jià)值的天然蔗糖替代品，被國際上 譽(yù)為"世界第三蔗糖"。它無毒副作用，無致癌物，食用安全，經(jīng)常食用可預(yù)防高血壓、糖尿 病、肥胖癥、心臟病、齲齒等病癥，是一種可替代蔗糖的非常理想的甜味劑。但它有一個(gè)致命 的弱點(diǎn)，即后苦澀味，導(dǎo)致其甜度與蔗糖仍有很大差距。從甜葉菊中提取到的兩種主要甜味 物質(zhì)為甜菊甙(Stevioside)和萊包迪甙A (Rebaudiosides A)，結(jié)構(gòu)為
Stevioside (St) RebaudiosidesA(RebA) 其中Stevioside后苦澀味較重。利用酶例如CGTase催化轉(zhuǎn)苷、在甜菊糖特別是 Stevioside中引入新的糖基，可以溫和地改善甜菊糖的甜味特性，反應(yīng)過程見方程式1。
CGTase
St +淀粉水解液-^ G-St + 2G-St + 3G-St十4G-St + 5G-St (方程式1) 注G = glucose (葡萄糖)殘基，2G = 2個(gè)glucose殘基，3G = 3個(gè)glucose殘基，4G = 4個(gè)glucose殘基，5G = 5個(gè)glucose殘基。 微波輻射雖然在某些情況下特別是常規(guī)化學(xué)反應(yīng)中可以加快反應(yīng)速度，但是由于 微波的熱和非熱效應(yīng)以及酶催化合成的特殊性，同時(shí)由于水對微波的吸收遠(yuǎn)較底物的強(qiáng)， 因此在水溶液中進(jìn)行微波輔助下的酶催化反應(yīng)很容易導(dǎo)致酶失活，故而一般在水溶液中進(jìn) 行的微波酶催化反應(yīng)并不常見。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明所述的水溶液反應(yīng)體系中，一定條件下 微波不僅不會(huì)導(dǎo)致酶失活，反而能大幅加快反應(yīng)速率。經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，本發(fā)明用微波輔助 CGTase酶催化合成改性甜菊糖苷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用微波輔助CGTase酶催化合成改性甜菊糖苷的方法， 以甜菊糖水溶液和淀粉水解液為原料，微波輔助CGTase酶催化合成改性甜菊糖苷，應(yīng)用本 發(fā)明可以高效、快速地合成改性甜菊糖苷。 本發(fā)明的技術(shù)方案一種用微波輔助環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶CGTase催化合成改 性甜菊糖苷的方法，以CGTase酶為催化劑，以甜菊糖水溶液和淀粉水解液為原料，用微波 輻射促進(jìn)反應(yīng)，合成改性甜菊糖苷；所用甜菊糖水溶液和淀粉水解液的體積相同，甜菊糖水 溶液的質(zhì)量濃度為2%，將底物甜菊糖淀粉按質(zhì)量比為l : 0.3-1.5的比例混合，置于 80mL微波反應(yīng)器中，再加入10-40U/g甜菊糖的CGTase酶，將微波反應(yīng)器移入微波反應(yīng)裝 置，啟動(dòng)微波輻射，輻射功率選擇范圍為40-80W，設(shè)定反應(yīng)溫度為40-7(TC間的某一溫度， 待反應(yīng)溫度達(dá)到設(shè)定值時(shí)開始計(jì)時(shí)，定時(shí)取樣進(jìn)行高壓液相色譜分析(分析條件見參考文 獻(xiàn)[1]:中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑甜菊糖甙GB 8270-1999.)，反應(yīng)至反應(yīng)化合 物中原料甜菊甙的含量不變后停止微波加熱，得到無色透明的改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品；改性 甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、乙醇重結(jié)晶后得到白色晶體改性甜菊糖苷。經(jīng)品嘗，其苦澀味大大 下降。 所述的甜菊糖是從甜葉菊中提取的、甜菊甙質(zhì)量含量為40% _90%的甜菊糖，由 山東華仙甜菊股份有限公司購得，Stevioside含量的分析條件見參考文獻(xiàn)[1]。
所述的CGTase酶來源于浸麻芽孢桿菌(Bacallus macerans)，由日本天野酶制品 株式會(huì)社購得，在本反應(yīng)中的加入量為10-40U/g甜菊糖；CGTase酶的酶活測定方法見參考 文獻(xiàn)[2] :Lejeune， A. ， Sakaguchi， K. ， Imanaka， T. Aspectrophotometric assay for the cyclization activity of cyclomaltohexaose(a -cyclodextrin)glucanotransferase. Anal Biochem 1989,181(1) :6-11.。 所述的淀粉水解液是用a -中溫淀粉酶水解木薯淀粉或玉米淀粉的水解液，淀粉 液化過程為稱取淀粉2g用水調(diào)成漿狀物，在攪動(dòng)下緩緩傾入70mL沸水中。然后以30mL 水分幾次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液并入其中，加熱至完全透明，冷卻，定容至100mL。加入2mL a _中溫淀粉酶(4U/mL)，在7(TC水浴中液化30min，此時(shí)水解反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡。
所述的a-中溫淀粉酶來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)，由無錫雪梅 酶制劑科技有限公司購得，酶活測定方法見參考文獻(xiàn)[3]:中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) QB/T1803-1993.。 本發(fā)明的有益效果本發(fā)明所提供的合成改性甜菊糖苷的方法能將酶催化與微波 加熱有效結(jié)合，綜合利用酶催化和微波催化反應(yīng)的諸多特點(diǎn)，能達(dá)到常規(guī)加熱下酶催化反應(yīng)所不具有的良好效果，同時(shí)加快反應(yīng)的進(jìn)行，不會(huì)產(chǎn)生通常條件下水體系中微波使酶失 活的現(xiàn)象，從而提供了一種高效、快速的合成改性甜菊糖苷的方法。經(jīng)品嘗，合成的改性甜 菊糖苷的苦澀味大大下降。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的玉米淀粉水解液混合，移入80mL微波 反應(yīng)器，加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W下攪拌反應(yīng)lmin。取樣進(jìn)行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉(zhuǎn)化率為15.25%。改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié) 晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為71%。
對照例1 (用常規(guī)加熱替代微波輻射) 將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的玉米淀粉水解液混合，移入50mL錐形 瓶中，加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液，在60。C水浴中反應(yīng)30min， Stevioside的轉(zhuǎn)化率 達(dá)到16.45%。改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié)晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率 為71%。 實(shí)施例2將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的玉米淀粉水解液混合，移入80mL微波 反應(yīng)器，加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W下攪拌反應(yīng)5min。取樣進(jìn)行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉(zhuǎn)化率為36. 25%。改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié) 晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為72 % 。
對照例2 (用常規(guī)加熱替代微波輻射)將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的玉米淀粉水解液混合，移入50mL錐形 瓶中，加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液，在60。C水浴中反應(yīng)45min， Stevioside的轉(zhuǎn)化率 達(dá)到35. 36%。改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié)晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率 為71. 5%。
實(shí)施例3將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的玉米淀粉水解液混合，移入80mL微波 反應(yīng)器，加入40U/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W下攪拌反應(yīng)lmin。取樣進(jìn)行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉(zhuǎn)化率為45.45%。改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié) 晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為77 % 。
對照例3 (用常規(guī)加熱替代微波輻射) 將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的淀粉水解液混合，移入50mL錐形瓶 中，加入40U/g甜菊糖的CGTase酶液，在6(TC水浴中反應(yīng)30min， Stevioside的轉(zhuǎn)化率達(dá) 到46. 94%。改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié)晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為 76. 5%。 實(shí)施例4 將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的玉米淀粉水解液混合，移入80mL微波 反應(yīng)器，加入20U/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W下攪拌反應(yīng)lmin。取樣進(jìn)行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉(zhuǎn)化率為20.63%。改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié)
5晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為70 % 。
實(shí)施例5將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的淀粉水解液混合，移入80mL微波反應(yīng) 器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、40W條件下攪拌反應(yīng)5min。取樣進(jìn)行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉(zhuǎn)化率為10.35%。改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié) 晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為64% 。
實(shí)施例6將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的淀粉水解液混合，移入80mL微波反應(yīng) 器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、60W條件下攪拌反應(yīng)5min。取樣進(jìn)行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉(zhuǎn)化率為26. 27%。改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié) 晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為70.4%。
實(shí)施例7將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的淀粉水解液混合，移入80mL微波反應(yīng) 器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在40°C 、80W條件下攪拌反應(yīng)5min。取樣進(jìn)行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉(zhuǎn)化率為11.61%。改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié) 晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為66 % 。
實(shí)施例8將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的淀粉水解液混合，移入80mL微波反應(yīng) 器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在50°C 、80W條件下攪拌反應(yīng)5min。取樣進(jìn)行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉(zhuǎn)化率為22. 26%。改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié) 晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為70. 1 % 。
實(shí)施例9將10mL 2 %的甜菊糖溶液與10mL 2 %的淀粉水解液混合，移入80mL微波反應(yīng)器， 加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在70°C 、80W條件下攪拌反應(yīng)5min。取樣進(jìn)行高壓液相 色譜分析。Stevioside的轉(zhuǎn)化率為32. 35%。改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié)晶 后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為71. 2%。
實(shí)施例10 將10mL淀粉水解液與將10mL 2 %的甜菊糖水溶液按底物淀粉甜菊糖為 0. 3 : 1 (w/w)混合，移入80mL微波反應(yīng)器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W 條件下攪拌反應(yīng)5min。取樣進(jìn)行高壓液相色譜分析。Stevioside的轉(zhuǎn)化率為15. 58%。改 性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié)晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為69%。
實(shí)施例11 將10mL淀粉水解液與將10mL 2 %的甜菊糖水溶液按底物淀粉甜菊糖為為 0. 5 : 1 (w/w)混合，移入80mL微波反應(yīng)器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W 條件下攪拌反應(yīng)5min。取樣進(jìn)行高壓液相色譜分析。Stevioside的轉(zhuǎn)化率為23. 57%。改 性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié)晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為70. 5%。
實(shí)施例12 將10mL淀粉水解液與將10mL 2 %的甜菊糖水溶液按底物淀粉甜菊糖為為 1.5:1 (w/w)混合，移入80mL微波反應(yīng)器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W條件下攪拌反應(yīng)5min。取樣進(jìn)行高壓液相色譜分析。Stevioside的轉(zhuǎn)化率為20.46X。改 性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、用乙醇重結(jié)晶后可以得到白色晶體產(chǎn)品，收率為70. 3%。
權(quán)利要求
一種用微波輔助環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶CGTase催化合成改性甜菊糖苷的方法，其特征是以CGTase酶為催化劑，以甜菊糖水溶液和淀粉水解液為原料，用微波輻射促進(jìn)反應(yīng)，合成改性甜菊糖苷；所用甜菊糖水溶液和淀粉水解液的體積相同，甜菊糖水溶液的質(zhì)量濃度為2％，將底物甜菊糖∶淀粉按質(zhì)量比為1∶0.3-1.5的比例混合，置于80mL微波反應(yīng)器中，再加入10-40U/g甜菊糖的CGTase酶，將微波反應(yīng)器移入微波反應(yīng)裝置，啟動(dòng)微波輻射，輻射功率選擇范圍為40-80W，設(shè)定反應(yīng)溫度為40-70℃間的某一溫度，待反應(yīng)溫度達(dá)到設(shè)定值時(shí)開始計(jì)時(shí)，定時(shí)取樣進(jìn)行高壓液相色譜分析，反應(yīng)至反應(yīng)化合物中原料甜菊甙的含量不變后停止微波加熱，得到無色透明的改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品；改性甜菊糖苷粗產(chǎn)品經(jīng)干燥、乙醇重結(jié)晶后得到白色晶體改性甜菊糖苷。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的甜菊糖是從甜葉菊中提取的、甜菊甙 質(zhì)量含量為40% _90%的甜菊糖。
全文摘要
一種用微波輔助環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)催化合成改性甜菊糖苷的方法，涉及有機(jī)化合物的生物合成技術(shù)領(lǐng)域。以甜菊糖水溶液和淀粉水解液為原料，在微波反應(yīng)裝置中經(jīng)由微波輻射與CGTase催化的共同作用合成葡萄糖基取代的甜菊糖苷。在本發(fā)明提供的工藝條件內(nèi)，不僅可以顯著加快酶催化反應(yīng)的進(jìn)行，而且不會(huì)產(chǎn)生通常條件下水體系中微波使酶失活的現(xiàn)象。經(jīng)品嘗，合成的改性甜菊糖苷的苦澀味大大下降。
文檔編號(hào)C12P19/56GK101775425SQ20101013112
公開日2010年7月14日 申請日期2010年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月24日
發(fā)明者夏詠梅, 張志勇, 方云, 李薇, 王立成, 蔡亞, 陳凱 申請人:江南大學(xué);常州市牛塘化工廠有限公司;南通市常海食品添加劑有限公司