專(zhuān)利名稱(chēng)：用于豆乳制品發(fā)酵的嗜熱鏈球菌grx90及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于豆乳制品發(fā)酵的嗜熱鏈球菌grx90 及其用途。
背景技術(shù)：
大豆的保健功能眾所周知，但是大豆也存在一些營(yíng)養(yǎng)缺陷，如胰蛋白酶抑制劑影 響蛋白質(zhì)的消化吸收，凝血素會(huì)引起血紅細(xì)胞凝集，腸胃脹氣因子、過(guò)敏因子以及大豆豆腥 味等都對(duì)大豆蛋白的利用有一定阻礙作用，因而大豆的食用方法與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值關(guān)系很大。大 豆酸乳就是利用微生物的發(fā)酵作用制成的一種酸乳制品，它既能發(fā)揮大豆的營(yíng)養(yǎng)功效，又 能破壞大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，使大豆蛋白質(zhì)的消化率得到明顯提高。目前兼有大豆蛋白質(zhì)和乳酸菌的酸豆乳飲料在國(guó)內(nèi)迄今仍無(wú)有影響的產(chǎn)品上市。 究其原因，主要是乳酸菌在豆乳中生長(zhǎng)較差，發(fā)酵后的活菌數(shù)和酸度均低于酸牛奶，直接影 響了酸豆乳的產(chǎn)品質(zhì)量。用豆乳生產(chǎn)酸豆乳要達(dá)到酸牛乳那樣的風(fēng)味和品質(zhì)，首先要解決 兩個(gè)問(wèn)題，一是制備風(fēng)味清香、口感舒適、穩(wěn)定性好的豆乳。二是選育能在豆乳中生長(zhǎng)良好， 產(chǎn)酸和活菌數(shù)較高，能去除豆腥味，且能產(chǎn)生酸牛乳風(fēng)味物質(zhì)的乳酸菌。酸豆乳與酸牛乳相同，其口感與風(fēng)味與其所使用的乳酸菌的種類(lèi)密切相關(guān)。不同 的乳酸菌產(chǎn)生的酶、代謝的產(chǎn)物等差異很大，由此產(chǎn)生出不同的口感和風(fēng)味。從眾多乳酸菌 中篩選出適合發(fā)酵豆乳的菌株具有重要的意義。不僅可以生產(chǎn)出優(yōu)良口味的大豆發(fā)酵制 品，還可以提高大豆中天然保健功能成分的利用率。在食品向天然型和保健型發(fā)展的今天， 利用適合在豆乳中發(fā)酵的乳酸菌來(lái)制備各種大豆發(fā)酵制品具有廣闊的市場(chǎng)前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于為了克服前述和其它缺點(diǎn)，發(fā)明一種可用于豆乳制品發(fā)酵的嗜熱 鏈球菌grx90分離株，制備具有良好口感的發(fā)酵豆乳制品。本發(fā)明所說(shuō)的嗜熱鏈球菌grx90，是嗜熱鏈球菌Sti^ptococcus thermophilus (S. thermophilus)CGMCC No :3622。本發(fā)明的另一目的在于所述嗜熱鏈球菌grx90的應(yīng)用可用于制備具有良好口感的發(fā)酵豆乳?？捎糜谥苽渚哂辛己每诟械陌l(fā)酵混合豆乳?？捎糜谥苽浒l(fā)酵型即食豆干。
可用于制備具有豆干酪食品。經(jīng)試驗(yàn)表明本發(fā)明的菌株可以有效抑制發(fā)酵豆乳制品中不良風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，可 以制備具有良好口感的發(fā)酵豆乳制品。


圖1是嗜熱鏈球菌grx90革蘭氏染色顯微觀(guān)察圖
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圖2是嗜熱鏈球菌grx9016S rDNA-PCR產(chǎn)物的熒光圖譜泳道 M :EcoRI+HindIII marker ；1 :grx902 :grx90 ；3 :grx90圖3是嗜熱鏈球菌grx90基因組DNA電泳圖泳道 M :EcoRI+HindIII marker ；1 :grx90 ；2 :grx90 ；3 :grx90
具體實(shí)施例方式發(fā)明者通過(guò)從我國(guó)統(tǒng)發(fā)酵制品中分離獲得的大量菌株(多數(shù)為乳酸菌)，利用研 究α-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)活力比較，獲得一株最高活力的菌株grx90。再通過(guò)細(xì)菌形 態(tài)學(xué)、生理學(xué)和培養(yǎng)特征，并通過(guò)法國(guó)梅埃里公司API系列試劑條及16SrDNA基因測(cè)序與 BLAST在線(xiàn)比對(duì)，結(jié)果證實(shí)了菌株grx90是嗜熱鏈球菌(S. thermophilus)。1.樣品來(lái)源本發(fā)明菌株來(lái)源于我國(guó)新疆民族傳統(tǒng)乳制品-酸馬奶。酸馬奶(Koumiss)是以新 鮮馬奶為原料，經(jīng)乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然發(fā)酵形成的酸性低酒精含量乳飲料。2.樣品采集將樣品采集后放入事先準(zhǔn)備好的緩沖溶液中，冷藏，2天之內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行分離。3.菌株分離將新疆民族傳統(tǒng)乳制品酸馬奶樣品采用PTYG培養(yǎng)物于37°C培養(yǎng)24小時(shí)后。將該 培養(yǎng)物涂布在PTYG瓊脂平板上，然后在37°C培養(yǎng)3天，挑取單菌落，并進(jìn)一步純化，檢測(cè)細(xì) 菌特征，如下文所述的革蘭氏染色如圖1所示。將分離獲得的菌株用含11%脫脂乳的培養(yǎng)物培養(yǎng)后，加入保護(hù)劑，凍干、保存 在-18°C，然后用于各種檢測(cè)細(xì)菌特征的試驗(yàn)。4.菌株篩選將分離的菌株按3%的接種量接入50mL MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)一發(fā)酵液于4°C， 5000r/min離心20min收集菌體一0. 85 %的NaCl溶液洗滌，并離心一pH6. 0檸檬酸-磷酸 鹽緩沖液懸浮進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎一離心得上清為所要酶液一200 μ L新配制底物Ci-乙 酰氧基-α -甲基-乙酰乙酸乙酯+200 μ L酶液30°C水浴20分鐘后加入顯色劑一15-20°C 顯色50分鐘，于522nm處測(cè)吸光度。5.菌株的鑒定(1)生理生化鑒定從純化好的本發(fā)明菌株固體培養(yǎng)基上挑單菌落接種到糖發(fā)酵微量鑒定管中用無(wú) 菌石蠟油封口。放入37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于24h和48h后觀(guān)察各管中液體顏色變化 情況，若變色為陽(yáng)性，反之陰性，結(jié)果如表1。對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》初步確定分離菌 株的屬種。初步鑒定該菌株為嗜熱鏈球菌，命名為嗜熱鏈球菌grx90。表1本發(fā)明菌株生理生化鑒定結(jié)果 注“ + ”表示陽(yáng)性反應(yīng)，“_”表示陰性反應(yīng)。(2) API 鑒定在37°C，在厭氧條件下將嗜熱鏈球菌grx90在MRS瓊脂平板上培養(yǎng)48小時(shí)，然后 用懸浮培養(yǎng)基將所得培養(yǎng)物懸浮，懸浮液的濁度與McFarland 2的相同。然后，將該培養(yǎng)細(xì) 胞接種到API20Str印試劑條中，在測(cè)定糖發(fā)酵的試劑條的上層覆蓋一層無(wú)菌石蠟，37°C厭 氧培養(yǎng)以便檢測(cè)酶活和對(duì)各種糖的發(fā)酵能力(表2)。使用API識(shí)別軟件程序分析了酶活和糖發(fā)酵能力。結(jié)果顯示，該菌株的酶活和糖 發(fā)酵能力與嗜熱鏈球菌類(lèi)似，符合率為98. 5%。表2本發(fā)明菌株API20Str印鑒定系統(tǒng)反應(yīng)結(jié)果
編號(hào)12345678VPHIPESCPYRAα GALGURβ GALPALgrx90++------編號(hào)910111213141516LAPADHRIBARAMANSORLACTREgrx90+-----+-編號(hào)1718192021222324INURAFAMDGLYGHEM45 °C *grx90-----+-注“ + ”表示陽(yáng)性反應(yīng)，“_”表示陰性反應(yīng)。*為補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)(3)菌株16SrDNA序列鑒定采用細(xì)菌基因組DNA小量抽提試劑盒，按照說(shuō)明進(jìn)行操作，所提嗜熱鏈球菌grx90 基因組DNA電泳條帶清晰，說(shuō)明基因組DNA完整性較好可用于PCR等分子生物學(xué)操作(如 圖2所示)，其16SrDNA測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO. 1所示。以基因組DNA作為模板，采用50 μ 1反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中模板DNA5 μ 1 (大 約 IOOng)，2. 5mM dNTP 4 μ 1, IOXbuffer 5 μ 1，IOpmol 上下游引物各 1. 5 μ 1，Taq 酶 1. 5U， Mg2+3y 1,以 ddH20 補(bǔ)至 50μ 1。PCR 循環(huán)參數(shù)為:94°C 預(yù)變性 5min ；94°C 變性 lmin，64°C 退 火 45s，72°C延伸 lmin，循環(huán) 35 次；72°C延伸 8min。吸取 PCR 產(chǎn)物 5 μ 1 與 1 μ 1 Loading buffer混合，用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為80V。電泳結(jié)束后用溴化乙錠(EB)染色 20-30min，拍照。可見(jiàn)約1500bp的條帶即為目標(biāo)條帶(如圖3所示)。測(cè)序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，測(cè)序結(jié)果嗜熱鏈球菌 grx90的16SrDNA序列長(zhǎng)度為1456bp。與Genbank中發(fā)表的序列比對(duì)，表明本發(fā)明菌株以 同源性高達(dá)99. 65%被證實(shí)屬于嗜熱鏈球菌。API鑒定與16SrDNA序列測(cè)定結(jié)果一致，本發(fā)明菌株為嗜熱鏈球菌 (S. thermophilus)grx90o6.菌株保藏將本發(fā)明嗜熱鏈球菌grx90菌株于2010年2月1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物 研究所；分類(lèi)命名為嗜熱鏈球菌(Sti^ptococcus thermophilus)，保藏號(hào)為CGMCC No 3622。實(shí)施例1、酸豆乳的制作方法精選黃豆一0.25%的NAaHCO3浸泡14h—清水洗兩次一1 8的比例用熱水 (85°C左右)磨漿一煮漿一加入8%的白砂糖和3%的全脂乳粉一均質(zhì)(15-20MPa)—滅菌 (90-95°C, 15分鐘)一冷卻42°C左右接入3%嗜熱鏈球菌grx90 — 42°C恒溫發(fā)酵6_8h至 PH值為4. 3 4.6—放入4°C冰箱過(guò)夜即制成凝固型酸豆乳。發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)攪拌，添加果 醬果汁等，冷藏，即制成攪拌型酸豆乳。實(shí)施例2、酸豆乳酸菌飲料的制作方法按應(yīng)用實(shí)施例1制備好酸豆乳，將酸乳用殺菌并冷卻的水、糖漿、乳化穩(wěn)定劑等混 合物稀釋3-4倍左右，制成可直接飲用的酸豆乳飲料。實(shí)施例3、發(fā)酵豆干的制作方法按實(shí)施例2制備好酸豆乳，切割成小凝乳塊，階段性加熱，加熱到45-50°C促使其 排出乳清，壓榨到水分含量為40-43 %，制成發(fā)酵豆干。實(shí)施例4、大豆再制干酪制作按實(shí)施例2、4制備好發(fā)酵，接種毛霉26°C培養(yǎng)36h，8°C成熟12天制成大豆干酪。 加入20%胡蘿卜汁、3. 5%鹽、1. 5%糖、10%人造奶油、10%全脂奶粉、3%乳化穩(wěn)定劑，85°C 融化后進(jìn)行包裝。實(shí)施例5、含嗜熱鏈球菌grx90粉末狀食品的制作方法將嗜熱鏈球菌grx90酸乳冷凍至_40°C _60°C，經(jīng)干燥，至含水量為3% -5%，壓 碎成粉末狀，可將粉末狀產(chǎn)品加入奶粉、低聚糖、麥芽糊精、風(fēng)味劑等制成粉末狀或片塊狀
產(chǎn)品，用于日常食用。實(shí)施例6、含嗜熱鏈球菌grx90冰淇淋的制作方法按應(yīng)用實(shí)施例1制備好酸豆乳，冰淇淋原料配比如表5所示。表5 IOOOkg冰淇淋配方
原料重量(kg)嗜熱鏈球菌grx90酸乳400白砂糖75全脂奶粉62. 5黃奶油31. 25椰子油23糖漿26. 25乳化穩(wěn)定劑6水276將除酸乳以外的其它物料混合，預(yù)熱到60 65°C，采用20Mpa 30Mpa進(jìn)行均質(zhì)， 然后在80°C /20s殺菌，冷卻到40 50°C，與酸乳混合，采用20Mpa 30Mpa進(jìn)行均質(zhì)，在 2°C 4°C時(shí)，老化時(shí)間6h，經(jīng)凝凍后經(jīng)過(guò)硬化的為硬質(zhì)冰淇淋，不經(jīng)硬化的為軟質(zhì)冰淇淋。以上本發(fā)明提供的菌株發(fā)酵的酸豆乳、大豆發(fā)酵豆干、再制干酪等幾種產(chǎn)品風(fēng)味 良好，易為消費(fèi)者接受。
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以上本發(fā)明提供的菌株發(fā)酵的酸豆乳、豆乳飲料、大豆發(fā)酵豆干、豆乳冰淇淋、粉 末狀食品口感風(fēng)味良好，并有一定的保健作用，易為消費(fèi)者接受。
權(quán)利要求
用于豆乳制品發(fā)酵的嗜熱鏈球菌grx90，其特征在于，是嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)CGMCC 3622。
2.如權(quán)利要求1所述用于豆乳制品發(fā)酵的嗜熱鏈球菌CGMCC3622用于制備發(fā)酵豆乳。
3.如權(quán)利要求1所述用于豆乳制品發(fā)酵的嗜熱鏈球菌CGMCC3622用于制備發(fā)酵混合豆乳。
4.如權(quán)利要求1所述用于豆乳制品發(fā)酵的嗜熱鏈球菌CGMCC3622用于制備發(fā)酵型即食豆干。
5.如權(quán)利要求1所述用于豆乳制品發(fā)酵的嗜熱鏈球菌CGMCC3622用于制備豆乳干酪
全文摘要
本發(fā)明涉及食品生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于豆乳制品發(fā)酵的嗜熱鏈球菌grx90及其用途。所說(shuō)的嗜熱鏈球菌grx90是嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)CGMCC 3622。該菌株可以有效抑制發(fā)酵豆乳制品中不良風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，可以制備具有良好口感的發(fā)酵豆乳制品。
文檔編號(hào)A23L1/20GK101906391SQ20101013947
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者劉彩平, 徐寅, 顧瑞霞 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)