專利名稱：一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達(dá)方法及其專用工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及涉及茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達(dá)方法及其專用工程菌。
背景技術(shù)：
微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MicrobialTransglutaminase, MTG, Ε2· 3. 2. 13)是一 種催化多肽鏈中谷氨酰胺的Y-?；D(zhuǎn)移至另一底物中的氨基，形成Y-谷氨?；衔?的轉(zhuǎn)移酶。如底物為蛋白質(zhì)，它能催化兩個蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)反應(yīng)。底物包括乳清蛋白、 麥胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋白和家禽類肌動球蛋白等(Zhu Y，Rinzema Α，. TramperJ, Bol J. Microbal transglutaminase—^ review of its production and applicationin food processing. App 1. Microbiol. Biotechnol, 1995. 44 :277_282)。通過催化蛋白質(zhì)或多 肽之間的交聯(lián)反應(yīng)，可提高蛋白質(zhì)的水溶性、起泡性、可攪拌性、熱穩(wěn)定性、乳化性等功能， 從而使蛋白質(zhì)類食品的質(zhì)構(gòu)、外觀和風(fēng)味等方面得到改善，并提高蛋白質(zhì)的商業(yè)價值。目 前，MTG已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)(Ye DY (葉丹英)，Peng ZY (彭志英)，Zhao匪(趙謀明)， Transglutaminase and its application in foodprocessing. Journal of Zhongzhou Grain College (鄭州糧食學(xué)院學(xué)報)，2000. 21 (2) :46_49)。谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶廣泛存在 于多種動物組織中，但由于含量低、分離困難、熱穩(wěn)定性差、對鈣離子具有依賴性等因素， 較難對其進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。上世紀(jì)80年代末，Ando等發(fā)現(xiàn)茂原鏈輪絲菌、肉桂鏈輪絲 菌和灰肉鏈輪絲菌等均能分泌MTG，且這些微生物所分泌的MTG具有熱穩(wěn)定性高、不需要 鈣離子，產(chǎn)物交聯(lián)程度高等特點(Ando H, Adachi M，Umeda K, et al. Purification and characteristics of a noveltransgloutaminase derived from microorganism. Agric Biol. Chem, 1989. 53 :2613_2617.)。雖然MTG現(xiàn)已可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，但生產(chǎn)成本較高， 限制了它的進(jìn)一步應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達(dá)方法及其專用工 程菌。本發(fā)明所提供的表達(dá)茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的專用工程菌，是將含有茂原 鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中得到的；所述茂原鏈輪絲菌谷氨 酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的GenBank號為AF531437。用于構(gòu)建所述含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的表達(dá)載體的出發(fā)載體可 為 pET-22b、pET-28 或 pET-15 等，優(yōu)選為 pET_22b。以pET_22b為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的表達(dá)載 體為 pET-MTG。所述大腸桿菌為適于蛋白表達(dá)的大腸桿菌菌株，優(yōu)選為Ε. coli R0Setta(DE3)。將含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法可為生物工程領(lǐng)域中常用的轉(zhuǎn)化方法，如熱激法、電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)
化法等。本發(fā)明的第二個目的是提供一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達(dá)方法。本發(fā)明所提供的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達(dá)方法，是發(fā)酵上述茂原鏈輪 絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的專用表達(dá)工程菌，表達(dá)的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶以包涵體的 形式存在于菌體細(xì)胞中，收集包涵體，對其進(jìn)行純化、變性、復(fù)性和純化后得到茂原鏈輪絲 菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。發(fā)酵上述工程菌時需加入IPTG誘導(dǎo)劑，所加入IPTG的濃度為0. 8-1. 2mmol/L，優(yōu) 選為lmmol/L，誘導(dǎo)溫度為35_39°C，優(yōu)選為37°C，誘導(dǎo)時間為2_4小時，優(yōu)選為3小時。對包涵體進(jìn)行純化包括以下步驟將包涵體用含Triton的Tris-HCl緩沖液重懸。對包涵體變性、復(fù)性可包括以下步驟將包涵體在含8mol/L尿素，20mmol/L DTT 和lmmol/L EDTA的Tris-HCl，pH6. 5-9. 0緩沖液中溶解后，迅速調(diào)節(jié)pH值至4. 0，導(dǎo)致MTG 復(fù)性。具體的對包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性的方法可為將經(jīng)洗滌的包涵體溶于20mol、 pH6. 5-9. 0，且含 8mol/L 尿素，20mmol/L DTT 和 lmmol/L EDTA 的 Tris-HCl 緩沖液中，室溫 攪拌2小時，離心去除沉淀后，調(diào)pH值至4. 0，再次離心去除沉淀，將上清液用20mmol、pH 4. 0的乙酸緩沖液稀釋50倍后4°C攪拌12-24小時，調(diào)pH值至6. 0，離心去除沉淀后，用10 倍20mmol、pH6. 0的磷酸緩沖液(PB)透析1_3次。對復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行純化的方法可為強(qiáng)陽離子交換層析法、弱陽離子交換層析法等， 優(yōu)選為強(qiáng)陽離子交換層析法。本發(fā)明提供了一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的原核高效表達(dá)方法。該方法 是將茂原鏈輪絲菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因借助大腸桿菌表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，經(jīng)發(fā)酵 獲得茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。其中P_ET22b為優(yōu)選的大腸桿菌表達(dá)載體，該載體含 有pelB信號肽的編碼序列，使用限制性內(nèi)切酶Nde I切除該序列后，表達(dá)產(chǎn)物便不含信號 肽。所克隆的茂原鏈輪絲菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因序列與Kikuchi等(Kikuchi Y, Date Μ, Yokoyama K, Umezawa Y, Matsui H. Secretion of active-formStreptoverticiIlium mobaraense transglutaminase by Corynebacteriumglutamicum :processing of the pro-transglutaminase by a cosecretedsubtiIisin-Like protease from Streptomyces albogriseolus. Appl Environ. Microbiol, 2003,69 :358_66.)報道的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基 因序列完全相同，G+C含量為66. 66%，并含有大量的稀有密碼子，其中AGA和AGG占編碼 精基酸密碼子中的37. 8% (11/29)，表明谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的合成需要帶有稀有密碼子的 tRNA"—A)。但在所有大腸桿菌含稀有密碼子的tRNA中，tRNAw(A =/A<=A)含量最少，因此在 使用E. ColiBL-21(DE3)和E. Coli BL-21 (DE3)PLys作為宿主菌時，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后未看到 重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達(dá)帶，可能是這兩株宿主菌中稀有密碼子的tRNAa"(A(^A(:A)含量不 足所致。而使用能共表達(dá)稀有密碼子的E. Coli Rosetta(DE3)宿主菌后，大量tRNAmg(AGG/ AGA)基因共表達(dá)，使重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶獲得高效表達(dá)。實驗證明經(jīng)搖瓶培養(yǎng)可獲得濕菌 體5. 8g/L培養(yǎng)基，得到純化的包涵體0. 55g，最終獲得重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶純酶102. 4mg ； 若使用高密度發(fā)酵方法，每升培養(yǎng)基可獲得超過IOOg濕菌體，最終得到2g純酶，遠(yuǎn)高于 現(xiàn)有的143mg天然酶/L培養(yǎng)基(可以)的表達(dá)水平(Yokoyama KI, NakamuraN, SeguroK，Kubota K. Overproduction of microbial transglutaminase inEscherichia coli， in vitro refolding, and characterization of the refoldedform. Biosci Biotechnol Biochem. 2000,64 1263-70.)。本發(fā)明為高效、大量、低成本生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶提供了一 種有效方法，具有較高的實際應(yīng)用價值。以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。


圖1為PCR擴(kuò)增的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測 結(jié)果圖2為陽性克隆質(zhì)粒的Nde I和Xho I雙酶切產(chǎn)物的1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié) 果圖3為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)前、后的三種重組菌的全菌蛋白的15% SDS-PAGE檢測結(jié)果
圖4為經(jīng)純化的重組茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的15% SDS-PAGE檢測結(jié)果圖5為SP-S^harose FF離子交換層析純化復(fù)性后的MTG圖6為檢測重組茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶對牛血清白蛋白交聯(lián)作用的實驗 結(jié)果圖7為重組菌MTG/Rosetta (DE3)的菌體生產(chǎn)曲線圖8為重組菌MTG/Rosetta (DE3)的高密度發(fā)酵產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測結(jié)果
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有百分比濃度均為質(zhì)量百 分比濃度。實驗材料大腸肝菌BL21 (DE3) PLysS, Rosetta (DE3)和質(zhì)粒 pET_22b 購自 Novagen 公司；限 制性內(nèi)切酶Nde I、Xho 1和1\ DNA連接酶購自大連TaKaRa公司、高保真Pfu聚合酶購自上 海生工；質(zhì)粒少量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自上海華舜公司；引物合成及DNA測序工 作均由上海博亞公司完成；SP-S印harose購自Amersham公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Gibco 公司；IPTG、尿素、EDTA等其它試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。實施例1、茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的獲得一、茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的專用表達(dá)工程菌的構(gòu)建1、茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的克隆根據(jù)已知的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)基因(GenBank號AF531437)的 開放閱讀框架設(shè)計引物，引物序列如下Pl(正向引物)5，-TAAAAACATATGGACTCCGACGACAGGGTCAC-3，；P2 (反向引物)5，-TAAAAACTCAGGTTACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3，以 1 μ g茂原鏈輪絲菌(Sti^ptoverticillium mobaraense)的基因組DNA為模板， 在引物Pl和P2的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因。100 μ 1 PCR反應(yīng)體系為IOX擴(kuò)增緩沖液 IOul，4 種 dNTP 混合物 各 200umol/L，
引物各 10 lOOpmol，模板 DNA0. 1 2ug，Taq DNA 聚合酶 2. 5u，Mg2+1. 5mmol/L,加雙或三蒸水至 IOOul。反應(yīng)條件為首先94°C 5min;然后 94°C 50s，58°C 1. 5min,72°C 2min，共 30 個 循環(huán)；最后72°C IOmin0反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測 結(jié)果如圖1所示(泳道Marker為DNA marker (bp)，泳道MTG為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，結(jié)果PCR 擴(kuò)增出了 993bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符。2、含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建用凝膠回收試劑盒回收并純化步驟1用PCR方法擴(kuò)增的993bp的DNA片段，對其 用限制性內(nèi)切酶Nde I、Xho I雙酶切后，與經(jīng)同樣酶雙酶切的載體pET-22b用T4 DNA連接 起來，16°C反應(yīng)16h后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸肝菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選后挑選陽性克 隆，提質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Nde I、Xho I進(jìn)行雙酶切分析驗證，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖 凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示(泳道1為DNA marker (bp)，泳道2為pET-MTG/Nde I+Xho I)，結(jié)果獲得了 993bp的酶切片段，表明目的片段正確地克隆入載體pET-22b中。然 后對經(jīng)酶切鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序鑒定，測序結(jié)果表明插入DNA片段的核 苷酸序列與已知的MTG基因(GenBank號AF531437)的核苷酸序列一致，表明構(gòu)建的含有 茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的大腸桿菌表達(dá)載體正確，將其命名為PET-MTG。3、轉(zhuǎn)化將步驟2構(gòu)建的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的大腸桿菌表達(dá)載體pET-MTG 分別轉(zhuǎn)化大腸肝菌Rosetta (DE3)、BL21(DE3) PlysS和Ε. coli BL21(DE3)菌株,后兩種菌株 為對照，得到茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的專用表達(dá)工程菌。將上述三種重組菌分別命 名為 MTG/Rosetta(DE3)、MTG/BL21 (DE3) PlysS 和 MTG/BL21 (DE3)。本領(lǐng)域技術(shù)人員按以上步驟操作，均能夠獲得茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的 專用表達(dá)工程菌MTG/R0Setta(DE3)，該重組菌具有高度可重復(fù)性。重組菌的構(gòu)建方法見 非專利文獻(xiàn) Francois Baneyx. Recombinant protein expression in Escherichiacoli. Current Opinion in Biotechnology. 1999. 10 :411_421.，申請人承諾公眾可從申請人處 獲得該重組菌MTG/Rosetta (DE3)。二、MTG在大腸肝菌中的表達(dá)、包涵體的變性、復(fù)性及MTG的純化挑取步驟一獲得的重組菌MTG/BL21 (DE3)的單菌落，將其接種于含50mg/mL氨卞青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，將后兩種重組菌MTG/Rosetta (DE3)和MTG/BL21 (DE3) PlysS的 單菌落分別接種于含有50mg/mL氨卞青霉素和30mg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 振蕩培養(yǎng)至OD值為0. 6-0. 8時，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，37°C誘導(dǎo)3小時。誘導(dǎo)結(jié) 束后，對經(jīng)IPTG誘導(dǎo)前、后的三種重組菌的全菌蛋白進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測，檢測結(jié)果如 圖 3 所示(泳道 UMolecular weight marker (KD)，泳道 2-4 IPTG 誘導(dǎo)前泳道 2、E. coli BL 21(DE3)j;}dt3、E.coli BL 21 (DE3) PlysS，泳道 4、Ε· coli Rosetta (DE3)；泳道 5-7 IPTG 誘導(dǎo)后泳道 5、E. coli BL21 (DE3)，泳道 6、E. coli BL21 (DE3) PlysS,泳道 7、E. coli Rosetta (D3E))，只有經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的MTG/Rosetta (DE3)出現(xiàn)分子量為36kDa的外源蛋白表達(dá)帶，與MTG的分子量一致，表明茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因大腸桿菌中獲得表達(dá)，而MTG/BL21 (DE3)PlysS、MTG/BL21 (DE3)以及未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌株均未出現(xiàn)外源蛋白 表達(dá)帶。離心收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的MTG/R0Setta(DE3)菌體，得到濕菌體5. 8g/L培養(yǎng)基。 用50mmol/L、pH 8.0 Tris-HCl (含lmmol/L EDTA)緩沖液懸浮菌體，在冰浴中超聲波破碎 菌體，離心后分別收集上清和沉淀，將沉淀部分(包涵體)用50m molTriS-HCl(pH8.0，含 100m mol/L NaCl, Im mol/L EDTA,0. 5% Triton X-100)緩沖液重懸，經(jīng)超聲處理洗滌 3 次 后，再用不含Triton X-100的相同緩沖液洗滌3次，得到純化的包涵體，濕重0. 55g。然后 將純化的包涵體(蛋白濃度約為20mg/mL)溶于20mol、pH8. 0 Tris-HCl (含8mol/L尿素， 20m mol/L DTT和Im mol/L EDTA)緩沖液中進(jìn)行變性，室溫攪拌2小時，離心去除沉淀后， 用HCl調(diào)pH值至4. 0，再次離心去除沉淀，將上清液用20m mol、pH4. 0的乙酸緩沖液稀釋 50倍，4°C攪拌12-24小時。用0. 5mol NaOH調(diào)pH值至6. 0，離心去除沉淀，將上清液用10 倍體積的20m mol、pH6. 0磷酸緩沖液(PB)透析2次。最后將復(fù)性產(chǎn)物上SP-S印harose強(qiáng) 陽離子交換柱層析純化，用PB洗去未結(jié)合的成分，再用含0. 5M NaCl溶液洗脫，洗脫液經(jīng) 透析后進(jìn)行超濾濃縮，獲得MTG蛋白102. 4mg。將濃縮獲得的重組MTG蛋白樣品進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測，檢測結(jié)果如圖4所示(泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為包涵體，泳道3為 為經(jīng)純化的重組MTG蛋白)，SP-Sepharose FF離子交換層析純化復(fù)性后的MTG如圖5所示 (Sample(l) Refolded MTG in PB,EluentA(2) :PB+20m mol/L NaCl,EluentB(3) :PB+500m mol/L NaCl)，表明獲得了高純度的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。實施例2、茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的活性測定和對牛血清白蛋白(BSA)的 交聯(lián)作用一、茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的活性測定用比色法測定實施例1表達(dá)并純化的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的活性 (Pasternack R，Dorsch S，Otterbach J，Robenek Is，et al. Bacterialpro-transgluta minase from Streptoverticillium mobaraense. Purification, characterization and sequence of the zymogen. Eur J Biochem，1998. 257 :570_576)。一個MTG 的酶活單位為 37°C時，催化底物CBZ-Gln-Gly生成1 μ mol L-谷氨酰Y -單異羥基肟酸。L-谷氨酰γ-單 異羥基肟酸在波長520nm處有吸收峰，結(jié)果所表達(dá)的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的比活 為21.5u/mg，與文獻(xiàn)報道的天然酶活性(天然酶的比活為23u/mg)相比，重組MTG的比活 禾肖低(Kikuchi Y，Date M，Yokoyama K，Umezawa Y，Matsui H. Secretion of active-form Streptoverticilliummobaraense transglutaminase by Corynebacterium glutamicum processing of thepro-transglutaminase by a cosecreted subtilisin-Like protease fromStreptomyces albogriseolus. Appl Environ. Microbiol,2003,69 :358_66.)。二、檢測茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶對牛血清白蛋白(BSA)的交聯(lián)作用將BSA溶解于含2mmol DTT的磷酸緩沖液-生理鹽水(PBS)中，使蛋白濃度為 lmg/mL，反應(yīng)總體積為lmL，先在50°C保溫lOmin，然后加入Iu實施例1表達(dá)并純化的茂原 鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，37°C保溫，對照組為未加入重組MTG的反應(yīng)體系，于10、20、30和 60min取樣進(jìn)行10% SDS-PAGE，檢測BSA交聯(lián)情況。結(jié)果如圖6所示，BSA在用DTT處理后未出現(xiàn)沉淀，結(jié)果未用MTG組無明顯的多聚體出現(xiàn)(泳道1、6 10)；重組MTG處理組(泳道2 5)形成了分子量更大的多聚體，由 于分子量太大，多聚體未能進(jìn)入濃縮膠(濃縮膠的孔徑比分離膠小)而附著于上樣孔濃縮 膠表面，表明茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶對牛血清白蛋白具有較強(qiáng)的交聯(lián)作用。實施例3、高密度發(fā)酵及表達(dá)將表達(dá)高純度的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的重組菌MTG/R0Setta(DE3)進(jìn)行高密度發(fā)酵。重組菌體生長的OD值曲線如圖7所示(PO2 溶解氧.OD 細(xì)胞密度.Hour 發(fā) 酵時間(小時))，表明OD值在接種2小時開始上升，3小時后上升速度加快，26小時后上 升速度減慢，此時的OD值為56。溶氧曲線顯示接種4h后溶氧開始下降，6小時后直線下 降。8h后溶氧下降到28%，同時堿泵間歇運轉(zhuǎn)，表明細(xì)菌在產(chǎn)酸，約在10小時，溶氧開始上 升，說明發(fā)酵罐里養(yǎng)料逐漸消耗，在15h時開始補料。待菌體密度的OD值達(dá)60-65時，停止 補料半小時，讓葡萄糖充分耗盡。IPTG誘導(dǎo)后MTG表達(dá)逐漸增高，在3小時達(dá)到最高，4小 時后表達(dá)量下降(如圖8所示，泳道1. Marker,泳道2. IPTG誘導(dǎo)前，泳道3_6. IPTG誘導(dǎo)后 lh、2h、3h、4h.)。在誘導(dǎo)3h時，表達(dá)帶與它相近的一條帶已融合起來，無法判斷MTG占全菌 蛋白的百分含量。在隨后的高密度發(fā)酵中，確定誘導(dǎo)時間為3小時，離心得濕菌體105g/L 培養(yǎng)基。按上述方法分離純化包涵體，并進(jìn)行復(fù)性純化，共獲得MTG蛋白1.85g。以上描述可以總結(jié)出本發(fā)明的突出特點l、pET22b為分泌型表達(dá)載體，含有pelB信號肽的編碼序列，本發(fā)明使用NdeI酶切 祛除該序列，因此，表達(dá)產(chǎn)物不含信號肽。重組質(zhì)粒PET-MTG插入的DNA片段序列與Kikuchi 等報道的完全相同，其中G+C占66. 66%。當(dāng)外源目的基因在大腸桿菌表達(dá)時，由于密碼 子的偏愛性不同，會因為缺乏某種和幾種tRNA，直接導(dǎo)致翻譯中止或錯誤。編碼精氨酸密 碼子AGA、AGG、甘氨酸密碼子GGA和脯氨酸CCC很少被使用。在所有大腸桿菌含稀有密碼 子的tRNA中，含量最少。MTG編碼基因分析顯示含有大腸桿菌稀有密碼子 AGA、AGG、CCC、GGA，其中AGA和AGG最多，占編碼精基酸密碼子中的37. 8% (11/29)。位于 MTG N-端第5和15位的Arg，密碼子均為AGG.，更不利于MTG的表達(dá)。Ivanov等報道，當(dāng) mRNA5端含有稀有密碼子時，該基因在大腸桿菌表達(dá)明顯受到抑制。本發(fā)明研究表明在使 用E. coli BL-21(DE3)和BL-21(DE3)PLysS作為宿主菌時，IPTG誘導(dǎo)后未看到表達(dá)帶，這 可能是這兩株宿主菌中含稀有密碼子的tRNAa"(A(^A(:A)含量不足所致。而本發(fā)明所用專用重 組菌Rosetta(DE3)是經(jīng)過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的外源蛋白表達(dá)的菌株， 故使MTG實現(xiàn)了高效表達(dá)。2、在包涵體復(fù)性過程中，本發(fā)明使用了稀釋復(fù)性，迅速調(diào)節(jié)pH值至4.0，該技術(shù)簡 單且容易放大，適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明在包涵體純化復(fù)性過程中添加Triton，使復(fù)性率提 高了 40%。使用高密度發(fā)酵方法，每升培養(yǎng)基獲得105g濕菌體，獲得了近1. 85g的純酶，遠(yuǎn) 高于目前報道的最高的表達(dá)水平(132mg/每升培養(yǎng)基)?；钚栽囼灡砻髋c文獻(xiàn)報道天然 酶活性相比，本發(fā)明重組MTG的比活幾乎相同(重組MTG的比活為21. 5u/mg，天然酶的比活 為 23u/mg)?？傊?，本發(fā)明實現(xiàn)了 MTG的原核高效表達(dá)，并建立了高密度發(fā)酵工藝和簡便有效 的包涵體復(fù)性方法，為進(jìn)一步利用大腸桿菌工業(yè)化生產(chǎn)更廉價的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶提供 了保證。
權(quán)利要求
表達(dá)茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的專用工程菌，是將含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中得到的；所述茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的GenBank號為AF531437。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的專用工程菌，其特征在于構(gòu)建所述含有茂原鏈輪絲菌谷氨 酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的表達(dá)載體的出發(fā)載體為pET-22b、pET-28或pET_15等，優(yōu)選為pET_22b。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的專用工程菌，其特征在于用于構(gòu)建所述含有茂原鏈輪絲菌 谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的表達(dá)載體的出發(fā)載體為pET-22b。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的專用工程菌，其特征在于所述含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺 轉(zhuǎn)胺酶基因的表達(dá)載體為pET-MTG。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的專用工程菌，其特征在于所述大腸桿菌為 E. coliRosetta(DE3)。
6.一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達(dá)方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1所述的茂原鏈輪 絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的專用表達(dá)工程菌，收集包涵體，對其進(jìn)行純化、變性、復(fù)性后得到茂 原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)方法，其特征在于所述發(fā)酵時需加入IPTG誘導(dǎo)劑，所 加入IPTG的濃度為0. 8-1. 2mmol/L，誘導(dǎo)溫度為35_39°C，誘導(dǎo)時間為2-4小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的表達(dá)方法，其特征在于對包涵體純化可包括以下步驟 將包涵體用含Triton的Tris-HCl緩沖液重懸；對包涵體變性、復(fù)性可包括以下步驟包涵 體在 pH6. 5-9. 0，含 8mol/L 尿素，20mmol/L DTT 和 lmmol/L EDTA 的 Tris-HCl 緩沖液中溶 解后，迅速調(diào)節(jié)PH值至4. 0，導(dǎo)致MTG復(fù)性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)方法，其特征在于所述對包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性的具體 過程為將經(jīng)洗滌的包涵體溶于20mol所述的Tris-HCl緩沖液中，室溫攪拌2小時，離心去 除沉淀后，調(diào)PH值至4.0，再次離心去除沉淀，將上清液用20mmol、pH 4.0的乙酸緩沖液稀 釋50倍后4°C攪拌12-24小時，調(diào)pH值至6. 0，離心去除沉淀后，用10倍20mmol、pH6. 0的 磷酸緩沖液透析1-3次。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8或9所述的表達(dá)方法，其特征在于所述對復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行 純化的方法為強(qiáng)陽離子交換層析法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達(dá)方法及其專用工程菌。該專用工程菌，是將含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中得到的；所述茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的GenBank號為AF531437。一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達(dá)方法，是發(fā)酵上述茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的專用表達(dá)工程菌，收集包涵體，對其進(jìn)行洗滌、變性、復(fù)性和純化后得到茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。本發(fā)明為高效、大量、低成本生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶提供了一種有效方法，具有較高的實際應(yīng)用價值。
文檔編號C12N1/21GK101805719SQ20101014511
公開日2010年8月18日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者張海軍, 徐斌, 高仁偉 申請人:張海軍