專利名稱：乙型肝炎病毒前c/c區(qū)變異及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒前C/C區(qū)變異?；谶@些變異情況，本發(fā)明提供了可用于肝癌預(yù)測(cè)以及早期(輔助性)診斷的檢測(cè)試劑或試劑盒。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，已占居民腫瘤死亡的第二位。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是導(dǎo)致我國肝癌發(fā)生的首要原因。我國約有HBV表面抗原(HBsAg) 攜帶者1. 2億，他們中相當(dāng)部分的慢性肝炎患者，經(jīng)10 20年的發(fā)展會(huì)進(jìn)入肝硬化狀態(tài)， 而肝硬化患者中每十年即有30 50%的人將演變成肝癌。近年來，隨著乙肝疫苗的普遍應(yīng)用，我國兒童中肝炎的發(fā)病得到了很好的控制。但在那些已經(jīng)感染了乙肝病毒的人群中，肝癌的發(fā)病率和死亡率卻仍然呈上升趨勢(shì)。江蘇啟東是世界著名肝癌(HCC)高發(fā)區(qū)。據(jù)1978-2002年統(tǒng)計(jì)資料，男性肝癌的發(fā)病率為92. 7/10萬，女性肝癌的發(fā)病率為27. 8/10萬，是鄰近上海地區(qū)的兩倍。HBV感染和黃曲霉毒素暴露是導(dǎo)致啟東肝癌發(fā)生的兩大主要原因。啟東HBsAg陽性者肝癌的發(fā)病率較HBsAg陰性者高12倍以上。雖然日益增多的研究表明，HBV的生物學(xué)特性(包括基因型、 病毒載量及基因變異等)與病毒感染后的臨床進(jìn)展密切相關(guān)，但至今有關(guān)啟東肝癌高發(fā)區(qū) HBV流行毒株的基因組特征及變異與肝癌的關(guān)系還研究甚少。乙型肝炎病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒科，其DNA為部分環(huán)狀雙鏈DNA，約有3200堿基對(duì)，由正鏈和負(fù)鏈構(gòu)成。負(fù)鏈有4個(gè)開放讀碼區(qū)(0RF)，分別為前S/S區(qū)，前C/C區(qū)，P區(qū)和X區(qū)，分別編碼乙肝病毒包膜蛋白、核心蛋白(HBcAg)/E抗原(HBeAg)、x蛋白以及DNA聚合酶。由于HBV復(fù)制過程中有一獨(dú)特的逆轉(zhuǎn)錄過程，故較其它DNA病毒更易發(fā)生自然突變。隨著HBV長期持續(xù)性感染，病毒基因組突變逐漸累積，在逃避宿主免疫的同時(shí)加重對(duì)肝細(xì)胞的損傷。HBV核心啟動(dòng)子區(qū)(BCP)以及前C區(qū)等突變，都曾被報(bào)道與嚴(yán)重的肝臟病變相關(guān)。因此，應(yīng)用HBV基因組的突變作為肝癌高危的早期預(yù)警標(biāo)志物，成為近年人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。隨著對(duì)HBV與肝癌關(guān)系研究的深入，到目前為止，人們發(fā)現(xiàn)了許多與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的突變位點(diǎn)。HBV的前C基因及C基因共享同一個(gè)讀碼框(前C/C區(qū)，nt. 1814-2452)，根據(jù)不同的起始密碼子，分別編碼HBeAg以及HBcAg。由于HBeAg的起始密碼子在前C基因，故前C 基因變異會(huì)直接影響HBeAg的表達(dá)及分泌；而C基因編碼的HBcAg可通過誘導(dǎo)病毒特異的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)作用及通過旁路機(jī)制輔助HBV包膜特異性的B細(xì)胞產(chǎn)生抗ms中和抗體從而使機(jī)體完成對(duì)病毒的清除，因此C基因的某些突變則可致使病毒逃避機(jī)體免疫清除而持續(xù)感染損傷肝細(xì)胞。G1896A是HBV前C/C區(qū)最常見的突變類型，它可造成的前C蛋白翻譯終止從而使HBeAg合成受阻。除此之外，前C基因的其他位點(diǎn)如1856、1862等位點(diǎn)突變也曾被報(bào)道可降低前C蛋白信號(hào)肽斷裂而影響HBeAg的合成。Ehata等通過對(duì)HBV慢性感染者的研究，最早提出了該區(qū)C基因氨基酸84-101位(nt. 2150-2203)的變異與患者肝臟損傷相關(guān)。之后， 其他研究者證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)一步補(bǔ)充闡述了 C基因某些突變與HBV感染后機(jī)體免疫清除間的關(guān)系。然而，迄今為止，世界范圍內(nèi)關(guān)于HBV前C/C區(qū)變異與肝癌關(guān)系的研究卻甚少。由于癌癥是危害人類健康的主要疾病之一。為了有效地治療和預(yù)防腫瘤(如肝癌)，目前人們已越來越關(guān)注腫瘤的早期診斷和預(yù)后，盡管目前本領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些位點(diǎn)的突變與肝癌有關(guān)，然而還有必要作進(jìn)一步研究，從而為肝癌的診斷、分型或預(yù)后提供更詳盡的依據(jù)，進(jìn)一步提高診斷、分型或預(yù)后的準(zhǔn)確性。綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的可用于肝癌預(yù)測(cè)以及早期(輔助性)診斷的檢測(cè)試劑或試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供新的可用于肝癌預(yù)測(cè)以及早期(輔助性)診斷的檢測(cè)試劑或試劑盒，所述的試劑或試劑盒用于檢測(cè)核酸樣品中是否存在特定的乙型肝炎病毒前C/C 區(qū)變異。本發(fā)明的另一目的在于提供體外檢測(cè)核酸樣品中特定的乙型肝炎病毒前C/C區(qū)變異的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測(cè)核酸樣品中是否存在乙型肝炎病毒前C/C區(qū)變異的試劑盒，它包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899位為堿基 “A”的序列的引物；和/或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899位為堿基“A”的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899位為堿基 “A”的序列的限制性內(nèi)切酶。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2159位為堿基 “G”的序列的引物；和/或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2159位為堿基“G”的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2159位為堿基 “G”的序列的限制性內(nèi)切酶。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2189位為堿基 “C”的序列的引物；和/或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2189位為堿基“C”的序列結(jié)合的探針；或
容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2189位為堿基 “C”的序列的限制性內(nèi)切酶。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2203位為堿基 “W”的序列的引物；和/或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2203位為堿基“W”的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2203位為堿基 “W”的序列的限制性內(nèi)切酶。在另一優(yōu)選例中，上述各試劑盒中同時(shí)包括了①容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增的引物；和②容器，以及裝于所述容器的與含突變位點(diǎn)的序列結(jié)合的探針。在另一優(yōu)選例中，所述的乙型肝炎病毒的基因型是B基因型或C基因型。在另一優(yōu)選例中，所述的乙型肝炎病毒前C/C區(qū)核苷酸位置編號(hào)基于GenBank登錄號(hào)為⑶434374的乙型肝炎病毒全基因序列。在另一優(yōu)選例中，所述的引物是具有SEQ ID NO :15_16所示序列的引物對(duì)。在另一優(yōu)選例中，所述的探針具有選自SEQ ID NO :18、20、22、和24中任一所示的序列。在本發(fā)明的第二方面，提供一種體外(優(yōu)選非診斷性地)檢測(cè)核酸樣品中乙型肝炎病毒前C/C區(qū)變異的方法，所述的方法包括以下步驟檢測(cè)該核酸樣品的乙型肝炎病毒前C/C區(qū)，并與野生型的乙型肝炎病毒前C/C區(qū)比較，存在選自以下變異形式就表明該個(gè)體乙型肝炎病毒前C/C區(qū)存在核苷酸變異乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899位，G —A。在另一優(yōu)選例中，所述的變異形式還包括選自下組的一種或多種乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2159位，A —G ；乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2189位，A —C;或乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2203位，G —W。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種乙型肝炎病毒前C/C區(qū)核苷酸序列的用途，它被用于制備肝癌預(yù)測(cè)或肝癌早期輔助診斷的試劑或試劑盒。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種SEQ ID NO 1_24所述的引物和/或探針或其組合的用途，它(或它們)被用作肝癌預(yù)測(cè)或肝癌早期輔助診斷的試劑；或者用于制備肝癌預(yù)測(cè)或肝癌早期輔助診斷的試劑盒。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。


圖1顯示了本研究篩選階段檢測(cè)的55條HBV全基因序列基因分型結(jié)果。其中，以 A-H起始命名的為GenBank上下來的分型標(biāo)準(zhǔn)株；以Qidong起始命名的為檢測(cè)標(biāo)本， 為肝癌樣品，〇為肝炎樣品?！癚idong”表示啟東。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過大規(guī)模地對(duì)肝癌高發(fā)區(qū)乙型肝炎及肝癌發(fā)病人群進(jìn)行研究，首次揭示乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899、2159、2189、和/或2203位堿基的突變(HBV前C/C區(qū) 1899位G — A、2159位A — G突變、2189位A — C突變以及2203位G — W突變)與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。因此，可將該這些位點(diǎn)的變異作為肝癌易感性標(biāo)志，從而設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)所述突變位點(diǎn)的試劑或試劑盒。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明人自1992年起，建立了一個(gè)用于腫瘤病因?qū)W研究的前瞻性隊(duì)列，共計(jì) 1，638人。此隊(duì)列中慢性肝炎符合2000年《病毒性肝炎防治方案》診斷標(biāo)準(zhǔn)。隊(duì)列含 HBsAg (+)患者852例(其中男性776例，女性76例)，HBsAg㈠患者786例(男性723例， 女性63例)。迄今為止，隊(duì)列中累計(jì)發(fā)生肝癌189例，其中HBsAg(+)患者中有170例發(fā)生肝癌。隊(duì)列成員每年隨訪一次，留有完整的隨訪資料和系列血樣，長達(dá)15年。對(duì)該隊(duì)列成員的研究首次發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899、2189、2203、2159位突變?cè)诟伟┗颊咧械谋壤@著高于慢性肝炎患者。如本文所用，術(shù)語“乙型肝炎病毒前C/C區(qū)”指乙型肝炎病毒前C/C區(qū)，其核苷酸序列為GenBank登錄號(hào)⑶434374所示乙型肝炎病毒序列的核苷酸第1814-2452位。以C基因型為例，野生型的乙型肝炎病毒前C/C區(qū)如SEQ IDNO :25 (C基因型)和SEQ ID NO :26(B 基因型)所示。如本文所用，術(shù)語“肝癌相關(guān)的乙型肝炎病毒前C/C區(qū)變異”指乙型肝炎病毒前 C/C區(qū)第1899、2189、2203、和/或2159位突變，尤其是第1899位G — A (簡(jiǎn)寫為G1899A)； 第2159位A — G(簡(jiǎn)寫為A2159G)；第2189位A — C(簡(jiǎn)寫為A2189C)禾Π /或第2203位 G-K簡(jiǎn)寫為G2203W)。應(yīng)理解，所述的變異可以是一個(gè)位點(diǎn)的突變，也可以是2、3或4個(gè)位點(diǎn)的突變的組合?；诒景l(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，可以將乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899、2189、2203、2159 位的相關(guān)突變作為標(biāo)志，從而從乙型肝炎病毒陽性的人群中分離出對(duì)于肝癌易感性的人群，或作為肝癌疾病的鑒別診斷、和/或易感性分析的輔助性工具；早期評(píng)估相關(guān)人群肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)。例如，可從乙型肝炎病毒陽性患者人群中分離出乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第第 1899、2189、2203、2159位發(fā)生突變的人群，作為肝癌的高發(fā)人群，從而達(dá)到早期監(jiān)測(cè)早期預(yù)防的目的。此外，還可通過進(jìn)一步檢測(cè)乙型肝炎病毒前C/C區(qū)其它位點(diǎn)的突變情況來評(píng)估肝癌易感性。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899、2159、2189、和/或2203位的突變結(jié)合可提高肝癌發(fā)生的可能性。所述突變(G1899A、A2159G、A2189C和/或G2203W) 在肝癌患者中的發(fā)生比例顯著高于慢性肝炎患者中的比例?；诒景l(fā)明人的上述發(fā)現(xiàn)，可采用各種技術(shù)來檢測(cè)乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第 1899、2159、2189、和/或2203位的堿基的突變情況，這些技術(shù)均包含在本發(fā)明中。例如，對(duì)相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行序列測(cè)定，從而判斷是否發(fā)生變異。在檢測(cè)相關(guān)位點(diǎn)的變異時(shí)，檢測(cè)可以針對(duì)cDNA，也可針對(duì)基因組DNA?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此可用例如Western印跡法間接判斷基因有無突變。此外，可用相關(guān)位點(diǎn)特異的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來進(jìn)行體外鑒定；或者可根據(jù)相關(guān)位點(diǎn)設(shè)計(jì)可特異性結(jié)合的探針來進(jìn)行體外鑒定；或者可利用特異性的限制性內(nèi)切酶來進(jìn)行體外鑒定。作為一種可選的方式，還可采用基于PCR技術(shù)的單堿基延伸技術(shù)來檢測(cè)變異位點(diǎn)，其原理是設(shè)計(jì)一條引物，位于待測(cè)變異位點(diǎn)的上游，并且該引物的3'端距離變異位點(diǎn)一個(gè)堿基。加入不同熒光標(biāo)記的ddNTP進(jìn)行反應(yīng)，只有當(dāng)加入的ddNTP與變異位點(diǎn)堿基互補(bǔ)時(shí)，引物才得以延伸?？赏ㄟ^檢測(cè)延伸堿基所發(fā)出的熒光來判斷變異的類型。本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)是否含有所述變異位點(diǎn)的試劑。所述的試劑例如是對(duì)相關(guān)突變位點(diǎn)特異的引物；對(duì)相關(guān)突變位點(diǎn)特異的探針；或?qū)ο嚓P(guān)突變位點(diǎn)特異的限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)是否含有所述變異位點(diǎn)的試劑盒，該試劑盒包括裝在適當(dāng)容器中的、用于特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899位為堿基“A” 的序列的引物；或與乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899位為堿基“A”的序列結(jié)合的探針；或可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899位為堿基“A”的序列的限制性內(nèi)切酶。更佳的，所述試劑盒中還包括裝在適當(dāng)容器中的、用于特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2159位為堿基“G” 的序列的引物；或與乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2159位為堿基“G”的序列結(jié)合的探針；或可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2159位為堿基“G”的序列的限制性內(nèi)切酶。更佳的，所述試劑盒中還包括裝在適當(dāng)容器中的、用于特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2189位為堿基“C” 的序列的引物；或與乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2189位為堿基“C”的序列結(jié)合的探針；或可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2189位為堿基“C”的序列的限制性內(nèi)切酶。更佳的，所述試劑盒中還包括裝在適當(dāng)容器中的、用于特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2203位為堿基“W” 的序列的引物；或與乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2203位為堿基“W”的序列結(jié)合的探針；或可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2203位為堿基“W”的序列的限制性內(nèi)切酶。當(dāng)所述試劑盒中含有針對(duì)多于一個(gè)位點(diǎn)變異情況的檢測(cè)試劑時(shí)，檢測(cè)或評(píng)估的準(zhǔn)確性可能提高。
作為本發(fā)明的可選擇的方式，所述的試劑盒中可包括特異性與乙型肝炎病毒前 C/C區(qū)發(fā)生G1899A、A2159G、A2189C和/或G2203W突變的基因產(chǎn)物結(jié)合且不結(jié)合于相關(guān)位點(diǎn)未突變的基因產(chǎn)物的抗體。更優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括常規(guī)的可用于檢測(cè)抗原抗體結(jié)合狀況的試劑。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑， 包括但不限于抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、對(duì)照液、顯色液、洗液、抗體等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件等。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)通過大規(guī)模地對(duì)乙型肝炎或肝癌發(fā)病人群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)肝癌發(fā)生相關(guān)的新的變異位點(diǎn)，研究病例多，準(zhǔn)確性高。(2)首次針對(duì)新的變異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出特異性的檢測(cè)試劑和試劑盒，為早期評(píng)估相關(guān)人群肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)提供了新的途徑。(3)基于早期檢測(cè)結(jié)果，對(duì)于攜帶新的變異位點(diǎn)的乙型肝炎病毒攜帶者個(gè)體，可采取加強(qiáng)隨訪和復(fù)查等手段，以便能夠盡早確診和治療。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。材料和方法病人和標(biāo)本1研究對(duì)象本研究篩選階段中所使用的血清樣品來自啟東腫瘤醫(yī)院。在初步的乙型肝炎病毒肝癌相關(guān)變異篩選中，共選取了 55份病人樣品，其中20份來自于肝癌患者，35份來自于慢性肝炎患者。兩組間年齡、基因型分布均無顯著差異[年齡，肝癌組43. 57士9. 92歲 vs.慢性肝炎組37. 19士 10. 76歲，P = 0. 074 ；基因型分布(B 基因型基因型)，肝癌組2 :18vs.慢性肝炎組6 :29，P = O. 696]。本研究驗(yàn)證階段中所使用的血清樣本來自1992年起在啟東肝癌高發(fā)現(xiàn)場(chǎng)建立了一個(gè)用于腫瘤病因?qū)W研究的前瞻性隊(duì)列。其中HBsAg陽性成員852名，配以年齡、性別相近、 居所相鄰的HBsAg陰性成員786名，共計(jì)1638人。隊(duì)列成員每年隨訪一次，留有完整的隨訪資料，血清每年收集一次，于-40°C保存。本研究驗(yàn)證階段中的病人血清樣品均取自于此隊(duì)列HBsAg陽性組。慢性肝炎患者診斷符合2000年全國傳染病與寄生蟲病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《病毒性肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn)；肝癌診斷符合2001年中國抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì)通過的的《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期》標(biāo)準(zhǔn)。在驗(yàn)證階段的病例-對(duì)照研究中，選取了 206份病人樣品，其中103份來自于肝癌患者，103份來自于慢性肝炎患者，兩組的年齡、性別比率及HBV基因型分布均無顯著性差異(表1)。研究對(duì)象的性別比率符合我國肝癌發(fā)病性別比(男女約為4-5 1)；研究對(duì)象的HBV基因型分布符合肝癌高發(fā)區(qū)HBV流行情況，為研究的準(zhǔn)確性奠定了基礎(chǔ)。在驗(yàn)證階段的縱向調(diào)查研究中，選取了 5位肝癌確診當(dāng)年伴有G1899A和/或 A2159G和/或A2189C的患者樣品進(jìn)行研究，每一患者診斷肝癌前2到8年的血清中至少有 2份血清樣品可供研究。本研究的試劑盒應(yīng)用階段所使用的隨訪病人血清樣品來自上海大華醫(yī)院。在回顧性研究中，共選取了 100份病人樣品，其中50份來自肝炎患者，50份來自慢性肝炎患者。本研究的試劑盒應(yīng)用階段所使用的200名HBsAg陽性隨訪病人血清樣品，來自上海大華醫(yī)院。本研究中的樣品的采集都獲得了病人或研究對(duì)象的同意。表1驗(yàn)證研究中的肝癌和慢性肝炎患者臨床情況及基本病毒學(xué)參數(shù)
HCC (η = 103)CH (η = 103)P值年齡50. 58 ±10. 4448. 54±10. 140. 157性別，男89(86. 4% )89(86. 4% )1. 000B基因型7(6. 8% )5(4. 9% )0. 552C基因型90(87. 4% )88(85. 4% )0. 684其他基因型6(5. 8% )10(9. 7% )0. 298其中，HCC表示肝癌；CH表示慢性肝炎。2血清HBV DNA的抽提采用經(jīng)典的蛋白酶消化/酚-氯仿-異戊醇抽提法提取血清中HBV DNA。取血清 100 μ 1 加入 400 μ 1 裂解液(10mmol/L Tris-HCl ρΗ8· 0，lmmol/L EDTA, 1 OOmmo 1/L NaCl， 0. 5 % SDS，蛋白酶K 120 μ g/μ 1)50 V消化4h后加等體積酚_氯仿-異戊醇(體積比 25 24 1)抽提一次，8000r/min離心15min，上清液中加1/10體積的3mol/L乙酸鈉 (pH5. 2)和2倍體積的無水乙醇沉淀DNA。70%乙醇洗沉淀一次，沉淀揮干后重懸于30 μ 1 含20 μ g/ml的RNA酶A無菌水中。3HBV全基因序列的擴(kuò)增與測(cè)序(供HBV全基因篩選肝癌相關(guān)變異)以抽提好的HBV DNA為模板擴(kuò)增HBV全基因序列，正向引物為FF1，反向引物為 FRl (表2)。將PCR產(chǎn)物克隆入T載體，應(yīng)用T載體通用引物ml3+47/ml3-48及HBV特異性引物 HBV3096F/HBV2415F/HBV786R/HBV1329R(表 2)對(duì) HBV 全基因序列進(jìn)行測(cè)序。PCR 反應(yīng)體積為50 μ 1，含IXPCR緩沖液(MgCl2L 5mM), dNTP 0. 2mM，正、反向引物各0. 2 μ M，血清 HBV DNA 1 μ 1，LA Taq IU(日本Takara公司)。擴(kuò)增經(jīng)預(yù)變性94°C 3min后，進(jìn)入35個(gè)循環(huán)程序94°C 30sec/65°C 30min/72°C 3. 5min，最后 72°C延鏈 7min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) AxyPr印試劑盒(杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)純化后，送全自動(dòng)測(cè)序(上海聯(lián)合基因有限公司)。
4HBV前C/C區(qū)核苷酸第1824-2275位的擴(kuò)增(供驗(yàn)證HBV前C/C區(qū)肝癌相關(guān)位
點(diǎn))以抽提好的HBV DNA為模板，采用半巢式PCR的方法擴(kuò)增HBV前C區(qū)/C區(qū) nt. 1824-2275。第一輪，正向引物為Pre-C F1，反向引物為HBV2433R ；第二輪，正向引物序列與第一輪正向引物相同，反向引物為Pre-C R2 (見表2)。PCR反應(yīng)體積為25 μ 1，各成分終濃度為PCR 緩沖液 IX (MgCl2L 5mmol/L)，dNTP 0. 2mmol/L，正、反引物各 0. 4 μ mol/L，血清HBV DNA 2 μ 1，TakaRa LA Taq IU(日本TaKaRa公司)。半巢式PCR2輪擴(kuò)增條件相同，均采用熱啟動(dòng)PCR，經(jīng)預(yù)變性94°C 3min后，進(jìn)入循環(huán)程序94°C 30sec/60°C 30sec/72°C lmin, 共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)AxyPr印試劑盒(杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)純化后，送全自動(dòng)測(cè)序(上海聯(lián)合基因有限公司)。表2寡核苷酸引物
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)核酸樣品中是否存在乙型肝炎病毒前C/C區(qū)變異的試劑盒，其特征在于， 它包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899位為堿基“A”的序列的引物；和/或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899位為堿基“A”的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899位為堿基“A” 的序列的限制性內(nèi)切酶。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2159位為堿基“G”的序列的引物；和/或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2159位為堿基“G”的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2159位為堿基“G” 的序列的限制性內(nèi)切酶。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2189位為堿基“C”的序列的引物；和/或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2189位為堿基“C”的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2189位為堿基“C” 的序列的限制性內(nèi)切酶。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2203位為堿基“W”的序列的引物；和/或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2203位為堿基“W”的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2203位為堿基“W” 的序列的限制性內(nèi)切酶。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的乙型肝炎病毒的基因型是B基因型或C基因型。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物是具有SEQID N0:15和SEQ ID NO: 16所示序列的引物對(duì)。
7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的探針具有選自SEQIDNO =18,20, 22、和24中任一所示的序列。
8.—種體外檢測(cè)核酸樣品中乙型肝炎病毒前C/C區(qū)變異的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟檢測(cè)該核酸樣品的乙型肝炎病毒前C/C區(qū)，并與野生型的乙型肝炎病毒前C/C區(qū)比較， 存在選自以下變異形式就表明該個(gè)體乙型肝炎病毒前C/C區(qū)存在核苷酸變異乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899位，G-A0
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的變異形式還包括選自下組的一種或多種乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2159位，A — G ； 乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2189位，A — C ；或乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第2203位，G — W。
10.一種乙型肝炎病毒前C/C區(qū)核苷酸序列的用途，其特征在于，用于制備肝癌預(yù)測(cè)或肝癌早期輔助診斷的試劑或試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒前C/C區(qū)變異及其用途。具體地，本發(fā)明公開了檢測(cè)核酸樣品中是否存在乙型肝炎病毒前C/C區(qū)變異的試劑或試劑盒。本發(fā)明還公開了體外檢測(cè)核酸樣品中乙型肝炎病毒前C/C區(qū)變異的方法。本發(fā)明的研究表明，乙型肝炎病毒前C/C區(qū)第1899、2159、2189、和/或2203位的堿基的突變與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，可作為肝癌預(yù)測(cè)/肝癌早期輔助診斷的分子標(biāo)志物。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102212619SQ20101014473
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2010年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日
發(fā)明者屠紅, 朱宇, 金晏, 錢耕蓀 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所