專利名稱：：生物轉(zhuǎn)化制備4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒盏姆椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重要的活性物質(zhì)前體4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒盏纳镛D(zhuǎn)化制備的方法，屬于生物轉(zhuǎn)化
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：萊菔硫烷(sulforaphane)是迄今為止從蔬菜中發(fā)現(xiàn)的最具抗癌活性的化合物，大量研究證明，萊菔硫烷對(duì)食道癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌及大腸癌等都有很好的預(yù)防效果。其前體物4甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷主要存在于十字花科蔬菜西蘭花種子當(dāng)中。目前,萊菔硫烷主要是通過水解西蘭花種子中的4甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷,然后經(jīng)過分離純化制備而得。目前，4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒罩饕ㄟ^天然產(chǎn)物提取的方法獲得將十字花科植物西蘭花種子高溫滅酶，以沸水或醇水體系作回流提取溶劑，將提取液過濾蒸干得到硫代葡萄糖苷粗提物,制備高純度硫代葡萄糖苷,可采用酸性氧化鋁色譜柱、大孔強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂以及制備色譜等技術(shù)進(jìn)一步除雜純化。在所有十字花科植物種子中，4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒赵谖魈m花種子中含量最高,但西蘭花種子價(jià)格比較昂貴，原料成本較高，嚴(yán)重限制工業(yè)化生產(chǎn)。萊菔子容易獲得且價(jià)格低廉,其價(jià)格是西蘭花種子的三十分之一。其主要硫甙甲基亞硫?；?-3_丁烯基硫代葡萄糖苷的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)為直鏈烷基,與4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒战Y(jié)構(gòu)相似，僅在3、4位相差一個(gè)C=C。所以由4-(甲基亞硫?；?-3_丁烯基硫代葡萄糖苷向4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒盏霓D(zhuǎn)化工藝將會(huì)大大減少生產(chǎn)萊菔硫烷的生產(chǎn)成本,可促進(jìn)萊菔硫烷的工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)有技術(shù)中，已有一項(xiàng)美國(guó)專利7，371，419中報(bào)道,通過對(duì)從萊菔子中提取得到的4-(甲基亞硫?；?-3-丁烯基硫代葡萄糖苷粗品進(jìn)行化學(xué)合成催化加氫也生成了4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷，該方法使用的高壓反應(yīng)釜作為反應(yīng)容器，鈀碳等作為化學(xué)催化劑,并通入氫氣,在高壓環(huán)境下進(jìn)行多次化學(xué)合成反應(yīng)。由于4-(甲基亞硫酰基丁烯基硫代葡萄糖苷在高壓下極易分解變質(zhì)，導(dǎo)致催化效率波動(dòng)范圍較大,反應(yīng)不穩(wěn)定,重復(fù)性較差，且該反應(yīng)對(duì)設(shè)備耐壓耐熱要求較高，能耗高，存在大量的副反應(yīng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為克服上述缺點(diǎn)，提出采用生物催化生成4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒盏姆椒ǎ〈谢瘜W(xué)催化。該方法工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，易于工業(yè)化生產(chǎn)。其反應(yīng)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>1:4-(甲基亞硫?；?丁烯基硫代葡萄糖苷24-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的一種生物轉(zhuǎn)化制備4甲基亞硫?；』虼咸烟擒盏姆椒?，所述方法包括在以4-(甲基亞硫?；?丁烯基硫代葡萄糖苷為底物、以面包酵母、深紅酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗頭孢中的一種菌種的發(fā)酵產(chǎn)物為酶源的反應(yīng)體系中，于溫度25-350CT進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述的4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒?；所述發(fā)酵產(chǎn)物為所用菌種經(jīng)發(fā)酵獲得的發(fā)酵液或濕菌體；可將濕菌體加入含有底物4-(甲基亞硫?；?丁烯基硫代葡萄糖苷底物的緩沖溶液中作為反應(yīng)體系，或直接按需要量將底物加入發(fā)酵液中作為反應(yīng)體系。所述的微生物催化合成4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法，其特征在于所述菌種為面包酵母、深紅酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗頭孢。所述發(fā)酵液或者濕菌體由如下方法制備得到將面包酵母、深紅酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗頭孢其中一種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,于該菌體常規(guī)適宜生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)1648小時(shí)后，得發(fā)酵液，將發(fā)酵液于5000r/min離心10分鐘得到濕菌體。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為常規(guī)適用于該菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為10-lOOmg/ral,發(fā)酵產(chǎn)物加入量以所含濕菌體的濕重計(jì)為50400g/l。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進(jìn)行稱重。所述反應(yīng)體系中添加有終濃度為10-100g/L的葡萄糖作為輔助底物，可以促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行。優(yōu)選的,所述反應(yīng)體系的溶劑為0.1M，pH8.O的磷酸鹽緩沖液，將底物和濕菌體加入磷酸鹽緩沖液中，作為反應(yīng)體系。所述對(duì)稱還原反應(yīng)的反應(yīng)溫度為2535°C，反應(yīng)時(shí)間為24120小時(shí)，在此條件下所得的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行液相色譜、質(zhì)譜分析測(cè)定表明，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要組分4甲基亞硫?；』虼咸烟恰Ｋ龅木唧w實(shí)驗(yàn)方法如下(1)斜面培養(yǎng)適用于所用菌種的斜面培養(yǎng)基接種該菌株，3(TC斜面培養(yǎng)35天，作為斜面種子；(2)種子培養(yǎng)適用于所用菌種的種子培養(yǎng)基接入斜面種子,2535°C，搖床轉(zhuǎn)速100250r/min,培養(yǎng)1030小時(shí)，作為種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)種子液以510%體積比接種量接種至適用于所用菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基，2535°C，搖床轉(zhuǎn)速100250r/min，培養(yǎng)1648小時(shí)，作為種子液；(4)微生物轉(zhuǎn)化將發(fā)酵液于5000r/min離心10分鐘，將濕菌體轉(zhuǎn)入0.1M，PH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時(shí)加入底物4(甲基亞硫?；∠┗虼咸烟擒?使底物濃度為10-100mg/ml,菌體濃度為50400g/l,并添加終濃度為10lOOg/Ι的葡萄糖作為輔助底物，于25350CUOO250r/min反應(yīng)24120小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，離心除去菌體，濃縮干燥，得到所述的4甲基亞硫?；』虼咸烟擒?。優(yōu)選的,所述方法如下(1)斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為(終濃度)麥芽汁10g/L,酵母粉3g/L,蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L，pH6.5，其余為水。121Γ滅菌20分鐘，滅菌后冷卻菌種，菌種為面包酵母或深紅酵母菌株，3CTC斜面培養(yǎng)35天，作為斜面種子；(2)種子培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為(終濃度)麥芽糖30g/L,酵母膏2g/L,NH4CL5g/L,KH2PO4lg/L,K2HPO4lg/L,MgS04·TH2O0.4g/L,pH6.5，其余為水。裝液量為250ml三角瓶裝液60ml,12CTC滅菌20分鐘，滅菌后接入斜面種子，置旋轉(zhuǎn)式搖床，100-250r/min,2535°C，培養(yǎng)1030小時(shí),作為種子液；(8)發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為(終濃度)麥芽糖30g/L,酵母膏2g/L,NH4CL5g/L,KH2PO4IgZL,K2HPO4IgZL,MgS04·7Η200·4g/L,ρΗ6.5,其余為水。裝液量為250ml三角瓶裝液60ml，120°C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻，以5%-10%體積比接種種子液，2528°C，搖床轉(zhuǎn)速100250r/min，培養(yǎng)1648小時(shí),得發(fā)酵液；(4)微生物轉(zhuǎn)化將發(fā)酵液于5000r/min離心10分鐘,收集菌體，用0.1M,PH8.0的磷酸鹽緩沖液洗滌后，將濕菌體轉(zhuǎn)入0.1M,PH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時(shí)加入底物4-(甲基亞硫?；?-3_丁烯基硫代葡萄糖苷，使底物濃度為10-100mg/ml,菌體濃度為50400g/l，并添加終濃度為10lOOg/的葡萄糖作為輔助底物，于2535°C、100250r/min反應(yīng)24120小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后,離心除去菌體,濃縮干燥,得到所述的4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒?。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明通過菌種優(yōu)選，確定面包酵母、深紅酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗頭孢作為產(chǎn)酶菌株,在單一水相體系中催化還原甲基亞硫?；∠┗虼咸烟擒丈?甲基亞硫?；』虼咸烟擒?。原有化學(xué)合成技術(shù)中使用的高壓反應(yīng)釜作為反應(yīng)容器,鈀碳等作為化學(xué)催化劑,并通入氫氣，在高壓環(huán)境下進(jìn)行多次化學(xué)合成反應(yīng)。由于4-(甲基亞硫酰基)-3_丁烯基硫代葡萄糖苷在高壓下極易分解變質(zhì)，導(dǎo)致催化效率低下,且該反應(yīng)對(duì)設(shè)備耐壓耐熱要求較高，能耗高，且存在大量的副反應(yīng)。本發(fā)明取代原有的化學(xué)合成技術(shù),在單一水相中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫和且催化效率高，無副反應(yīng)；并且在常溫常壓下進(jìn)行,不需要加熱設(shè)備,操作簡(jiǎn)單,能耗較低且對(duì)環(huán)境無污染，適宜于進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1:面包酵母對(duì)4_(甲基亞硫?；?-3-丁烯基硫代葡萄糖苷的生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為(終濃度)麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L,瓊脂20g/L，pH6.5，其余為水。121滅菌20分鐘，滅菌后冷卻菌種，菌種為面包酵母菌株，28°C培養(yǎng)48小時(shí)，作為斜面活化種子。種子培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為(終濃度):麥芽糖30g/L,酵母膏2g/L,NH4CL5g/L,KH2PO4IgZL,K2HPO4lg/L,MgS04·7H200.4g/L,pH6.5，其余為水。裝液量為250ml三角瓶裝液60ml,120°C滅菌20分鐘,滅菌后冷卻接種斜面種子，置旋轉(zhuǎn)式搖床,200rpm，30°C培養(yǎng)24小時(shí),作為種子液；發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為(終濃度)麥芽糖30g/L,酵母膏2g/L,NH4CL5g/L,KH2PO4lg/L,K2HPO4lg/L,MgS04·TH2O0.4g/L，pH6.5，其余為水。裝液量為250ml三角瓶裝液60ml,120°C滅菌20分鐘,滅菌后冷卻接種種子液(接種量5%體積比),置旋轉(zhuǎn)式搖床，200rpra,30°C培養(yǎng)48小時(shí)，使菌體旺盛生長(zhǎng)；上述發(fā)酵液離心10分鐘(5000r/min)收集菌體,用磷酸鈉緩沖液(0.1M,pH8.0)洗滌兩次，將面包酵母濕菌體轉(zhuǎn)入60ml相同組成的緩沖液中，同時(shí)加入底物40mg85%4-(甲基亞硫?；?-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，加入0.7g葡萄糖，于30°C，200r/min下反應(yīng)96小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束，離心除去菌體得上清液。上清液用().22μm水膜過濾后進(jìn)行液相色譜分析4-(甲基亞硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷和4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒蘸?。結(jié)果顯示，面包酵母對(duì)4-(甲基亞硫?；?-3-丁烯基硫代葡萄糖苷具有催化還原能力，其轉(zhuǎn)化率為54.5%。實(shí)施例2深紅酵母對(duì)4_(甲基亞硫?；?-3-丁烯基硫代葡萄糖苷的生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為(終濃度)麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L,pH6.5，其余為水。121°C滅菌20分鐘,滅菌后冷卻菌種，菌種為深紅酵母菌株,30°C培養(yǎng)48小時(shí),作為斜面活化種子。種子培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為(終濃度)麥芽糖30g/L,酵母膏2g/L,NH4CL5g/L,KH2PO4lg/L,K2HPO4lg/L,MgS04·TH2O0.4g/L,pH6.5，其余為水。裝液量為250ml三角瓶裝液60ml，120°C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種斜面種子，置旋轉(zhuǎn)式搖床，200rpm,3(TC培養(yǎng)24小時(shí)，作為種子液；發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為(終濃度)麥芽糖30g/L,酵母膏2g/L,NH4CL5g/L,KH2PO4IgZL,K2HPO4IgZL,MgS04·7H200.4g/L，pH6.5，其余為水。裝液量為250ml三角瓶裝液60ml，120°C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種種子液(接種量5%體積比)，置旋轉(zhuǎn)式搖床，200rpm,30°C培養(yǎng)24小時(shí),使菌體旺盛生長(zhǎng)；在上述發(fā)酵液中加入底物35mg90%4_(甲基亞硫?；?_3_丁烯基硫代葡萄糖苷，于30°C，200r/min下反應(yīng)72小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束，離心除去菌體得....t清液。....t清液用0.22μm水膜過濾后進(jìn)行液相色譜分析4(甲基亞硫酰基)丁烯基硫代葡萄糖苷和4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒蘸俊＝Y(jié)果顯示,面包酵母對(duì)4(甲基亞硫?；∠┗虼咸烟擒站哂写呋€原能力,其轉(zhuǎn)化率為75.3%。實(shí)施例3束梗頭孢對(duì)4-(甲基亞硫?；?-3-丁烯基硫代葡萄糖苷生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所有培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)均在土豆培養(yǎng)基中進(jìn)行。土豆培養(yǎng)基的配制方法將200g去皮土豆切成小塊，加適量水煮沸30分鐘后，用紗布將過濾，濾液中加入20g葡萄糖，加水定容至1升，分裝，116°C滅菌30分鐘，備用。斜面培養(yǎng)固體土豆培養(yǎng)基，pH6.5,116°C滅菌30分鐘,滅菌后冷卻，接入菌種，28°C培養(yǎng)72小時(shí),作為斜面活化種子。種子培養(yǎng)液態(tài)土豆培養(yǎng)基，pH6.5，裝液量為250ml三角瓶裝液60ml，116°C滅菌30分鐘，滅菌后冷卻接種斜面種子,置旋轉(zhuǎn)式搖床，160rpm,30°C培養(yǎng)24小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)接種種子液(接種量3%體積比)接入250m:[三角瓶(裝有60ral土豆培養(yǎng)基)中，160rpm、28°C下震蕩培養(yǎng)48小時(shí),得發(fā)酵液。上述發(fā)酵液離心10分鐘(5000r/min)收集菌體，用磷酸鈉緩沖液(0.1M，ρΗ8.0)洗滌兩次，將得到濕菌體轉(zhuǎn)入60ml相同組成的磷酸鈉緩沖液中，同時(shí)加入底物SOmg85%4-(甲基亞硫?；?-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，加入().Sg葡萄糖，于28°C，160r/min下反應(yīng)120小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后,離心除去菌體得上清液。上清液用0.22μm水膜過濾后進(jìn)行液相色譜分析4_(甲基亞硫?；?-3-丁烯基硫代葡萄糖苷和4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷含量。結(jié)果顯示，束梗頭孢對(duì)4(甲基亞硫?；?丁烯基硫代葡萄糖苷具有催化還原能力,其轉(zhuǎn)化率為74.6%ο實(shí)施例4白地霉、白僵霉、黑曲霉4_(甲基亞硫?；?-3_丁烯基硫代葡萄糖苷生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。所有培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)均在土豆培養(yǎng)基中進(jìn)行。斜面培養(yǎng)同實(shí)施例3種子培養(yǎng)方法同實(shí)施例3，具體參數(shù)見表1發(fā)酵培養(yǎng)方法同實(shí)施例3,具體參數(shù)見表1在發(fā)酵培養(yǎng)所得的發(fā)酵液中，直接加入底物,進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束,離心除去菌體得上清液。上清液用0.22μm水膜過濾后進(jìn)行液相色譜分析4-(甲基亞硫?；?-3"丁烯基硫代葡萄糖苷和4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒蘸?。具體參數(shù)及相應(yīng)結(jié)果見表2.表1.白地霉、白僵霉、黑曲霉種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)條件參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2.白地霉、白僵霉、黑曲霉對(duì)底物轉(zhuǎn)化條件及轉(zhuǎn)化率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求一種生物轉(zhuǎn)化制備4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒盏姆椒?，其特征在于，步驟如下在以4-(甲基亞硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷為底物、以面包酵母、深紅酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗頭孢中的一種菌種的發(fā)酵產(chǎn)物為酶源的反應(yīng)體系中，于溫度25-35℃下反應(yīng)24～120小時(shí)得到轉(zhuǎn)化液；反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離濃縮得到所述的4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒眨凰霭l(fā)酵產(chǎn)物為所用菌種經(jīng)發(fā)酵獲得的發(fā)酵液或濕菌體；直接將底物添加到菌種發(fā)酵所獲得的發(fā)酵液中進(jìn)行反應(yīng)；或者將發(fā)酵液過濾得到濕菌體，并添加葡萄糖作為輔助底物，在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。2.如權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于反應(yīng)體系中底物初始濃度為10-100mg/L,發(fā)酵產(chǎn)物加入量以所含濕菌體的濕重計(jì)為50400g/l。3.如權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵產(chǎn)物由如下方法制備得到菌體接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于溫度25-35°C下培養(yǎng)16-48小時(shí)后,得到發(fā)酵液，或者將發(fā)酵液在5000r/min離心10分鐘過濾得到濕菌體。4.如權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在以所述反應(yīng)體系中添加葡萄糖濃度為10lOOg/lo5.如權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于所述磷酸鹽緩沖液為().lM，pH8.0的磷酸鹽緩沖液。全文摘要本發(fā)明提供了一種微生物生物轉(zhuǎn)化制備4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒盏姆椒ǎ龇椒òㄔ谝?-(甲基亞硫?；?-3-丁烯基硫代葡萄糖苷為底物、利用面包酵母、深紅酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗頭孢中的一種，于溫度25-35℃下進(jìn)行對(duì)稱還原反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后得到所述的4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒铡１景l(fā)明在單一水相體系中催化4-(甲基亞硫?；?-3-丁烯基硫代葡萄糖苷生成4-甲基亞硫?；』虼咸烟擒眨磻?yīng)條件溫和，設(shè)備簡(jiǎn)單，能耗低，具有很好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12R1/745GK101831479SQ201010159808公開日2010年9月15日申請(qǐng)日期2010年4月23日優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日發(fā)明者李立光,梁浩,袁其朋,谷友剛申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)