專利名稱：一種用于Vero細(xì)胞微載體培養(yǎng)的無動(dòng)物來源成分無血清培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于Vero細(xì)胞微載體培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，更具體地說是用于 Vero細(xì)胞微載體固定化培養(yǎng)的無動(dòng)物來源成分無血清培養(yǎng)基，屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Vero細(xì)胞(African green kidney cell,Vero cell)是世界衛(wèi)生組織和我國(guó)生物 制品規(guī)程贊同的疫苗生產(chǎn)細(xì)胞系，是現(xiàn)階段病毒疫苗生產(chǎn)的最主要細(xì)胞基質(zhì)。與用作疫苗 生產(chǎn)的原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和其它一些傳代細(xì)胞基質(zhì)相比，Vero細(xì)胞具有以下特點(diǎn)① 來源方便，可連續(xù)傳代，生長(zhǎng)速度快；②對(duì)多種病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高；③遺傳 性狀穩(wěn)定，惡性轉(zhuǎn)化程度低，生物安全性較高；④培養(yǎng)條件要求不苛刻，易于在生物反應(yīng)器 實(shí)施大規(guī)模培養(yǎng)。Vero細(xì)胞的貼附依賴生長(zhǎng)特性，決定了其需要在適宜的介質(zhì)表面貼附、鋪展為前 提的貼壁培養(yǎng)(anchorage-d印endent culture)模式。Vero細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的最經(jīng)典和簡(jiǎn)便 方法是以組織培養(yǎng)瓶(T-flask)和轉(zhuǎn)瓶(roller bottle)的內(nèi)表面為介質(zhì)貼附生長(zhǎng)。這些 培養(yǎng)體系所能提供的細(xì)胞生長(zhǎng)面積有限，細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模的放大只能依賴培養(yǎng)單元的增加， 由此給疫苗生產(chǎn)帶來諸如污染風(fēng)險(xiǎn)大、生產(chǎn)效率低、產(chǎn)品質(zhì)量可控性差以及人力資源需求 大等弊端。微載體培養(yǎng)(microcarrier culture)是融合懸浮培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)的一種特化的細(xì)胞 貼壁培養(yǎng)模式。其基本特征是細(xì)胞貼附于微載體表面并隨其共同懸浮于培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。微 載體的應(yīng)用不僅大大增加了單位培養(yǎng)體積中細(xì)胞賴以生長(zhǎng)的表面積，同時(shí)也加大了細(xì)胞培 養(yǎng)過程監(jiān)測(cè)和控制以及細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模放大的可實(shí)施程度。疫苗的接種對(duì)象主要是針對(duì)大范圍的健康人群，其質(zhì)量和安全性一直是備受關(guān)注 的首要問題。疫苗的質(zhì)量和安全性在很大程度上取決于疫苗的生產(chǎn)方式和過程。血清是 一種組份復(fù)雜而尚不完全明確的混合物，其中，至少含有1000種不同蛋白質(zhì)，總蛋白量高 達(dá)60-150g/L。它能為細(xì)胞的體外培養(yǎng)提供必要的生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞貼附因子和營(yíng)養(yǎng)成 分。受Vero細(xì)胞自身的貼附依賴生長(zhǎng)特性和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展進(jìn)程的影響，本世紀(jì)之 前的Vero細(xì)胞培養(yǎng)及病毒疫苗生產(chǎn)均存在著對(duì)血清的依賴。血清組分的復(fù)雜性和不確定 性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，影響著病毒疫苗的生產(chǎn)工藝和疫苗 質(zhì)量。從病毒疫苗生產(chǎn)工藝角度的考慮，血清組分的復(fù)雜性和批次間的質(zhì)量差異增加了病 毒疫苗生產(chǎn)的不穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量控制的難度；從病毒疫苗的安全性考慮，血清中潛在的 病原微生物，如引起牛海綿狀腦炎(bovine spongiform encephalopathy)的朊病毒，給疫 苗的使用帶來了不容忽視的安全隱患。由血清使用所造成的細(xì)胞培養(yǎng)過程和細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物安全性的不確定因素增加的 現(xiàn)實(shí)問題，成為動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)研究和應(yīng)用的發(fā)展動(dòng)因。隨著動(dòng)物細(xì)胞無血清培 養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，為包括Vero細(xì)胞在內(nèi)的動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用提供 了必要的技術(shù)支撐，無血清培養(yǎng)已成為包括疫苗在內(nèi)的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)的總趨勢(shì)。美國(guó)、歐盟和日本等發(fā)達(dá)國(guó)家將于2010年全面停止在生物制藥中應(yīng)用血清，F(xiàn)DA將停止含血清細(xì) 胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)的生物技術(shù)新藥的申報(bào)受理。培養(yǎng)基是影響體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)、代謝、增殖乃至生存的最直接和最重要 的環(huán)境因素。由于Vero細(xì)胞的培養(yǎng)需要在適宜的介質(zhì)表面貼附、鋪展才開始有絲分裂、增 殖，病毒的有效感染和增殖也有賴于細(xì)胞的貼附生長(zhǎng)狀態(tài)，適用于Vero細(xì)胞微載體培養(yǎng)的 無血清培養(yǎng)基應(yīng)能有效地支持細(xì)胞在微載體表面的貼附、鋪展。由此，不僅提高了 Vero細(xì) 胞無血清培養(yǎng)基配方成分的復(fù)雜程度，也加大了 Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的成本控制壓力。文獻(xiàn)報(bào)道的Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基包含牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、動(dòng)物明膠(膠原)等動(dòng)物來源的添加成分。含BSA、動(dòng)物明膠(膠原)等動(dòng)物來源添 加成分的無血清培養(yǎng)基在很大程度上遺留著動(dòng)物來源血清在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用中可能 產(chǎn)生的上述問題。盡管國(guó)外已有多種商品化的Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基上市，如美國(guó)Invitrogen 公司的 VP-SFM 禾P OptiPro SFM、AXCELL Biotechnologies 公司的 MDSS2、JRH 公司的 EX-CELL VER0等。但商品化的Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基不同程度存在諸如培養(yǎng)基大多以液 體的形式提供、價(jià)格昂貴、培養(yǎng)基的成分配方秘而不宣、細(xì)胞由含血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無血清培 養(yǎng)基培養(yǎng)存在適應(yīng)過程等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于Vero細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基 具有不含動(dòng)物來源成分、能支持Vero細(xì)胞貼附于微載體表面快速生長(zhǎng)、Vero細(xì)胞由含血清 培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)無需經(jīng)過適應(yīng)過程的特點(diǎn)。本發(fā)明采用的構(gòu)思在于1)合成培養(yǎng)基中缺少能支持動(dòng)物細(xì)胞貼附培養(yǎng)的成分， 補(bǔ)充某些具有促進(jìn)細(xì)胞貼附和伸展的成分方可支持Vero細(xì)胞貼附于微載體表面生長(zhǎng)；2) 某些在常規(guī)使用濃度或單獨(dú)使用時(shí)不具有明顯促進(jìn)細(xì)胞黏附作用的培養(yǎng)基成分，在較高使 用濃度和/或聯(lián)合使用時(shí)可表現(xiàn)為明顯的促進(jìn)細(xì)胞黏附和伸展的效應(yīng)3)在合成培養(yǎng)基中 加入某些激素和生長(zhǎng)因子能有效地促進(jìn)Vero細(xì)胞的分裂增殖；4)合成培養(yǎng)基的配方均不 是針對(duì)Vero細(xì)胞而設(shè)計(jì)的，雖然其能基本滿足Vero細(xì)體外胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，但其中的碳 水化合物、氨基酸和無機(jī)鹽等成份仍存在較大的調(diào)整和優(yōu)化空間?；谝陨峡紤]，本發(fā)明的 無血清培養(yǎng)基在DMEM/F12(1 1)培養(yǎng)基中加入了以下成分；(1)表皮生長(zhǎng)因子具有促進(jìn)多種類型細(xì)胞有絲分裂的作用。(2)胰島素促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖和氨基酸的攝取、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。(3)血清胺廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中的血管收縮劑和平滑肌收縮刺激劑，具 有促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)的作用。(4)金精三羧酸金屬鰲合劑，具有結(jié)合、運(yùn)輸和傳遞Fe2+，部分地替代鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 的功能，同時(shí)也能通過結(jié)合和運(yùn)輸Ca2+、Me2+促進(jìn)細(xì)胞的黏附和伸展。(5)微量元素Cu、Fe、Se、Ze和Mg等微量元素，主要作為酶的輔基參與細(xì)胞代謝 的調(diào)節(jié)。其中Cu 超氧化物岐化酶的輔基、具有抗氧化的作用。Fe 細(xì)胞色素酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等和血紅素的輔基，參與線粒體呼吸鏈的組成。Se 谷胱甘肽還原酶的組成部分、具有抗氧化的作用。Zn和Me 作為酶的輔基與200多種酶的活性或結(jié)構(gòu)有關(guān)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)合 成和核酸代謝的調(diào)控。此外Me還通過作用于細(xì)胞膜表面的整聯(lián)蛋白介導(dǎo)細(xì)胞的黏附和伸展。(6)氨基酸培養(yǎng)基中氨基酸的濃度通常限制著細(xì)胞生長(zhǎng)所能達(dá)到的最大密度及 細(xì)胞活力狀態(tài)，不同細(xì)胞對(duì)氨基酸的需求可能存在明顯的差別，這些氨基酸既包括特定細(xì) 胞類型不能合成的必需氨基酸，也包括細(xì)胞能夠合成，但消耗速率大于細(xì)胞合成能力的非 必需氨基酸。此外，某些氨基酸在較高的濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)細(xì)胞黏附的作用。(7)生物素參與羧化、糖原異生和蛋白質(zhì)合成等生化反映，對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的生 長(zhǎng)和黏附具有一定的促進(jìn)作用。(8)單糖和雙糖果糖可部分地替代葡萄糖作為細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的能量來源之一、 減少培養(yǎng)基中因葡萄糖無氧酵解產(chǎn)生的乳酸堆積。海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子結(jié)合而成的 非還原性雙糖，對(duì)激素、生長(zhǎng)因子和酶等生物大分子具有非特異的保護(hù)作用，也可作為細(xì)胞 代謝的能源物質(zhì)。(9)乙醇胺磷脂和細(xì)胞膜合成的前體物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。(10)維生素C 參與生物氧化和還原及細(xì)胞呼吸過程，具有促進(jìn)酪氨酸和色氨酸 代謝以及膠原合成作用。(11)羥丙基-環(huán)狀糊精貯存和運(yùn)送生物大分子，提高生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性 和生物利用度。根據(jù)以上發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明在DMEM/F12(1 1)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將上述物質(zhì)按以 下濃度(mg/L)加入到培養(yǎng)基中，組成了一種新的能支持Vero細(xì)胞微載體培養(yǎng)的無血清培 養(yǎng)基(表1)。表1支持Vero細(xì)胞微載體培養(yǎng)的無動(dòng)物來源成分無血清培養(yǎng)基_組成成分含量(mg/L)_DMEM/F12(1 1)培養(yǎng)基15600
表皮生長(zhǎng)因子0. 025 0.05
胰島素2. 5 10
金精三羧酸0. 005 0.02
血清胺0. 005 0.02
谷氨酰胺125 250
胱氨酸25 50
精氨酸100 200
甲硫氨酸50 100
絲氨酸25 50
天冬酰胺50 100
酪氨酸250 )500CuS04 5H20 FeS04 7H20 Na2Se03 ZnS04 7H20 MeCl2 乙醇胺
輕丙基環(huán)狀糊精
1000 2000 100 500 25 50 0. 01 0. 02 0. 001 0. 002 0. 5 1. 5 0. 005 0. 01 0. 1 0. 2 25 50 2. 5 5 250 500 本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基與現(xiàn)有Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基相比具有以下優(yōu)點(diǎn) ①能夠支持Vero細(xì)胞在組織培養(yǎng)瓶和微載體的表面貼附生長(zhǎng)，細(xì)胞由含血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)無需經(jīng)過適應(yīng)過程。②不含動(dòng)物來源成分、化學(xué)成分基本明確、成本低 廉。③細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞密度、形態(tài)和活力與含血清合成培養(yǎng)基本相同。下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1A為倒置顯微鏡下觀察的、在本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Vero細(xì)胞；圖1B為倒置顯微鏡下觀察到的、在含血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Vero細(xì)胞；圖2A為倒置顯微鏡下觀察的、在本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中貼附于Cytodex 1表面生 長(zhǎng)的Vero細(xì)胞；圖2B為倒置顯微鏡下觀察到的、在含血清培養(yǎng)基中貼附于Cytodex 1表面生長(zhǎng) Vero細(xì)胞；圖3為Vero細(xì)胞分別在本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中和含血清培養(yǎng)基中微載體固定化 培養(yǎng)的細(xì)胞密度變化。無血清培養(yǎng)基中的Vero細(xì)胞密度(〇)；血清培養(yǎng)基中的Vero細(xì) 胞密度(▲)。
具體實(shí)施例方式原材料來源DMEM/F12(1 1)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、金精三羧 酸、血清胺、生物素、海藻糖、果糖、維生素 C、CuS04 5H20、FeS04 7H20、Na2Se03、ZnS04 *7H20、 MeCl2、乙醇胺和羥丙基_ 0 _環(huán)狀糊精購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。谷氨酰胺、胱氨酸、精氨酸、甲 硫氨酸、絲氨酸、天冬酰胺和酪氨酸為美國(guó)Irwitrogen公司產(chǎn)品。實(shí)施例1在100ml組織培養(yǎng)瓶中貼附培養(yǎng)Vero細(xì)胞將表2所列培養(yǎng)基成分定溶于1000ml去離子水中，室溫下攪拌30min，使其充分溶 解。用0. 2 y m濾膜過濾除菌后，置4°C冰箱保存。表2在100ml組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)Vero細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基
果糖 海藻糖 維生素C 生物素
_組成成分含量(mg/L)_DMEM/F12(1 1)培養(yǎng)基15600
表皮生長(zhǎng)因子0. 025
胰島素2. 5
金精三羧酸0. 005
血清胺0. 005
谷氨酰胺125
胱氨酸25
精氨酸100
甲硫氨酸50
絲氨酸25
天冬酰胺50
酪氨酸250
果糖1000
海藻糖100
維生素C25
生物素0. 01
CuS04 5H200. 001
FeS04 7H200. 5
Na2Se030. 005
ZnS04 7H200. 1
MeCl225
乙醇胺2. 5
羥丙基環(huán)狀糊精250_將在100ml組織培養(yǎng)瓶中用含5% (v/v)小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞用0.25% (w/v)的胰蛋白酶室溫下消化2min。分別用表2所列的無血清培養(yǎng)基和含 5% (v/v)小牛血清的DMEM/F12分散細(xì)胞、調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2X105cells/ml。按10ml/ 瓶接種100ml組織培養(yǎng)瓶，37°C、5% C02靜止培養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照紀(jì) 錄。根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化，每天按50 100%培養(yǎng)體積分別更換新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)3d 后，Vero細(xì)胞在含5% (v/v)小牛血清的DMEM/F12和本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中匯合成單細(xì)胞 層、細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)多角形上皮樣細(xì)胞特征，如圖1B和圖1A所示。實(shí)施例2在250ml攪拌培養(yǎng)瓶中微載體固定化培養(yǎng)Vero細(xì)胞將在100ml組織培養(yǎng)瓶中用含5% (v/v)小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞用0.25% (w/v)的胰蛋白酶室溫下消化2min。分別用表3所列的無血清培養(yǎng)基和含 5% (v/v)小牛血清的DMEM/F12分散細(xì)胞，隨同經(jīng)預(yù)處理的Cytodex 1微載體(使用濃度 為2mg/ml)接種250ml攪拌培養(yǎng)瓶，接種密度為3X 105cells/ml、培養(yǎng)體積為100ml/瓶。
737°C,5% C02、30r/min懸浮培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化，每天按50 100%培養(yǎng)體積分別 更換新鮮培養(yǎng)基，整個(gè)培養(yǎng)過程持續(xù)7d。每隔24h取樣用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)用細(xì)胞 密度和活力自動(dòng)分析系統(tǒng)(CedeXA20，Innovatis)計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。
0097]表3在250ml攪拌培養(yǎng)瓶微載體固定化培養(yǎng)Vero0098]0099]組成成分含量(mg/L)0100]0101]DMEM/F12(1 1)培養(yǎng)基156000102]表皮生長(zhǎng)因子0. 050103]胰島素100104]金精三羧酸0. 020105]血清胺0. 020106]谷氨酰胺2500107]胱氨酸500108]精氨酸2000109]甲硫氨酸1000110]絲氨酸500111]天冬酰胺1000112]酪氨酸5000113]果糖20000114]海藻糖5000115]維生素C500116]生物素0. 020117]CuS04 5H200. 0020118]FeS04 7H201. 50119]Na2Se030. 010120]ZnS04 7H20 0. 20121]MeCl2 500122]乙醇胺 50123]羥丙基環(huán)狀糊精5000124]0125]培養(yǎng)5d后，用含5% (v/v)小牛血清的DMEM/F12
Vero細(xì)胞均在Cytodex 1微載體表面形成致密單層、細(xì)胞形態(tài)仍保持多角形上皮樣細(xì)胞特 征，如圖2B和圖2A所示。培養(yǎng)7d后，Vero的細(xì)胞密度由接種時(shí)的3X 105cellS/ml增加到 的培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的23. 4X 105cells/ml，如圖3所示。 本發(fā)明的特定實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做了詳盡的說明。對(duì)本領(lǐng)域的一般技術(shù) 人員而言，在不背離本發(fā)明精神的前提下對(duì)它所做的任何顯而易見的改動(dòng)，特別是對(duì)若干 步驟的等同替換，都構(gòu)成對(duì)本發(fā)明專利權(quán)的侵犯，將承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。
權(quán)利要求
一種用于Vero細(xì)胞微載體培養(yǎng)的無動(dòng)物來源成分無血清培養(yǎng)基，其特征在于所述的無血清培養(yǎng)基是由下列物質(zhì)按以下濃度mg/L，按1∶1加入到DMEM/F12培養(yǎng)基中組成的；表皮生長(zhǎng)因子 0.025～0.05胰島素2.5～10金精三羧酸0.005～0.02血清胺0.005～0.02谷氨酰胺 125～250胱氨酸25～50精氨酸100～200甲硫氨酸 50～100絲氨酸25～50天冬酰胺 50～100酪氨酸250～500果糖 1000～2000海藻糖100～500維生素C 25～50生物素0.01～0.02CuSO4·5H2O 0.001～0.002FeSO4·7H2O 0.5～1.5Na2SeO3 0.005～0.01ZnSO4·7H2O 0.1～0.2MeCl2 25～50乙醇胺2.5～5羥丙基-β-環(huán)狀糊精250～500
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于Vero細(xì)胞微載體培養(yǎng)的無動(dòng)物來源成分無血清培養(yǎng)基。該無血清培養(yǎng)基由DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基和表皮生長(zhǎng)因子、胰島素、血清胺、金精三羧酸、生物素、維生素C、氨基酸、果糖、海藻糖、微量元素、羥丙基-β-環(huán)狀糊精等培養(yǎng)基添加成分組成。本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基具有以下優(yōu)點(diǎn)①能夠支持Vero細(xì)胞在組織培養(yǎng)瓶和微載體的表面貼附生長(zhǎng)，細(xì)胞由含血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)無需經(jīng)過適應(yīng)過程。②不含動(dòng)物來源成分、化學(xué)成分基本明確、成本低廉。③細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)、密度、活力與含血清培養(yǎng)基基本相同。
文檔編號(hào)C12N5/071GK101864393SQ20101016437
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月6日
發(fā)明者劉興茂, 劉紅, 葉玲玲, 吳本傳, 李世崇, 王啟偉, 陳昭烈 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所