專利名稱：：無動物細胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于在沒有一級動物來源的外源成分的條件下培養(yǎng)動物，如哺乳動物的細胞的方法，具體地講，用于培養(yǎng)動物，如哺乳動物或優(yōu)選人，二倍體貼壁依賴性細胞，并且涉及基本上不含一級動物來源的外源成分的、適合執(zhí)行所述方法的細胞培養(yǎng)基。具體地講，本發(fā)明涉及包括至少一種，更優(yōu)選若干種，無外源動物的生長因子的細胞培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基特別適合培養(yǎng)動物，如哺乳動物，或優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細胞，例如，與用于所述細胞類型的補充了合適血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基具有等同的性能。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)動物，如哺乳動物，優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細胞的方法，包括將非動物來源的胰蛋白酶代用品用于使細胞傳代。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)病毒，和人病毒疫苗等的方法。
背景技術(shù)：
：貼壁依賴性細胞，特別是二倍體貼壁依賴性細胞被用于多種方法中用于大規(guī)模生物方法中生產(chǎn)保健品，如疫苗和重組蛋白，用于制備用來治療人體損傷的人工組織，用于實驗研究，用于體外毒理學(xué)研究，用于篩選和測試新的藥物等。通常，貼壁依賴性細胞是在含有血清或作為血清代用品的動物來源的成分，如牛血清白蛋白(BSA)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。血清或動物來源的成分還用在細胞轉(zhuǎn)種和細胞低溫貯藏期間。血清是代謝物，激素，維生素，鐵(轉(zhuǎn)鐵蛋白)，轉(zhuǎn)運蛋白，附著因子(例如，粘連蛋白)，擴散和生長因子的主要來源。它是很多動物細胞培養(yǎng)物在體外生長所需要的。另外，血清起著抗多種干擾和毒性作用，如pH改變，重金屬離子的存在，蛋白質(zhì)水解活性，或內(nèi)毒素的緩沖劑的作用。白蛋白是血清的主蛋白成分，并且能產(chǎn)生若干種作用，這些作用導(dǎo)致了細胞在培養(yǎng)物中的生長和維持它起著多種小分子的載體蛋白的作用，并且起著脂肪酸的轉(zhuǎn)運蛋白的作用，這些脂肪酸是細胞所必需的，但是在非結(jié)合形式下是有毒的。二倍體貼壁依賴性細胞通常在塑料表面，玻璃表面或微載體上生長。所述細胞通過諸如粘連蛋白的附著因子附著和擴散(F.Grinnel&M.K.FeldCell,1979，17，117-129)。胰蛋白酶是在細胞傳代期間用于細胞脫離的最常見的動物來源的成分之一(M,Schriider&P.Friedl，MethodsinCellScience,1997,19，137-147;O.W.Mertens，DevBiolStand"1999，Vol99，pp167-180)。在細胞脫離之后，必須通過血清或大豆胰蛋白酶抑制劑對它進行抑制，以便避免細胞損傷。在脫離之后，細胞以低密度接種在新的表面上，在這里，它們能夠增殖，并且形成匯合的細胞層，然后進行下一次轉(zhuǎn)種。對粘附細胞進行傳代的目的是增殖，并且獲得足夠數(shù)量的細胞，以便實施上述方法。有多種與將血清和動物來源的成分用于上述方法中相關(guān)的缺陷，主要是它們的成本，它們的組成在不同批次之間的波動性，它們與被外來制劑污染的較高風險相關(guān)性，以及隨后在后續(xù)處理中遇到的難題(例如，純化，以便消除血清-蛋白或所述導(dǎo)入的動物來源的蛋白)。另外，據(jù)報導(dǎo)無血清培養(yǎng)基不適合貼壁依賴性二倍體細胞(O.W.Mertens,DevBiolStand.，1999，Vol99，pp167-180;O.W.Merten，Dev.Biol.2002，101，233-257)。業(yè)已開發(fā)出了用于培養(yǎng)貼壁依賴性細胞具體地講，用于培養(yǎng)二倍體貼壁依賴性細胞的多種低血清或無血清培養(yǎng)基配方。(M.Kan&I.Yamane,JournalofCellularPhysiology,1982，111，155-162;S.P,Forestell等BiotechnologyandBioenineering,1992，Vol40，pp1039-1044)。用所述培養(yǎng)基進行的嘗試一直是令人不滿意的，主要是因為未轉(zhuǎn)化過的二倍體貼壁依賴性細胞需要相當復(fù)雜的無血清培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基補充了若干種生長因子和激素，并且還因為對于所述細胞的生產(chǎn)過程來說，通常至少在生物物質(zhì)生產(chǎn)階段使用血清(O.W.Merten，Dev.Biol.2002，101,233-257)。另外，所述培養(yǎng)基仍然含有動物來源的成分，如BSA，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，生長因子，轉(zhuǎn)運蛋白，氨基酸，維生素等。在開發(fā)用于貼壁依賴性細胞的完全不含動物來源的成分的培養(yǎng)基配方方面所做的努力非常有限。根據(jù)報導(dǎo)，大部分無動物的配方不能夠支持與用血清觀察到的生長速度相當?shù)募毎L速度，并且只能夠在出現(xiàn)早期衰老之前進行幾個轉(zhuǎn)種步驟(B.J.Walthall&R.HamExperimentalCellResearch(1981)134303-311)。另外，來自貼壁依賴性細胞的原代細胞培養(yǎng)物幾乎總是與使用動物來源的蛋白酶，主要是絲氨酸-蛋白酶分離細胞層或組織相關(guān)，因此，涉及到由外來病毒污染所迷細胞培養(yǎng)物的危險，并且導(dǎo)致細胞生長的不可接受的波動性，因為不同批次之間的蛋白酶的酶活性有所不同。例如，將豬/牛胰蛋白酶用于傳代貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物是眾所周知的技術(shù)(O.W.Mertens，Cytotechnology，2000，34，181-183)。因此，在二倍體貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物領(lǐng)域，需要開發(fā)基本上不含，優(yōu)選完全缺乏動物來源的成分，并且，適合執(zhí)行二倍體貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物的方法的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基與補充了合適血清的細胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基具有等同的性能，所述性能是指，例如，與用舍有血清的方法獲得的細胞具有等同的細胞生長速度，衰老，細胞形態(tài)學(xué)，病毒或蛋白生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容業(yè)已發(fā)現(xiàn)使用基本上不含一級動物來源的外源成分并且包括至少一種非動物二級來源的外源生長因子的細胞培養(yǎng)基，可以有利地取代常規(guī)培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基，已知這些培養(yǎng)基含有來自外源一級和/或二級動物來源的成分。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)方法涉及使用所述培養(yǎng)基，并且還包括對動物，如哺乳動物，或優(yōu)選人類細胞，優(yōu)選貼壁依賴性細胞傳代一次或多次，傳代是在存在不是來自動物來源的蛋白酶代用品的條件下進行的，并且還能夠以與用傳統(tǒng)方法獲得的水平相當?shù)乃酵瓿桑瑐鹘y(tǒng)方法是使用補充了合適血清的細胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行的。因此，第一方面，本發(fā)明涉及基本上不含，優(yōu)選缺少一級動物來源的外源成分的細胞培養(yǎng)基，其中包含至少一種，優(yōu)選一種以上選自下組的非動物二級來源的外源生長因子EGF，F(xiàn)GF，三-碘-Ltyronine和氬化可的松以及非動物二級來源的IGF-1和/或胰島素中的至少一種。所述培養(yǎng)基適合培養(yǎng)動物，如哺乳動物，或優(yōu)選人類貼壁依賴性細胞，優(yōu)選二倍體細胞，例如，與補充了合適血清的細胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基具有等同的性能。本發(fā)明的培養(yǎng)基任選還包括非動物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。優(yōu)選存在所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物優(yōu)選是小麥水解產(chǎn)物。另外，本發(fā)明涉及將所述培養(yǎng)基用于培養(yǎng)動物，如哺乳動物，或優(yōu)選人類貼壁依賴性細胞，優(yōu)選貼壁依賴性二倍體細胞，所述細胞具有與補充了合適血清的細胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得的細胞等同的性能。我們業(yè)已出乎意料地確定了本發(fā)明的培養(yǎng)基特別適合培養(yǎng)動物，如哺乳動物，或優(yōu)選人類貼壁依賴性細胞，特別是貼壁依賴性二倍體細胞，例如，與用補充了動物來源的成分如血清的細胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得的性能相當?shù)男阅?例如，細胞生長速度，衰老，細胞形態(tài)學(xué)，病毒或蛋白生產(chǎn))。因此，本發(fā)明特別涉及在本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基中生產(chǎn)動物，如哺乳動物，或優(yōu)選人類貼壁依賴性細胞，優(yōu)選二倍體細胞的方法，所述方法包括a)將所述細胞接種在上文所述的培養(yǎng)基中，并且讓所述細胞附著在基質(zhì)上；b)收獲來自步驟a)的條件培養(yǎng)基，并且從它的基質(zhì)上分離細胞層，并且用非動物來源的蛋白酶解離細胞，以便形成細胞懸浮液；c)將步驟b)的細胞懸浮液接種到裝在包括附著支持物的培養(yǎng)裝置中的所述培養(yǎng)基中，使得細胞可以附著；和d)在所述培養(yǎng)基中生長所述細胞。可以重復(fù)b)-d)若干次。所述方法還可任選地包括冷凍從步驟b)中收獲的細胞的步驟，以便產(chǎn)生細胞庫。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在不含外源的動物來源的成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞之前，所述用于生產(chǎn)細胞的方法不需要任何適應(yīng)步驟，并且，所述細胞的衰老不受該適應(yīng)步驟缺乏的影響。因此，本發(fā)明的另一方面是提供細胞系，具體地講，提供動物，如哺乳動物，或優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細胞系，它適合在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長，并且具體地講，提供細胞系，特別是提供動物，如哺乳動物，或優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細胞系，它適合生產(chǎn)生物學(xué)活性產(chǎn)物，優(yōu)選病毒，特別是用作疫苗的活病毒。本發(fā)明還涉及在適合病毒生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)基中，在動物，如哺乳動物或優(yōu)選人類貼壁依賴性細胞中生產(chǎn)病毒的方法，所述培養(yǎng)基缺少一級動物來源的成分，并且包括至少一種非動物二級來源的外源生長因子，并且任選包括一種非動物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，所述方法包括以下步驟a)用所述病毒感染所述細胞b)繁殖所述病毒，和c)收獲所述病毒。所述方法可以包括對收獲的病毒進行一個或多個純化步驟。所述病毒能夠與可以藥用的載體，賦形劑和/或佐劑適當?shù)嘏渲瞥梢呙纭Ｔ敿氄f明在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基是基本上不含，優(yōu)選完全缺乏一級動物來源的外源成分的，優(yōu)選它不含一級和二級動物來源的外源動物來源的成分。所述培養(yǎng)基適當?shù)剡m合培養(yǎng)動物，如哺乳動物，或優(yōu)選人貼壁依賴性細胞，特別是貼壁依賴性二倍體細胞，例如，其性能，例如，細胞生長速度，細胞形態(tài)學(xué)，衰老或病毒生產(chǎn)，與用補充了合適血清的細胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得的細胞的性能相當。例如，用于動物，如哺乳動物或優(yōu)選人類細胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以從ATCC目錄中查閱到，并且，在表1中另外提供了用于特定細胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的例子。用于比較目的的血清通常是牛血清，特別是胎牛血清。因此，最好在與表1所示基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行比較時評估等同性，并且該基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有牛血清，通常其濃度為10%v/v。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*按照ATCC或NIA的說明，補充了氨基酸和維生素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基"細胞生長速度"表示細胞從細胞庫中解凍和它們的衰老之間的細胞生長的平均速度。它是用群體加倍(PD)/天表示的，并且是通過計算在細胞解凍和它們的衰老之間群體加倍的次數(shù)與細胞解凍和它們的衰老之間的持續(xù)時間(用天表示)的比例獲得的。本發(fā)明的等同的細胞生長速度，表示細胞生長速度為用在補充了合適血清的細胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(通常補充了濃度為10%的牛血清(用作對照))獲得的生長速度的至少80%,優(yōu)選90%,更優(yōu)選至少95%或更高。最優(yōu)選的是細胞生長速度高于用在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞獲得的速度。"細胞形態(tài)學(xué)"表示通過光學(xué)顯微術(shù)評估的細胞的形態(tài)學(xué)。形態(tài)學(xué)方面的等同的性能表示所述細胞保留了在存在牛血清的條件下培養(yǎng)時所出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)。作為例子，MRC-5細胞在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后，保留了它們的成纖維細胞性質(zhì)。"衰老"表示在均勻的，固定次數(shù)的群體加倍(群體加倍水平，PDL)之后出現(xiàn)的細胞復(fù)制能力的喪失，通常被稱作海弗利克極限(HarryRubin，NatureBiotechnology,2002，20，675-681)。本發(fā)明的等同的衰老表示衰老至少為在補充了合適血清，通常是濃度為10%的牛血清(用作對照)的細胞類型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞獲得的衰老的至少70%，優(yōu)選卯％，更優(yōu)選至少95%或更高。最優(yōu)選的衰老是以高于用在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞獲得的PDL發(fā)生的。通常，對于MRC-5細胞來說，優(yōu)選的是，對于在存在上文所述的血清的條件下培養(yǎng)的細胞來說，獲得了大約PDL60和大約PDL75之間的衰老。，，貼壁依賴性動物細胞"或"貼壁依賴性人細胞，，表示在來自動物或人組織的細胞系或細胞中建立的細胞，它需要固體支持物，以便生長并且正常地擴增。所述固體支持物基本上是生長表面，如塑料或玻璃表面。合適的固體支持物的例子有陪替氏培養(yǎng)皿，組織培養(yǎng)燒瓶，細胞工廠，滾瓶或微載體。對于本發(fā)明的目的來說，所述表面是沒有用動物來源的任何蛋白或用來自所述蛋白的肽包被過的。所述細胞附著并且通過附著擴散，即通過分泌它們的自分泌附著因子。優(yōu)選的貼壁依賴性細胞是二倍體細胞。二倍體貼壁依賴性細胞的非限定性例子可以從ATCC目錄(WI38:CCL-75，MRC-5:CCL-171，IMR-90:CCL-186,DBS-FRhL畫2:CCL-160,MRC-9:CCL-212)或NIA目錄(TIG-1和TIG-7，為了NIAAgingCellRepository開發(fā)的，TIG-1保存編號AG06173;IMR-91:191L)中查閱到。優(yōu)選的細胞是MRC-5，WI-38,FRhL"2，MRC-9，最優(yōu)選的細胞系是MRC-5。"基本上不含...的培養(yǎng)基"用于表示培養(yǎng)基，它包括新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基，它缺少血清以及任何一級動物來源的外源成分(例如BSA)。所述新鮮培養(yǎng)基或條件培養(yǎng)基可以含有二級動物來源的微量的外源成分。"不含動物來源的成分的培養(yǎng)基"表示缺少血清和一級動物來源的(例如BSA)和二級動物來源的任何外源成分的培養(yǎng)基。一級動物來源的外源成分包括，例如，來自牛(包括小牛)，人(如人血清白蛋白-HSA)或豬來源的成分。二級動物來源的成分被定義為這樣的成分，這些成分是在它們的生產(chǎn)步驟之一中與動物來源的產(chǎn)物接觸的成分。具體地講，常用的來自二級動物來源的成分是重組生長因子，如胰島素，EGF和FGF和IGF-I。這些可以在大腸桿菌中生產(chǎn)的重組生長因子與用于發(fā)酵飼養(yǎng)和/或酶促裂解的?；蜇i的成分接觸。微量的來自二級動物來源的成分的范圍為低于1%，優(yōu)選低于0.5%,更優(yōu)選低于0.01%，最優(yōu)選4氐于0.0010/0，最優(yōu)選不存在(0%)?；A(chǔ)無血清培養(yǎng)基和無動物來源的成分的培養(yǎng)基可以通過商業(yè)渠道獲得或可以通過混合每一種成分制備。它們是用非動物來源的生長因子適當補充過的。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用這樣的培養(yǎng)基，它完全不含動物來源的外源成分。盡管完全不含動物來源的外源成分的培養(yǎng)基是優(yōu)選的實施方案，上迷所有成分都可以被二級動物來源的成分(如上文所述的生長因子，小麥蛋白胨，氨基酸，蛋白酶等)所取代，而又不會對所述方法的性能產(chǎn)生任何影響。"動物來源"或"動物來源的"表示哺乳動物，例如人，以及非哺乳動物，如昆蟲，魚，禽類，兩棲類和爬行類。術(shù)語"外源的"用于表示非動物來源的成分，與細胞分泌的"內(nèi)源"成分不同，它是被添加到所述培養(yǎng)基中的。因此，比較而言，術(shù)語"內(nèi)源的"表示由細胞合成并且分泌(自分泌)的成分，它導(dǎo)致了細胞在合適基質(zhì)上的附著，擴散和生長(粘連蛋白，膠原，蛋白聚糖，生長因子...)(M.R.Koller&E.T.Papoutsakis,BioprocessTechnol.，1995，60，61-110)。所述細胞培養(yǎng)基優(yōu)選缺少一級動物來源的外源成分，并且包括至少一種非動物二級來源的外源生長因子，優(yōu)選至少兩種，更優(yōu)選至少三種或三種以上生長因子。細胞培養(yǎng)基適當?shù)匕ㄟx自下組的至少一種非動物二級來源的外源生長因子EGF，F(xiàn)GF，三-捵-Ltyronine和氫化可的松和非動物二級來源的IGF-1和/或胰島素中的至少一種。所述培養(yǎng)基適當?shù)匕‥GF，F(xiàn)GF，三-碘-Ltyronine和非動物二級來源的氫化可的松和非動物二級來源的IGF-1和/或胰島素中的至少一種的組合。術(shù)語"生長因子"表示蛋白，肽，或多肽，或多肽的復(fù)合物，包括細胞因子，它們是細胞生長所必需的，可以在培養(yǎng)過程中由細胞產(chǎn)生，并且可以影響它自身和/或多種其他相鄰的或遠處的細胞，例如，促進細胞附著和生長。某些，而不是全部生長因子是激素。示例的生長因子是胰島素，胰島素樣生長因子(IGF)，包括IGF-l,表皮生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，包括堿性FGF(bFGF)，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，轉(zhuǎn)化生長因子a(TGFa)，血小板衍生的生長因子(PDGFs)，神經(jīng)生長因子(NGF)，角質(zhì)細胞生長因子(KGF)，VEGF，轉(zhuǎn)化生長因子p(TGFp)，白介素-8(IL-8)，白介素6(IL-6)，三-砩-Ltyronine和氫化可的松。優(yōu)選的生長因子包括，例如EGF，F(xiàn)GF(優(yōu)選bFGF)，IGF-1或胰島素，三-碟-Ltyronine和氫化可的松，并且可以單獨使用或者優(yōu)選組合使用。優(yōu)選的培養(yǎng)基包括非動物來源的EGF，F(xiàn)GFb，IGF-1或胰島素，三-碘-Ltyronine和氫化可的松。更優(yōu)選的是本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的所有成分，如在表3中所列舉的成分都是非動物一級和二級來源的。在更優(yōu)選的實施方案中，所述培養(yǎng)基還包括非動物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，優(yōu)選植物或酵母來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。"蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物"或"蛋白胨"表示正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的純化制劑或它的粗制級份，因此它是不含蛋白的。術(shù)語不含蛋白意在表示不含任何有功能活性的蛋白，不過，不排除非功能性肽，因為這些肽可能精確地由蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物產(chǎn)生。特別合適的水解產(chǎn)物級份包括小麥蛋白胨蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，例如由分子量最高為10000道爾頓的肽組成的酶促消化物，所述肽的80%的大部分為300-1000道爾頓。在使用時，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物在培養(yǎng)基中的濃度為0-10g/L，在使用時優(yōu)選為1-5g/L，特別優(yōu)選2.5g/L。具體地講，所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物來自植物(例如，水稻，玉米，小麥，大豆，豌豆，棉花，馬鈴薯)或酵母。本發(fā)明優(yōu)選的植物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物是小麥蛋白胨蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物?；蛘撸景l(fā)明的細胞培養(yǎng)基表示"新鮮培養(yǎng)基"，"條件培養(yǎng)基"，或這兩種培養(yǎng)基的混合物。"新鮮培養(yǎng)基"表示通過商業(yè)渠道獲得的或用各種成分制備的任何細胞培養(yǎng)基，業(yè)已將它用于培養(yǎng)任何細胞。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，新鮮培養(yǎng)基表示通過商業(yè)渠道獲得的培養(yǎng)基或用上述各種成分制備的培養(yǎng)基。就是說，根據(jù)本發(fā)明，它缺少一級來源的動物成分并且業(yè)已補充了上文所述的至少一種非動物二級來源的外源生長因子，并且任選地，但是優(yōu)選地補充了非動物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，如小麥蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。"條件培養(yǎng)基"用于表示業(yè)已被一種細胞培養(yǎng)物利用的培養(yǎng)基，并且被另一種培養(yǎng)物再利用。該條件培養(yǎng)基包括第一種培養(yǎng)物對內(nèi)源生長刺激物質(zhì)，內(nèi)源附著因子和特殊內(nèi)源營養(yǎng)物的釋放。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種生產(chǎn)條件培養(yǎng)基的方法，包括將本發(fā)明的新鮮培養(yǎng)基與動物或優(yōu)選人類貼壁依賴性細胞組合，以便制備條件培養(yǎng)基。除非另有說明，新鮮培養(yǎng)基，條件培養(yǎng)基，以及這兩者的混合物被稱作"培養(yǎng)基"。表2表示添加到新鮮培養(yǎng)基中的生長因子和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的濃度范圍和優(yōu)選濃度。因此，添加到本發(fā)明的合適培養(yǎng)基中的生長因子的濃度由下面的表2所限定。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>可以理解的是，根據(jù)培養(yǎng)的細胞類型和要獲得的性能，本發(fā)明的新鮮培養(yǎng)基可任選地進一步補充常見于培養(yǎng)基中的并且是非動物來源的成分。例如，合適的成分有氨基酸(包括非必需氨基酸)，維生素，核苷酸/核苷，脂肪酸，抗生素和氧化穩(wěn)定劑，它們都是非動物來源的。合適的新鮮培養(yǎng)基是無動物標準培養(yǎng)基，如基于DMEM的培養(yǎng)基(高葡萄糖Dulbecco's改良的Eagle's培養(yǎng)基)，MEM(極限必需培養(yǎng)基Eagle)，培養(yǎng)基199，RPM-I1640,所有這些培養(yǎng)基都可以從以下等/>司獲得Life-technologies畫Gibco國BRL，BioWittaker,Sigma-Aldrich,并且用生長因子進一步適當?shù)匮a充，并且任選用上述非動物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物補充。技術(shù)人員可以理解的是，起始培養(yǎng)基需要根據(jù)所培養(yǎng)的細胞類型選擇。優(yōu)選的商業(yè)渠道獲得的新鮮培養(yǎng)基是UItra-MEM，可以從BioWhittaker(目錄號12-745F)獲得。另外，根據(jù)要培養(yǎng)的細胞類型，所述新鮮培養(yǎng)基是用每一種成分制備的無動物培養(yǎng)基，并且包括(并且窮舉)糖類來源，無機鹽成分，微量元素，氨基酸(包括非必需氨基酸)，維生素，核苷酸/核苷，脂肪酸，抗生素，氧化穩(wěn)定劑和水，適當?shù)匮a充了非動物來源的外源生長周子，并且任選地，但是優(yōu)選補充了上文所述的非動物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。所述培養(yǎng)物的基本組成的例子在實施例I和表3中提供。所述培養(yǎng)基適合培養(yǎng)動物，如哺乳動物或優(yōu)選人類細胞，具體地講，貼壁依賴性動物細胞。如哺乳動物細胞或優(yōu)選人類細胞，優(yōu)選貼壁依賴性二倍體細胞，它構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，還提供了用于在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生產(chǎn)動物或優(yōu)選人類貼壁依賴性細胞，優(yōu)選二倍體細胞的方法，所述方法包括a)將細胞接種在所述培養(yǎng)基中，并且讓所述細胞附著在基質(zhì)上；b)收獲來自步驟a)的條件培養(yǎng)基，并且從該基質(zhì)上分離所述細胞層，并且用非動物來源的蛋白酶解離細胞，以便形成細胞懸浮液；c)將步驟b)的細胞懸浮液接種到裝在包括附著支持物的裝置中的培養(yǎng)基中，使得允許細胞結(jié)合；d)在相同的培養(yǎng)基中生長所述細胞；e)任選重復(fù)步驟b)-d)。所述方法可任選包括冷凍從步驟b)中收獲的細胞的步驟，以便產(chǎn)生細胞庫。用于步驟b)的蛋白酶在處理之后任選被滅活。根據(jù)細胞類型，以及要獲得的所述細胞培養(yǎng)方法的性能，技術(shù)人員可以理解的是，所使用的培養(yǎng)基，特別是在步驟a)和c)中所使用的培養(yǎng)基還可以是新鮮培養(yǎng)基，或來自前面的培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基或新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的混合物。在所述混合物中，新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的比例為1:0(100%新鮮培養(yǎng)基)-0:1(100%條件培養(yǎng)基)。所述條件培養(yǎng)基優(yōu)選占培養(yǎng)基總體積的0-大約75%。新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的優(yōu)選比例為1:1(50%新鮮培養(yǎng)基/50%條件培養(yǎng)基)，更優(yōu)選的比例為大約7:1(87.5%新鮮培養(yǎng)基/12.5%條件培養(yǎng)基)-1:7，更優(yōu)選的比例為大約3:1(75%新鮮培養(yǎng)基/25%條件培養(yǎng)基)-1:3，最優(yōu)選的比例為3:1(75%新鮮培養(yǎng)基/25%條件培養(yǎng)基)。所述優(yōu)選比例優(yōu)選在整個培養(yǎng)過程中在每次更換培養(yǎng)基時保持。所述蛋白酶是非動物來源的，就是說所述蛋白酶不是從動物來源中純化的。所述蛋白酶可以來自重組來源，不過，優(yōu)選來自細菌，酵母，或植物來源，合適的是來自非動物二級來源。來自重組來源的蛋白酶意在表示通過DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的任何蛋白酶，并且涉及將微生物，例如細菌，病毒，酵母，植物等用于其生產(chǎn)。優(yōu)選的蛋白酶包括半胱氨酸內(nèi)肽酶；中性真菌蛋白酶(來自A.oryzae);中性細菌蛋白酶(來自枯草芽孢桿菌)(參見Brocklehurst，K.等，Cysteineproteinases.InNewComprehensiveBiochemistryVol.16,HydrolyticEnzymes;Neuberger,A.&Brocklehurst;K.，eds，pp.39-158(1987)Elsevier,Amsterdam);絲氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶樣蛋白酶(如r蛋白酶，購自Invitrogen，3175StaleyRoad,GrandIsland,NY"072.供應(yīng)商目錄號02-106)或重組胰蛋白酶(如Trypzean，在玉米中生產(chǎn)的重組胰蛋白酶，Prodigen，101GatewayBlvd，Suite100CollegeStation,Texas77845.生產(chǎn)商代碼TRY)。來自胰蛋白酶樣蛋白酶家族的蛋白酶通常出現(xiàn)在原核生物，動物和病毒中，令人吃驚的是，迄今為止沒有在植物中發(fā)現(xiàn)。這些酶參與了多種生理學(xué)過程，其中最熟知的是消化，受精，血液凝固級聯(lián)反應(yīng)和發(fā)育過程。它們被認為偏離了共同的祖先蛋白。在文獻中業(yè)已對這些酶進行了充分的披露(A.J，Greer，"Comparativemodellingmethods-applicationtothefamilyofmammalianserineprotease"Proteins，Vol.7，p317-334，'1990)并且可以根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)劃分成不同的家族(A.Sali&T.Blundell，"definitionofgeneraltopologicalequivalenceinproteinstructures"J.MoI.Biol.，212,p403-428，1990)。合適的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，如重組胰蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是中性真菌蛋白酶或中性細菌蛋白酶。本發(fā)明的更優(yōu)選的蛋白酶是半胱氨酸內(nèi)肽酶。特別優(yōu)選的半胱氨酸蛋白酶來自植物來源。來自植物的優(yōu)選的半胱氨酸內(nèi)肽酶選自下組無花果蛋白酶(無花果乳膠的主要蛋白水解成分)(Liener,I.E.&Friede謂n，B.MethodsEnzymol，1970，19，261-273)，莖菠蘿蛋白酶(從菠蘿植物的莖中提取的)，獼猴桃堿(從獼猴桃果實或獼猴桃中提取)和木瓜蛋白酶(從木瓜的乳膠中提取的)。在所述半胱氨酸蛋白酶中，無花果蛋白酶是特別優(yōu)選的。所述蛋白酶能夠以任何合適的濃度使用，以便確保在合理的分離時間內(nèi)進行有效的細胞解離(單一化的細胞)。通過閱讀實施例II所示的步驟能夠更好地理解生產(chǎn)二倍體貼壁依賴性細胞的過程。筒單地講，所述細胞層來自解凍并且接種用于細胞培養(yǎng)的細胞或來自本發(fā)明的培養(yǎng)基中的以前的繼代培養(yǎng)物。然后，在用于細胞分離的第一個步驟中，取出貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，并且保持以便用作接種步驟的條件培養(yǎng)基。所述細胞層優(yōu)選是洗滌過的，是分離的，并且通過使用蛋白酶溶液和搖晃燒瓶解離成單個細胞。當細胞分離并且單一化時，收集細胞懸浮液，并且可用于細胞接種或細胞存庫。當?shù)鞍酌傅幕钚詫λ黾毎档呐囵B(yǎng)物有毒時，任選用合適的蛋白酶抑制劑對它進行抑制。在用于細胞接種的第二個步驟中，以用于產(chǎn)生的細胞系的常見細胞密度將細胞接種在新的燒瓶中。然后，將培養(yǎng)基，優(yōu)選新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的混合物添加到新的燒瓶中。在用于細胞生長的第三個步驟中，在與用于細胞系生產(chǎn)的常用方法中的相同的溫度和相同的氣氛中培養(yǎng)新的細胞培養(yǎng)物。在步驟1(細胞分離)之后可以將任選的第四個步驟用于細胞存庫并且取代步驟2(細胞接種)和3(細胞生長)。該步驟是通過在不含動物來源的成分的，補充了常用于細胞系冷凍的常用無動物來源的防凍劑(通常是DMSO和甲基纖維素)的培養(yǎng)基中冷凍細胞進行的。通常，細胞必須適應(yīng)在不含外源動物來源的成分的培養(yǎng)基中生長，采用包括具有逐漸降低的所述成分的濃度的若干種培養(yǎng)物的預(yù)定策略，然后將它們的培養(yǎng)物放在完全不含外源動物來源的成分的培養(yǎng)基中(ChandlerJP.，AmBiotechnolLab1990，8，18-28)。該適應(yīng)步驟是確保正常細胞生長和典型的細胞形態(tài)學(xué)所必須的。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，用于生產(chǎn)本發(fā)明的細胞的方法在不含外源動物來源的成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞之前不需要任何適應(yīng)步驟，并且所述細胞的衰老不受該適應(yīng)步驟的缺乏的影響。這是本發(fā)明的另外一個優(yōu)點。實際上，通常的細胞生長和典型的細胞形態(tài)學(xué)保持了達到群體加倍水平(PDL)所需要的多個世代(群體加倍)，相當于觀察到所述細胞衰老時的PDL的2/3。通常的細胞生長和典型的細胞形態(tài)學(xué)優(yōu)選需要保持多個世代(群體加倍)，以便達到觀察到所述細胞衰老時的群體加倍水平(PDL)。觀察到所述細胞衰老時的PDL相當于在含有動物來源的成分的通常的過程中所觀察到的PDL。例如，對于來自主細胞庫(PDLl3)并且在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MRC-5細胞來說，在觀察到細胞衰老之后，通常的細胞生長和典型的細胞形態(tài)學(xué)保持了超過so代(群體加倍)。因此本發(fā)明還提供了適合在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長的細胞系，優(yōu)選動物，如哺乳動物，更優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細胞系。"適應(yīng)的"表示典型的細胞生長和細胞形態(tài)學(xué)保持了多個世代，類似于用含有動物來源的成分的典型培養(yǎng)基觀察到的那些，或者衰老的出現(xiàn)并不比使用傳統(tǒng)培養(yǎng)基時出現(xiàn)的明顯更快。另外，本發(fā)明還提供了適合在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生產(chǎn)生物學(xué)活性產(chǎn)物，優(yōu)選病毒的細胞系，優(yōu)選動物，如哺乳動物，更優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細胞系。因此，在另一種實施方案中,本發(fā)明相應(yīng)地還提供了在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生產(chǎn)動物，如哺乳動物或優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)重組蛋白或病毒的方法，所述方法包括用上述蛋白酶使所述細胞培養(yǎng)物傳代。具體地講，以低密度將貼壁依賴性細胞，通常是二倍體細胞接種在基本上不含動物來源的外源成分的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，并且在它們業(yè)已擴增以便形成匯合層或多層之后，使它們分離，以便形成懸浮液，并且再次以低密度接種。用于分離和傳代所述細胞的蛋白酶優(yōu)選是非動物來源的，或來自重組來源，選自下組半胱氨酸內(nèi)肽酶，中性真菌蛋白酶，中性細菌蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。合適的蛋白酶是胰蛋白酶樣蛋白酶，如Trypzean或重組胰蛋白酶，如r蛋白酶或半胱氨酸內(nèi)肽酶，更優(yōu)選無花果蛋白酶，莖菠蘿蛋白酶和獼猴桃堿。在所述半胱氨酸蛋白酶，無花果蛋白酶是特別優(yōu)選的。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及在本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基中，在動物如哺乳動物或優(yōu)選人類貼壁依賴性細胞，優(yōu)選二倍體細胞中生產(chǎn)病毒的方法a)用所述病毒感染所述細胞b)繁殖所述病毒，和c)收獲所述病毒。任選對收獲的病毒進行一個或多個純化步驟，本發(fā)明的另一方面是提供按本發(fā)明的描述所生產(chǎn)的病毒并且配制成免疫原性組合物，如疫苗，與可以藥用的載體，賦形劑和/或佐劑混合。根據(jù)細胞類型，以及要獲得的病毒生產(chǎn)方法的性能，技術(shù)人員可以理解的是，用于在步驟a)中接種細胞的培養(yǎng)基還可以是新鮮培養(yǎng)基或來自前面的培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基或新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的混合物。優(yōu)選的是，為了優(yōu)化病毒生產(chǎn)，新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的比例為1:0(100%新鮮培養(yǎng)基)-0:1(100%條件培養(yǎng)基)。所述條件培養(yǎng)基優(yōu)選占培養(yǎng)基總體積的0-大約75%。新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的優(yōu)選比例為1:1(50%新鮮培養(yǎng)基/50%條件培養(yǎng)基)，更優(yōu)選大約7:1(87.5%新鮮培養(yǎng)基/12.5%條件培養(yǎng)基)，最優(yōu)選大約3:1(75%新鮮培養(yǎng)基/25%條件培養(yǎng)基)。新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的比例為1:0(100°/新鮮培養(yǎng)基)是特別優(yōu)選的。用于感染細胞和繁殖病毒的培養(yǎng)基可以與生長培養(yǎng)基相同，更優(yōu)選它包括25%w/vEGF，25%w/vbFGF和25o/。w/vT3，并且任選還補充了20%w/v蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，優(yōu)選小麥蛋白胨E1(OrganotechnieSA，F(xiàn)rance)。最優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)基不含任何蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。通過閱讀在實施例III中所披露的步驟可以更好地理解病毒生產(chǎn)方法。簡單地講，在用于病毒感染的笫一個步驟中，按照所述方法在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的貼壁依賴性細胞用合適的病毒感染，感染復(fù)數(shù)與用于病毒生產(chǎn)的常規(guī)方法的感染復(fù)數(shù)相同。在用于病毒繁殖的第二個步驟中，在與常用于病毒生產(chǎn)的方法中的相同的溫度和相同的氣氛下培養(yǎng)受感染的細胞。在第三個步驟中，在經(jīng)歷與常用于病毒生產(chǎn)的相同的繁殖時間之后收獲病毒。所述病毒收獲方法是按照常用于病毒收獲的方法進行的。有關(guān)用于病毒生產(chǎn)的一般培養(yǎng)條件參見甲型肝炎病毒培養(yǎng)方法(WO95/24468)，曱型肝炎病毒疫苗(WO94/06446;A.HagenJ.，2000，BioprocessEngineering23，439-449)?？梢允褂帽景l(fā)明的培養(yǎng)基和方法生產(chǎn)的病毒和人病毒疫苗的例子包括活的，減毒的，滅活的，重組修飾的病毒。具體地講，用作疫苗的可以在貼壁依賴性細胞上繁殖的減毒病毒包括，但不局限于腺病毒科(即腺病毒1-49)，皰滲病毒科(即皰滲病毒HSV，巨細胞病毒CMV，水痘帶狀皰療病毒VZV，EB病毒EBV),黃病毒科(即登革熱病毒，丙型肝炎病毒，日本腦炎病毒，黃熱病病毒)，痘病毒科(即牛痘病毒，猴痘病毒，痘苗病毒，天花病毒)，小核糖核酸病毒科(即艾柯病毒，科薩奇病毒，甲型肝炎病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒，鼻病毒)，呼腸孤病毒科(即輪狀病毒，科羅拉多蜱熱病毒)，披膜病毒科(即東方馬腦炎病毒，風滲病毒)，肝DNA病毒科(即乙型肝炎病毒)，逆轉(zhuǎn)錄病毒科(即免疫缺陷病毒HIV/SIV)，副粘病毒科(即麻疹病毒，腮腺炎病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒RSV),棒狀病毒科(即狂犬病病毒，水泡性口炎病毒)，正粘病毒科(即流感病毒)，未分類的病毒(即戊型肝炎病毒，5肝炎病毒)，星狀病毒科(即星狀病毒)，冠狀病毒科(即冠狀病毒)，沙粒病毒科(即Juninvirus)，Bunyaviridae(立夫特山谷熱病毒)。在另一種實施方案中，用本發(fā)明的方法進行的病毒疫苗的生產(chǎn)包括生產(chǎn)在粘附細胞中表達的重組蛋白。優(yōu)選的貼壁依賴性細胞包括，例如AGMK，VERO，MDCK(犬上皮腎臟細胞)，CEF(雞，胚胎成纖維細胞)和CHO(中國倉鼠卵巢)細胞，更優(yōu)選的細胞是貼壁依賴性二倍體細胞，例如MRC-5，WI-38,TIG-1，TIG-7，F(xiàn)RhL-2，MRC-9,IMR-90和IMR91。MRC-5是特別優(yōu)選的細胞系。業(yè)已證實本發(fā)明的方法能成功地生產(chǎn)甲型肝炎病毒，腮腺炎病毒和VZV。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，用下列任何病毒感染的細胞是優(yōu)選的肝炎，特別是HAV，脊髓灰質(zhì)炎病毒，HSV，特別是HSV-1和HSV-2，CMV，EBV，風滲病毒，副粘病毒科(即麻奢病毒，腮腺炎病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒RSV)，VZV。一般來說，啟動主細胞庫需要15代，并且為了生產(chǎn)工作細胞庫需要10代。為了以400L的規(guī)模進行平均批量培養(yǎng)需要至少大約15代。從貼壁依賴性細胞系開始，并且使用本發(fā)明的培養(yǎng)基，可以按照相同的方案用大約15代制備主細胞庫(MCB)，并且用大約10代制備工作細胞庫(WCB)，因此，在不舍外源動物來源的成分的培養(yǎng)基開發(fā)的條件下，用大約15代制備培養(yǎng)物。本發(fā)明還涉及將上文所披露的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細胞，優(yōu)選二倍體貼壁依賴性細胞，更優(yōu)選真核細胞，最優(yōu)選動物，如哺乳動物，或優(yōu)選人類細胞的用途。本發(fā)明的另一個目的是提供細胞培養(yǎng)物，它包括本發(fā)明的培養(yǎng)基和細胞，優(yōu)選二倍體貼壁依賴性細胞，更優(yōu)選真核細胞，最優(yōu)選動物，如哺乳動物或優(yōu)選人類細胞。本發(fā)明還涉及可以通過本文所限定的方法獲得的病毒群體。它還涉及一種生產(chǎn)病毒疫苗的方法，包括將所述病毒群體與可以藥用的載體，賦形劑或佐劑混合。圖l.在使用用于細胞分離的無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶和使用實施例1.1確定的培養(yǎng)基進行MRC-5細胞衰老試驗期間的細胞密度。圖2.在將無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶用于細胞分離和使用實施例1.1確定的培養(yǎng)基進行MRC-5細胞衰老試驗期間的細胞存活力。圖3.在將無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶用于細胞分離和使用實施例1.1確定的培養(yǎng)基進行MRC-5細胞衰老試驗期間的細胞生長。圖4.在MRC-5細胞衰老試驗期間使用實施例1.1(單一成分)和實施例1.2(補充過的超-MEM培養(yǎng)基)確定的培養(yǎng)基獲得的細胞密度的比較。圖5.在MRC-5細胞衰老試驗期間使用實施例1.1(單一成分)和實施例1.2(補充過的超-MEM培養(yǎng)基)確定的培養(yǎng)基獲得的細胞存活力。圖6.在MRC-5細胞衰老試驗期間使用實施例U(單一成分)和實施例1.2(補充過的超-MEM培養(yǎng)基)確定的培養(yǎng)基獲得的細胞生長。圖7.通過將無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶用于細胞分離在MRC-5細胞上生產(chǎn)HAV。圖8.通過將無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶用于細胞分離而擴增的MRC-5細胞的細胞存庫期間的細胞密度。圖9.通過將無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶用于細胞分離而擴增的MRC-5細胞的細胞存庫期間的細胞存活力。圖IO.通過將無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶用于細胞分離而擴增的MRC-5細胞的細胞存庫期間的細胞生長。圖ll.通過將Trypzean(Prodigen)或r蛋白酶(Invitrogen)用于細胞分離而擴增的MRC-5細胞的細胞存庫期間的細胞密度。圖12.通過將Trypzean(Prodigen)或r蛋白酶(Invitrogen)用于細胞分離而擴增的MRC-5細胞的細胞存庫期間的細胞存活力。圖13.將Trypzean(Prodigen)或r蛋白酶(Invitrogen)用于細胞分離而擴增的MRC-5細胞的細胞存庫期間的細胞生長。將通過以下非限定性實施例對本發(fā)明進行進一步的說明。實施例II丄用各成分制備新鮮培養(yǎng)基典型的優(yōu)選新鮮培養(yǎng)基包括表3中所列舉的常用成分的全部或大部分。根據(jù)本發(fā)明，可以用表2所列舉的生長因子和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物適當補充該培養(yǎng)基。表3-不含動物來源的成分的培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>*在上面的表3中，還將鐵復(fù)合物(果糖鐵)用作鐵的來源，作為無機鐵的補充。1.2.用適當補充過的商業(yè)化培養(yǎng)基制備新鮮培養(yǎng)基商業(yè)化培養(yǎng)基Ultra-MEM目錄號12-745F(還原的血清培養(yǎng)基，無蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不含L-谷氨酰胺)可以從BioWhittaker獲得。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方不含動物來源的成分，但是，是按照生產(chǎn)商的說明進行經(jīng)典設(shè)計的，以便補充少量的血清(如低于10%)和其他添加劑(ITES-胰島素(動物來源)+轉(zhuǎn)鐵蛋白(動物來源)+乙醇胺+硒)。業(yè)已在缺少推薦的來自動物來源的補充物(血清和ITES)的條件下使用了所述培養(yǎng)基。業(yè)已用以下成分補充了該培養(yǎng)基，都不含來自一級和二級動物來源的成分1.IGF-1:0.1mg/L2.EGF:0.005mg/L3.bFGF:0.003mg/L4.三碟-L-tyronine(T3):0.066mg/L5.小麥蛋白胨El:2.5g/L還含有6.果糖鐵0.1667ml/L7.丙酮酸鈉0.055g/L業(yè)已添加了以下成分，以便優(yōu)化在沒有動物來源的成分的條件下進行的培養(yǎng)過程-谷氨酰胺0.2922g/L-葡萄糖0.33g/L-硒(Na2Se03):0.01mg/L-乙醇胺0.0006jil/L對來自無動物的細胞庫(PDL21)的MRC-5細胞進行解凍，并且按照在實施例II和IV中披露的方法培養(yǎng)，使用上述培養(yǎng)基，和以下繼代培養(yǎng)方案.D7:以I/8的比例將細胞接種在100ml由12.5%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中.D12:以I/4的比例將細胞接種在100ml由25%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中D16:以I/8的比例將細胞接種在100ml由12.5%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中D21:重復(fù)從D7開始的方案在士三個月的時間(例如80天)內(nèi)，在175cm2T-燒瓶中培養(yǎng)細胞，直到衰老(士PDL65)。在該方法中，細胞接種物并不固定于目標細胞密度上。作為對照進行的細胞計數(shù)，證實在出現(xiàn)衰老之前觀察到的細胞接種物密度為9000細胞/cm2-40000細胞/cm2。在培養(yǎng)81天之后，MRC-5細胞達到了PDL66，細胞生長速度為0.57PDL/天，此后觀察到了衰老。在圖4,5和6中所示出的結(jié)果與用在1.2部分所述的各成分制備的培養(yǎng)基觀察到的結(jié)果相當，它在81天之后導(dǎo)致了大約PDL65的衰老，并且細胞生長速度為大約0.56PDL。與此同時，將來自該培養(yǎng)物的細胞用于按照在實施例III中披露的方法生產(chǎn)HAV，使用與上文所述相同的培養(yǎng)基，所不同的是，EGF，bFGF和T3濃度降低到在細胞生長培養(yǎng)基中的濃度的25%,并且，所不同的是，小麥蛋白胨濃度降低到0.5g/L。病毒的收獲是在培養(yǎng)開始之后2個月進行的。實施例II用于在基冬上不含任何來自動物來源的成分的培養(yǎng)基中生產(chǎn)動物或人貼壁依賴性細胞的方法。步驟l:細胞分離取出在細胞培養(yǎng)燒瓶中生長的貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，并且保持在無菌容器中。這種回收的培養(yǎng)基被視為條件培養(yǎng)基，并且被用于接種細胞。用補充了EDTA的磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)洗滌所述細胞層2次，每升PBS大約0.04克-大約1克EDTA，優(yōu)選大約0.2克/L的目標濃度是理想的。一旦洗滌了所述細胞層，添加足夠體積的蛋白酶溶液，以便覆蓋整個細胞層。大約0,01ml/cm2-2mi/cm2，更優(yōu)選0.0333ml/cm2的目標體積是理想的。該蛋白酶溶液是通過將所述酶溶解在補充了EDTA的PBS中制備的。每升PBS大約0.02克-大約0.5克的EDTA，優(yōu)選大約O.l克的目標是理想的。添加到PBS/EDTA中的蛋白酶的量是制備具有足夠蛋白質(zhì)水解活性的溶液，以便獲得有效細胞分離所需要的用量。在以下情況下認為細胞分離是有效的大部分細胞從燒瓶上分離下來，并且細胞聚集物在大約5分鐘-大約30分鐘，優(yōu)選大約12分鐘的預(yù)期目標時間之后解離成單個細胞。在下面列舉了可用在貼壁依賴性細胞上的某些蛋白酶的酶活性，例如，但不局限于-對于無花杲蛋白酶來說，目標酶活性為大約5.5jiUPABA/ml-大約550jiUPABA/ml,優(yōu)選大約55jiUPABA/ml是理想的(一個單位的PABA是在37"C下水解1jimole的Na-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯胺/分鐘的酶的活性(MethodsinEnzymologyVolXIXProteolyticenzymesp261-284)。國對于菠蘿蛋白酶來說，目標酶活性為大約0.001明膠消化的單位(GDU)/ml隱大約0.1GDU/ml，優(yōu)選大約0.01GDU/ml是理想的，(一個單位的GDU活性是在分析條件下從確定的明膠底物中釋放1111經(jīng)氨基酸的酶的活性9-(參考文獻同上)。-對于來自A.oryzae的中性真菌蛋白酶來說，目標酶活性相當于大約12.5jig/ml的蛋白量(1.25pg/ml-大約125(ig/ml，優(yōu)選大約12.5jig/ml是理想的(按照生產(chǎn)商的說明，LyvenZacNormandial，11avenueduPaysdeCaen14460Colombelles，F(xiàn)rance)。-對于來自枯草芽孢桿菌的中性細菌蛋白酶來說，目標酶活性相當于大約150fig/ml(15jig/ml-大約1.5mg/ml，優(yōu)選大約150jig/ml)的蛋白量是理想的(按照生產(chǎn)商的說明，LyvenZacNormandial,11avenueduPaysdeCaen14460Colombelles，F(xiàn)rance)。-對于Trypzean來說，目標酶活性為大約100USP/ml-0.1USP/ml，優(yōu)選lUSP/ml是理想的(按照生產(chǎn)商Prodigen的說明，101GatewayBlvd，Suite100CollegeStation,Texas77845.生產(chǎn)商編碼TRY)。-對于r蛋白酶來說，對母液的大約3倍-大約300倍，優(yōu)選30倍的目標稀釋倍數(shù)是理想的(按照生產(chǎn)商lnvitrogen的說明，31"StaleyRoad,GrandIsland,NY14072，供應(yīng)商目錄號02-106)。在觀察到細胞分離時，輕柔搖晃燒瓶，并且將細胞懸浮液收集到無菌容器中。為了回收最多的細胞，用新鮮培養(yǎng)基漂洗所述燒瓶，以相同的方式將漂洗的培養(yǎng)基收集到無菌容器中，然后細胞懸浮液就可用于細胞接種步驟或細胞存庫步驟。步驟2:細胞接種在步驟1所述的細胞分離之后荻得的貼壁依賴性細胞可以按照以下說明接種到新的燒瓶中-接種細胞的密度與接種使用動物來源的成分的貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物的常用方法的密度相同。例如，MRC-5細胞是以大約5000細胞/cm2-大約40000細胞/cm2，優(yōu)選7500細胞/112-25000細胞/cm2的目標細胞密度接種的。-在細胞接種之后添加到所述燒瓶中的生長培養(yǎng)基的體積與在使用動物來源的成分的貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物的常規(guī)方法中添加的體積相同。所述生長培養(yǎng)基由新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的混合物組成。所述條件培養(yǎng)基是在所述細胞分離步驟開始時回收的細胞培養(yǎng)基(參見步驟1)。添加到所述新鮮培養(yǎng)基中的條件培養(yǎng)基的量取決于接種的細胞系。一般0%-大約75%的條件培養(yǎng)基的目標是理想的。舉例來說，對于MRC-5細胞培養(yǎng)物來說，大約10%-大約35%的條件培養(yǎng)基的目標是優(yōu)選的，并且大約0.025ml/cm2-大約3ml/cm2的培養(yǎng)基添加到所述燒瓶中是優(yōu)選的。步驟3:細胞生長接種到細胞培養(yǎng)燒瓶中的貼壁依賴性細胞是在用于使用動物來源的成分的貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物的常規(guī)方法的相同溫度培養(yǎng)的。例如，對于MRC-5細胞培養(yǎng)來說，大約30TC-大約40t:,優(yōu)選大約37匸的目標溫度是優(yōu)選的。接種到細胞培養(yǎng)燒瓶中的貼壁依賴性細胞是在與用于使用動物來源的成分的貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物的常用方法相同的氣氛中培養(yǎng)的。例如，MRC-5細胞可以在有或沒有C02對照，以及有或沒有相對濕度對照的條件下接種的。步驟4:細胞存庫對在步驟1所述的細胞分離之后獲得的貼壁依賴性細胞進行冷凍，為了獲得細胞存庫，所采用的方法與用于使用動物來源的成分的貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物的常用方法相同，不同之處在于以下各點細胞必須在不含動物來源的成分的培養(yǎng)基中冷凍，該培養(yǎng)基補充了相同的不含動物來源的防凍劑添加劑，與用于使用動物來源的成分的貼壁依賴性細胞冷凍的常用方法中的添加劑相同。例如，MRC-5細胞是在不含動物來源的成分的培養(yǎng)基中冷凍的，該培養(yǎng)基中補充了理想目標濃度的大約2.5%-大約12.5%的DMSO，和理想的目標濃度的大約0.01%-大約1%的甲基纖維素。實施例III在培養(yǎng)基中在動物或人貼壁依賴性細胞中生產(chǎn)病毒的方法步驟5:病毒感染以用于使用動物來源的成分的貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物的常規(guī)方法相同的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染貼壁依賴性細胞。例如，對于用甲型肝炎病毒(HAV)感染的MARC-5細胞來說，大約O.OOS-大約1的MOI目標是理想的。在本文所披露的不含動物來源的成分并且補充了表2所示成分的培養(yǎng)基中感染細胞，為了進行病毒生產(chǎn)，任選使用蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。步驟6:病毒繁殖在與用于使用動物來源的成分在貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物上繁殖病毒的常用方法相同的溫度下培養(yǎng)感染的貼壁依賴性細胞。例如，對于在MRC-5細胞上繁殖的HAV來說，大約31t:-大約331C，優(yōu)選32匸的目標溫度是理想的。在與用于使用動物來源的成分在貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物上進行繁殖的常規(guī)方法中使用的相同的氣氛下培養(yǎng)感染過的貼壁依賴性細胞。例如，用HAV感染過的MRC-5細胞可以在有或沒有co2對照以及有或沒有相對濕度對照的條件下培養(yǎng)。步驟7:病毒收獲貼壁依賴性細胞的病毒感染和病毒收獲之間的病毒繁殖時間與用于使用動物來源的成分在貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物上進行病毒繁殖的常規(guī)方法的繁殖時間相同。例如，在MRC-5細胞上進行的HAV繁殖是在病毒感染之后大約21-29天時間完成的。病毒收獲方法與使用動物來源的成分的在貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物進行病毒收獲的常規(guī)方法相同。例如，在MRC-5細胞上生產(chǎn)的HAV的收獲始于用PBS對細胞層進行兩次洗滌，然后，通過細胞分離回收病毒，使用補充了0.1-1g/L的EDTA的PBS，然后通過冷凍進行細胞裂解。實施例IV培養(yǎng)MRC-5細胞，直到衰老，將無花果蛋白酶用于細胞分離(參見圖1,2和3)用于MRC-5細胞衰老試驗的小規(guī)模方法需要用在步驟1-3中披露的不含動物來源的成分的方法重復(fù)所述細胞生產(chǎn)方法，直到出現(xiàn)衰老。來自細胞庫PDL21的MRC-5細胞不含動物來源的成分，對它進行解凍，接種到裝有100ml新鮮培養(yǎng)基的NuncTl75cm2燒瓶中，培養(yǎng)基按表2所述進行了適當?shù)难a充，并且在"1C下進行培養(yǎng)。在7天之后，在NuncT-l75cm2燒瓶中，在37<C下進行繼代培養(yǎng)(參見步驟1-3)，將4.2ml的酶活性為45jiUPABA/ml的無花果蛋白酶溶液用于細胞分離。繼代培養(yǎng)是按照以下方法進行的-D7:以1/8的比例將細胞接種在100ml由12.5%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中-D12:以1/8的比例將細胞接種在100ml由l2.5%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中.D17:以1/4的比例將細胞接種在100ml由25%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中.D21:重復(fù)從D7開始的方案在該方法中，細胞接種物并不固定于目標細胞密度。作為對照進行的細胞計數(shù)，證實細胞接種物密度為8000細胞/cm2-33000細胞/cm2范圍內(nèi)。在培養(yǎng)90天之后，MRC-5細胞達到了群體加倍水平"，細胞生長速度為0.56PDL/天，此后觀察到衰老。在圖1，2和3中所示出的上述結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細胞分離和使用牛血清的方法觀察到的結(jié)果相當(在83天之后出現(xiàn)了出現(xiàn)了大約PDL65的衰老，并且細胞生長速度為大約0.55PDL/天(WistromC，Villeponteau.B.Exp.Gerontol，1990;25(2):97-105))。實施例V培養(yǎng)MRC-5細胞直到衰老，將菠蘿蛋白酶用于細胞分離(參見圖1,2和3)該方法與實施例III所披露的方法相似，不同之處在于以下各點-將酶活性為0.01105明膠消化的單位(GDU)/ml的菠蘿蛋白酶溶液用于細胞分離，以取代無花果蛋白酶溶液。畫繼代培養(yǎng)是按照以下方法進《亍的.D7:以1/8的比例將細胞接種在100ml由12.5%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中D12:以1/8的比例將細胞接種在100ml由12.5%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中.D17:以1/4的比例將細胞接種在100ml由12.5%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中■D21:重復(fù)從D7開始的方案作為對照進行的細胞計數(shù)，證實細胞接種物密度為8000細胞/cm2-33000細胞/ci^范圍內(nèi)。MRC-5細胞在培養(yǎng)82天之后達到了群體加倍水平67，細胞生長速度為0，56PDL/天，此后觀察到了衰老。在圖1,2和3中所示出的結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細胞分離和使用牛血清的方法觀察到的結(jié)果相當(83天之后的衰老為PDL65，細胞生長速度=0.55PDL/天(WistromC，Villeponteau.B.Exp.Gerontol,1990;25(2):97-105))。實施例VI通過將無花果蛋白酶用于細胞分離而擴增的MRC-5細胞上的HAV生產(chǎn)(參見圖7)通過將無花果蛋白酶用于細胞分離，用培養(yǎng)的MRC-5細胞在Nunc細胞工廠(CF)中進行的HAV生產(chǎn)需要執(zhí)行在實施例II中的步驟5-7所披露的方法。在NuncT175cm2燒瓶中，擴增來自細胞庫(PDL21)的不含動物來源的成分的MRC-5細胞，然后在CF中擴增，直到群體加倍水平達到36，該過程使用實施例I的步驟1-3所披露的方法(圖7)。用HAV母液接種物感染MRC-5細胞。所述接種物是在表2所示的培養(yǎng)基中制備的，目標MOI為0.01。在感染之后，在32TC下培養(yǎng)細胞27天，在7，14和21天之后更新培養(yǎng)基三次(圖7)。HAV收獲是在感染之后27天進行的，首先用PBS洗滌細胞層兩次，然后用補充了大約0.2g/L的EDTA的PBS分離細胞，并最終冷凍細胞。使用該方法獲得的HAV總體的抗原效價為250-350E.L.I.S.單位(ELU)/0.1ml。以上結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細胞分離和使用牛血清的方法觀察到的結(jié)果相當(HAV總體抗原效價=250ELU/0.1ml)。實施例VII通過將菠蘿蛋白酶用于細胞分離而擴增的MRC-5細胞上的HAV生產(chǎn)(參見圖7)該方法與實施例V所披露的方法類似，所不同的是，將酶活性為0.01105明膠消化的單位(GDU)/ml的菠蘿蛋白酶溶液用于細胞分離，以取代無花果蛋白酶溶液。用該方法獲得的HAV的總體抗原滴度為250-350E.L.I.S.單位/0.1ml。該結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細胞分離和使用牛血清的方法觀察到的結(jié)果相當(HAV總體抗原滴度-250ELU/0.1ml)。實施例VIII通過將無花果蛋白酶用于細胞分離而擴增的MRC-5細胞的細胞存庫(參見圖8,9和10)用于通過無花果蛋白酶擴增的MRC-5細胞的細胞存庫方法，需要重復(fù)所述細胞生產(chǎn)方法，使用實施例I的步驟1-3所披露的不含動物來源的成分的程序，直到達到選定的PDL(PDL21)。在該PDL下，按照實施例I的步驟4所披露的方法冷凍細胞。對來自細胞庫(PDL14)的含有血清的MRC-5細胞進行解凍，接種到裝有100ml在表2中所示出的NuncT175cm2燒瓶中，并且在""C下培養(yǎng)。7天之后，在NuncT-175cm2燒瓶中，在37"C下繼代培養(yǎng)(參見步驟1-3),將4,2ml酶活性為45UPABA/ml的無花果蛋白酶溶液用于細胞分離。繼代培養(yǎng)是按照以下方法進行的.D7:以1/8的比例將細胞接種在100ml由12.5%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中'D12:以1/4的比例將細胞接種在100ml由25%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中-D16:用1/4的比例進行細胞存庫在該方法中，細胞接種物并不固定于目標細胞密度。細胞計數(shù)結(jié)果如圖8，9和10所示。16天之后，MRC-5細胞達到了PDL21。在該PDL下，在不含動物來源的成分的，補充了7.5。/。DMSO和0.1%甲基纖維素的培養(yǎng)基中冷凍MRC-5細胞。在解凍之后，所述MRC-5(存活力大約為卯-95%，細胞:^長速度二0.55PDL/天)(;見圖1_:2和3)。以上結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細胞分離和使用牛血清的方法觀察到的結(jié)果相當(存活力大約為90-95%，細胞生長速度-0.55PDL/天(WistromC，Vilkponteau.B.Exp.Gerontol,1990;25(2):97-105))。實施例IX通過將菠蘿蛋白酶用于細胞分離而擴增的MRC-5細胞的細胞存庫(參見圖8，9和10)該方法與實施例VII披露的方法類似，不同之處在于以下各點-將酶活性為0.01105明膠消化的單位(GDU)/ml的菠蘿蛋白酶溶液用于細胞分離，以取代無花果蛋白酶溶液。-繼代培養(yǎng)是按照以下方法進^f亍的.D7:以1/4的比例將細胞接種在100ml由25%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中.Dll:以1/8的比例將細胞接種在100ml由12.5%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中■D16:用1/4的比例進行細胞存庫細胞計數(shù)結(jié)果如圖8,9和10所示。在16天之后所述MRC-5細胞達到了群體加倍水平為21。在解凍之后，所述MRC-5細胞表現(xiàn)出的存活力和細胞生長與在解凍之前觀察到的結(jié)果相當(存活力大約為90-95%,細胞生長速度>0.55PDL/天)(參見圖l，2和3)。以上結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細胞分離并且使用牛血清觀察到的結(jié)果相當(存活力大約為90-95%，細胞生長速度=0.5SPDL/天(WistromC，Villeponteau.B.Exp.Gerontol，1990;25(2):97-105))。實施例X將Trypzean(Prodigen)或r蛋白酶(Invitrogen)用于細胞分離，培養(yǎng)MRC-5細胞直到衰老進行MRC-5細胞衰老試驗的小規(guī)模方法，涉及重復(fù)所述細胞生產(chǎn)方法，采用在實施例II的步驟1-3中所披露的不含動物來源的成分的程序，直到觀察到衰老。來自不含動物來源的成分的大約PDL27的細胞培養(yǎng)物的MRC-5細胞在NuncT175cm2中進行繁殖，使用活性為1USP/ml的Trypzean溶液或r蛋白酶(Invitrogen)溶液(用補充了EDTA的PBS稀釋母液30倍，與用于細胞分離的溶液相同，參見步驟實施例II的步驟1),按照以下方法進行-DO:以1/8的比例將細胞接種在100ml由%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中.D5:以1/4的比例將細胞接種在100ml由25%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中.D9:以1/8的比例將細胞接種在100ml由12.5%的條件培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中D14:重復(fù)從DO開始的方案在該方法中，細胞接種物并不固定于目標細胞密度。作為對照樣品進行的細胞計數(shù)，證實細胞接種物密度為8000細胞/cm2-30000細胞/cm2。在培養(yǎng)61天之后MRC-5細胞達到了超過60的PDL，細胞生長速度為大約0.56PDL/天，此后觀察到了衰老。在圖11，12和13中所示出的結(jié)果與將豬胰蛋白酶用于細胞分離和使用牛血清的方法觀察到的結(jié)果相當(在培養(yǎng)83天之后的衰老為大約PDL65，細胞生長速度為大約0.55PDL/天(WistromC，Villeponteau.B.Exp.Gerontol，1990;25(2):97-105))。權(quán)利要求1.缺少一級動物來源的外源成分的細胞培養(yǎng)基，包括i)選自下組的至少一種非動物二級來源的外源生長因子EGF，F(xiàn)GF，三-碘-Ltyronine和氫化可的松，和；ii)非動物二級來源的IGF-1和/或胰島素中的至少一種。2.如權(quán)利要求1的細胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基包括兩種或兩種以上選自下組的非動物二級來源的外源生長因子EGF,FGF，三-碘-Ltyronine和氬化可的松，以及非動物二級來源的IGF-1和/或胰島素中的至少一種的組合。3.如權(quán)利要求2的細胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基包括非動物二級來源的EGF，F(xiàn)GF，三-硤-Ltyronine和氬化可的松以及非動物二級來源的IGF-1和/或胰島素中的至少一種的組合。4.如權(quán)利要求1-3中任意一項的細胞培養(yǎng)基，其中所有成分都是非動物一級和二級來源的。5.如權(quán)利要求1-4中任意一項的細胞培養(yǎng)基，還包括非動物來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。6.如權(quán)利要求5的細胞培養(yǎng)基，其中，所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物來自小麥。7.如權(quán)利要求1-5中任意一項的細胞培養(yǎng)基，其中，所述細胞培養(yǎng)基適合培養(yǎng)動物，優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細胞。8.如權(quán)利要求1-6中任意一項的細胞培養(yǎng)基，其中，當EGF存在時，其濃度大約為0.00001-0.3mg/l;當FGF存在時，其是bFGF形式的，濃度大約為0.00001-0.1mg/l;當三醫(yī)碘-Ltyronine存在時，其濃度大約為0-1mg/l;當氫化可的松存在時，其濃度大約為0-10mg/l;當IGF-1存在時，其濃度大約為0.00001-5mg/l;當胰烏素存在時，其濃度大約為0.1-1000mg/1。9.如權(quán)利要求1-8中任意一項的細胞培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基是新鮮培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基的混合物。10.—種動物，優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細胞系，適合在權(quán)利要求1-9中任意一項的培養(yǎng)基中生長。11.一種動物，優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細胞系，適合在權(quán)利要求1-9中任意一項的培養(yǎng)基中生產(chǎn)生物學(xué)產(chǎn)物。12.如權(quán)利要求l的細胞系，其中，所述生物學(xué)產(chǎn)物是病毒。13.如權(quán)利要求10-12中任意一項的細胞系，選自下組MRC-5，WI-38，TIG-1，TIG-7，F(xiàn)RhL-2，MRC-9，IMR-90和IMR91。14.—種生產(chǎn)條件培養(yǎng)基的方法，包括將權(quán)利要求1-8中任意一項的新鮮培養(yǎng)基與動物或優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細胞組合，以便產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。15.—種生產(chǎn)動物或優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細胞的方法，包括a)將所述細胞接種在權(quán)利要求1-9中任意一項的細胞培養(yǎng)基中，并且讓所述細胞附著在基質(zhì)上；b)收獲從步驟a)得到的條件培養(yǎng)基，并且從所述基質(zhì)上分離所述細胞層，并且用非動物來源的蛋白酶解離細胞，以便形成細胞懸浮液；c)將步驟b)的細胞懸浮液接種到裝在包括附著支持物的培養(yǎng)裝置中的所述培養(yǎng)基中，使得細胞附著；和d)在相同的培養(yǎng)基中生長所迷細胞。16.如權(quán)利要求15的方法，還包括冷凍在步驟b)中收獲的細胞，以l更產(chǎn)生細胞庫。17.如權(quán)利要求15或16的方法，其中，用于步驟a)和c)中的任意一個步驟的所述細胞培養(yǎng)基是i)條件培養(yǎng)基或ii)新鮮培養(yǎng)基或iii)條件培養(yǎng)基和新鮮培養(yǎng)基的混合物。18.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述條件培養(yǎng)基是按1:0-0:1的比例(新鮮條件)用新鮮培養(yǎng)基稀釋。19.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述條件培養(yǎng)基是按7:1-1:7的比例(新鮮條件)用新鮮培養(yǎng)基稀釋。20.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述條件培養(yǎng)基是按3:1-1:3的比例(新鮮條件)用新鮮培養(yǎng)基稀釋。21.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述條件培養(yǎng)基是按3:1的比例(新鮮條件)用新鮮培養(yǎng)基稀釋。22.如權(quán)利要求15-21中任意一項的方法，其中所述用于步驟b)的非動物來源的蛋白酶選自下組半胱氨酸內(nèi)肽酶，中性真菌蛋白酶，中性細菌蛋白酶或絲氨酸蛋白酶。23.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述絲氨酸蛋白酶是重組胰蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。24.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述半胱氨酸內(nèi)肽酶選自下組無花果蛋白酶，莖菠蘿蛋白酶，和獼猴桃堿。25.—種在權(quán)利要求1-9中任意一項的培養(yǎng)基中生產(chǎn)動物或優(yōu)選人類貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物的方法，所述方法包括用非動物來源的蛋白酶對所述細胞培養(yǎng)物進行傳代的步驟。26.如權(quán)利要求25的方法，其中，所述非動物來源的蛋白酶選自下組半胱氨酸內(nèi)肽酶，中性真菌蛋白酶，中性細菌蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。27.如權(quán)利要求26中任意一項的方法，其中，所述半胱氨酸內(nèi)肽酶選自下組:無花果蛋白酶，莖菠蘿蛋白酶，和獼猴桃堿。28.如權(quán)利要求14-27中任意一項的方法，其中，所述細胞培養(yǎng)物是MRC-5，WI-38，TIG-1，TIG-7，F(xiàn)RhL-2，MRC-9，IMR-90和IMR91細胞的培養(yǎng)物。29.—種在權(quán)利要求1-9中任意一項的細胞培養(yǎng)基中，在動物或優(yōu)選人類二倍體貼壁依賴性細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)病毒的方法，所述方法包括a)用病毒感染所述細胞b)繁殖所述病毒，和c)收獲所述病毒。30.如權(quán)利要求29的方法，其中，所述細胞培養(yǎng)基是如在權(quán)利要求17-21的任意一項中進一步限定的。31.如權(quán)利要求29或30的方法，還包括對收獲的病毒進行一個或多個純化步驟。32.如權(quán)利要求29-31中任意一項的方法，其中，所述病毒是由MRC-5，WI-38,TIG-1，TIG-7，F(xiàn)RhL-2，MRC-9，IMR-90和IMR91細胞生產(chǎn)的。33.如權(quán)利要求29-32中任意一項的方法，其中，所述病毒選自下組HAV，脊髓灰質(zhì)炎病毒，HSV，CMV，EBV，風疹病毒，副粘病毒科，如腮腺炎病毒，VZV。34.—種生產(chǎn)病毒疫苗的方法，包括將權(quán)利要求29-33的病毒與可以藥用的栽體，賦形劑或佐劑混合。35.可以通過權(quán)利要求29-33中任意一項的方法獲得的病毒群體。36.—種生產(chǎn)病毒疫苗的方法，包括將權(quán)利要求34的病毒群體與可以藥用的栽體，賦形劑或佐劑混合。全文摘要本發(fā)明涉及在沒有一級動物來源的外源成分的條件下培養(yǎng)動物，優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細胞的方法，并且涉及基本上不含一級動物來源的外源成分的、適合執(zhí)行所述方法的細胞培養(yǎng)基。具體地講，本發(fā)明涉及包括至少一種，更優(yōu)選若干種，無外源動物的生長因子的細胞培養(yǎng)基。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)動物，優(yōu)選人二倍體貼壁依賴性細胞的方法，包括將非動物來源的胰蛋白酶代用品用于使細胞傳代。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)病毒，和人病毒疫苗等的方法。文檔編號C12N5/00GK101200705SQ20071018667公開日2008年6月18日申請日期2004年3月1日優(yōu)先權(quán)日2003年3月3日發(fā)明者B·G·L·埃爾茨,C·馬格托,I·S·L·克諾特,M·-M·J·貢澤,Y·J·M·希斯萊因申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司