專利名稱：一種受抗生素誘導(dǎo)的化學(xué)誘導(dǎo)性啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的化學(xué)誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，包括擬南芥啟 動(dòng)子序列的克隆、植物轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建、該啟動(dòng)子在不同組織中的活性分析、該啟動(dòng)子對(duì) 抗生素絲裂霉素和博萊霉素誘導(dǎo)響應(yīng)的時(shí)效性分析以及所用抗生素對(duì)植物的生長影響分 析。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是指RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通常位于基因 上游。一個(gè)典型的啟動(dòng)子包括CAAT-box和TATA-box，它們分別是依賴于DNA的RNA聚合 酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游幾十個(gè)堿基處。習(xí)慣上，將植物基因的 啟動(dòng)子按其基因的表達(dá)方式分為組成型啟動(dòng)子(constitutive promoter)、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 (inducible promoter)和組織特異性啟動(dòng)子(tissue-specific promoter) 但在某些情 況下，一種類型的啟動(dòng)子往往兼有其它類型啟動(dòng)子的特性。組成型啟動(dòng)子是指啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的基因在不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá) 沒有明顯差異，在所有組織中都能夠啟動(dòng)基因的表達(dá)，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時(shí)空特異性。例 如花椰菜菜葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子(Odell等，1985)。組織特異性啟動(dòng)子，是指啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的基因只在某些特定的器官和組織中表 達(dá)，并往往表現(xiàn)發(fā)育調(diào)節(jié)的特性，例如花特異性啟動(dòng)子(Vantimen等，1988)、葉片特異性啟 動(dòng)子(Taylor等，2001)。對(duì)這些啟動(dòng)子的研究，不僅有助于闡明基因在植物形態(tài)、發(fā)育、代 謝途徑等中的作用，而且可以借助這些啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)目的基因在特定的位點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)，從而 達(dá)到生產(chǎn)實(shí)踐或科研上所設(shè)定的特定目的。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是指在某些特定條件例如物理、化學(xué)、生物信號(hào)(統(tǒng)稱為“誘導(dǎo)因 子”)存在時(shí)，啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)下游的基因增強(qiáng)表達(dá)，轉(zhuǎn)錄水平大大提高。其特征為，沒有誘 導(dǎo)因子存在時(shí)，該類型啟動(dòng)子控制的基因不表達(dá)或者只有非常低的表達(dá)(也稱為“本底表 達(dá)”)，但一旦受到誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)，基因表達(dá)量迅速大幅度增加。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在基礎(chǔ)科研 和生產(chǎn)實(shí)踐中均具有重要應(yīng)用價(jià)值。它可以用于研究基因的定時(shí)定量表達(dá)對(duì)于植物表型的 影響，從而研究基因的體內(nèi)功能；也可用于生產(chǎn)實(shí)踐上，使某些外源的轉(zhuǎn)基因在需要的時(shí)候 高表達(dá)，不需要時(shí)不表達(dá)或低表達(dá)，從而達(dá)到生產(chǎn)上的某種特定目的。目前，根據(jù)植物所感受到的信號(hào)刺激種類，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子主要可劃分為物理因素 (如溫、光、旱等)、化學(xué)因素(離子、有機(jī)物、激素等)和生物因素(病菌、組織器官、發(fā)育階 段等)誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。該類啟動(dòng)子常以誘導(dǎo)信號(hào)命名，例如光誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、熱 誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、激素誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、真菌誘導(dǎo)表達(dá) 基因啟動(dòng)子和共生細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子等(吳雪峰等，2004)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子，往往 由于誘導(dǎo)物是外源的，生物體內(nèi)或環(huán)境中不存在誘導(dǎo)因素，相比較于生物因素或溫度等環(huán) 境因素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，特異性更強(qiáng)，更易控制基因的開關(guān)，故而在生產(chǎn)或科研上應(yīng)用更為廣 泛。
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啟動(dòng)子的活性分析常用到⑶S(β -glucuronidase，編碼β -葡萄糖醛酸糖苷酶) 作為報(bào)告基因，它可以作為外源基因插入到啟動(dòng)子的下游，根據(jù)組織化學(xué)染色分析就可以 直觀地得到基因在植物的不同部位的表達(dá)時(shí)空信息。在本發(fā)明申請(qǐng)中，同樣采用GUS基因 來報(bào)告啟動(dòng)子的活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種受抗生素誘導(dǎo)的化學(xué)誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，它同時(shí)也是一種組 織特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子，是從擬南芥的PARPl基因的上游克隆到的一段順序。其核 苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示，記為PARPl啟動(dòng)子。PARPl蛋白負(fù)責(zé)植物蛋白質(zhì)的多聚ADP 核糖化修飾，在植物的DNA修復(fù)中起重要作用。PARPl基因本身可以受到絲裂霉素和博萊霉 素的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。本發(fā)明提供的PARPl啟動(dòng)子是一種受絲裂霉素和博萊霉素高度誘導(dǎo)的化學(xué)誘導(dǎo) 性啟動(dòng)子，除了絲裂霉素和博萊霉素外，它幾乎不受到其它內(nèi)源或外源因素的誘導(dǎo)，故而誘 導(dǎo)特異性特別強(qiáng)。這種類型的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，對(duì)于構(gòu)建植物轉(zhuǎn)基因載體，用于科研或者生產(chǎn) 實(shí)踐均具有重要意義。本發(fā)明提供的組織特異性啟動(dòng)子，在苗期基根、開花期植物早期花藥以及花絲中 具有活性。將該啟動(dòng)子克隆于報(bào)告基因載體中，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)它所驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基 因僅在3-5天幼苗的基根部位短暫表達(dá)；而在成熟植物中，僅在第八期前的花藥以及花絲 頂部靠近花藥處有表達(dá)。因此，PARPl啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)外源基因在這些組織中特異表達(dá)，從 而達(dá)到定向地轉(zhuǎn)基因的目的。將外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中定位表達(dá)可以提高外源基因在特 定部位的表達(dá)水平，增加轉(zhuǎn)基因的目的性。重要的，本發(fā)明提供的啟動(dòng)子是一種受抗生素絲裂霉素和博萊霉素誘導(dǎo)的化學(xué)誘 導(dǎo)性啟動(dòng)子。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子特征是未誘導(dǎo)之前，基因表達(dá)量很低，當(dāng)用22μ g/ml絲裂霉 素+1. 5 μ g/ml的博萊霉素誘導(dǎo)30h后，即可使其大量表達(dá)，在不同的組織中提高的倍數(shù)有 所不同，本實(shí)驗(yàn)用定量PCR手段檢測(cè)了 GUS報(bào)告基因在花(誘導(dǎo)強(qiáng)度強(qiáng))和蓮座葉(誘導(dǎo) 強(qiáng)度弱)中誘導(dǎo)前后表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)在花里誘導(dǎo)表達(dá)量高達(dá)32倍，而在蓮座葉中提高了 7 倍。本實(shí)驗(yàn)還利用擬南芥的苗嘗試了單獨(dú)用絲裂霉素和博萊霉素處理的誘導(dǎo)效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng) 用1. 0 μ g/ml的博萊霉素誘導(dǎo)50h的效果與用22 μ g/ml絲裂霉素+1. 5 μ g/ml的博萊霉素 誘導(dǎo)30h的效果相當(dāng)。與博萊霉素相比，絲裂霉素誘導(dǎo)效果較弱，故而單獨(dú)用低濃度的博萊 霉素誘導(dǎo)50小時(shí)就可以使外源目的基因在苗中高強(qiáng)度表達(dá)。本發(fā)明還檢測(cè)了 1. 0μ g/ml的博萊霉素對(duì)植物生長的影響，將擬南芥的苗生長在 含有1. 0 μ g/ml的博萊霉素的培養(yǎng)基上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這個(gè)濃度對(duì)植物苗的生長沒有明顯不利 影響。這些結(jié)果說明，該啟動(dòng)子可以成為一個(gè)安全、有效、使用方便的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，可以 用于轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的人工調(diào)控，使目的基因定時(shí)、定量、定位地表 達(dá)。本發(fā)明還提供利用PARPl啟動(dòng)子構(gòu)建植物轉(zhuǎn)基因載體的方法。具體步驟如下
將擬南芥PARPl啟動(dòng)子通過酶切位點(diǎn)可以連接到任何轉(zhuǎn)基因載體的外源基因起 始密碼的上游，以驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)。本申請(qǐng)以轉(zhuǎn)基因載體PAKK687為例，將克隆到的 PARPl啟動(dòng)子通過EcoR I/Sma I雙酶位點(diǎn)插入到pAKK687的載體⑶S報(bào)告基因的上游，構(gòu) 成了以GUS為報(bào)告基因的植物轉(zhuǎn)基因載體。通過花序浸泡法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，成功獲 得轉(zhuǎn)基因植株。通過GUS組織化學(xué)染色可以檢測(cè)該啟動(dòng)子在不同組織以及外界因素刺激下 的活性。外源基因可以替代GUS報(bào)告基因插入在PARPl啟動(dòng)子的下游。本發(fā)明還提供抗生素誘導(dǎo)PARPl啟動(dòng)子的方法、抗生素施用濃度以及表達(dá)水平的 檢測(cè)方法。具體方法在苗期或者開花期噴灑抗生素溶液直至滴流為止，可以用22μ g/ml絲 裂霉素+1. 5 μ g/ml的博萊霉素來誘導(dǎo)，時(shí)間為30小時(shí)，但此濃度可能對(duì)植物生長造成影 響。如果用低至1. O μ g/ml的博萊霉素來誘導(dǎo)，時(shí)間為50小時(shí)，也可以達(dá)到幾乎同樣的誘 導(dǎo)效果，而且在該濃度下，抗生素對(duì)植物生長沒有不利影響(圖7中植物在含1. 0 μ g/ml的 博萊霉素的培養(yǎng)基上生長一周，植物的生長未受到明顯脅迫)。噴灑后可以根據(jù)插入的外源基因設(shè)計(jì)基因特異性引物，抽提總RNA，用定量PCR來 檢測(cè)誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)水平變化。


圖IPARPl啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增。箭頭所示為克隆到的啟動(dòng)子片斷。圖2重組質(zhì)粒示意圖，將PARPl啟動(dòng)子通過酶切位點(diǎn)插入至⑶S報(bào)告基因的上游。圖3PARP1啟動(dòng)子的組織特異性活性分析。PARPl啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因僅在3_5天幼苗的基根部位短暫表達(dá)；而在 成熟植物中，僅在第八期前的花藥以及花絲靠近花藥處有表達(dá)。A 生長3-5天幼苗；B 開 花植物的蓮座葉；C 莖生葉；D 花穗；E 早期(第八期前)的花；F 開放的花；G 莖；H 幼 嫩果莢(胚胎子葉期前)；I 成熟果莢(子葉期后)。圖4PARP1啟動(dòng)子在不同組織中博萊霉素誘導(dǎo)前后表達(dá)變化。0h/30h表示用 22 μ g/ml絲裂霉素+1. 5 μ g/ml的博萊霉素誘導(dǎo)0h/30h，圖示花穗、苗和發(fā)育中的果莢誘導(dǎo) 前后⑶S報(bào)告基因的水平變化。誘導(dǎo)前⑶S在這些組織中表達(dá)水平很低或者沒有表達(dá)，誘 導(dǎo)后在整個(gè)花穗中，苗期的整個(gè)植物以及整個(gè)果莢中均有強(qiáng)烈表達(dá)，顯示強(qiáng)烈的藍(lán)色信號(hào)。圖5生長一周的幼苗用1. 0 μ g/ml的博萊霉素誘導(dǎo)。A.對(duì)照；B. 0. 5 μ g/ml博萊 霉素誘導(dǎo)5小時(shí)；C. 0. 5 μ g/ml博萊霉素誘導(dǎo)50小時(shí)；D. 1. 0 μ g/ml博萊霉素誘導(dǎo)5小時(shí)； Ε.Ι.Ομ g/ml博萊霉素誘導(dǎo)50小時(shí)；F. 35S啟動(dòng)子在苗期的活性。圖6利用定量PCR分析誘導(dǎo)前后PARPl啟動(dòng)子的活性變化。在花里誘導(dǎo)表達(dá)量高 達(dá)32倍(較強(qiáng))，而在蓮座葉中表達(dá)量約為7倍(較弱)。圖7在含有1. 0 μ g/ml博萊霉素的V2MS培養(yǎng)基生長一周的幼苗。1. 0 μ g/ml博 萊霉素未對(duì)植物造成明顯傷害，在該濃度的培養(yǎng)基上生長一周的苗除了根稍許彎曲，子葉 大小及根長與對(duì)照接近。圖8PARP1啟動(dòng)子受其它外界環(huán)境因素影響的情況。從圖中可以看出在苗中除了 絲裂霉素和博萊霉素，PARPl幾乎不受其它外界環(huán)境因素的誘導(dǎo)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列是實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中所敘述的條件，或按照制造廠商所建議的條 件。實(shí)施例IPARPl基因啟動(dòng)子片段的克隆1.DNA的提取取擬南芥生態(tài)型Col-O植株的葉片，液氮研磨，加0.4ml 2% CTAB (2% CTAB, IOOmM Tris-Cl pH8. 0,20mM EDTApH8. 0,1. 4M NaCl，臨用前加巰基乙醇至 0. 2% )，混勻；65°C水浴30min ；加入0. 4ml氯仿，混勻；4000rpm，離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清到新 的離心管；加入400 μ 1異丙醇，混勻，室溫靜置IOmin ； 12000rpm，離心IOmin ；棄上清，70% 乙醇洗滌；37°C烘箱干燥，加20 μ 1水溶解。用0. 8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA的質(zhì)量。2. PARPl基因啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增根據(jù)PARPl基因5’上游序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物， 一對(duì)不含酶切位點(diǎn)的引物，上游引物5’-ATT TTG AGG CGG TGG AGT TTC-3’ ；下游引物 5，-CGT CGA CTT TGA GCT TGT TCG-3，。一對(duì)含有酶切位點(diǎn)，上游引物5，_GAA TTC TTTTGA GGC GGT GGA GTT TC-3，；下游引物5，_CCC GGG TTT CGT CTT CTT CTT CAGGAG MT AG-3，。 見SEQ ID NO. 2。首先用不含酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，利用LATaq酶，按以下條件 940C 2min ；94°C 30s, 53°C /51°C /49°C /47°C /45°C 30s, 72°C 2min30s 共 32 個(gè)循環(huán)?；厥?大于2kb的條帶，作為模板。再用帶有酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物進(jìn)行二次PCR，利用高保真pfu 酶，按以下條件94°C 2min ；94°C 30s, 50°C /49°C /48°C 30s, 72°C 2min30s 共 32 個(gè)循環(huán)，擴(kuò) 增出一條單一的2179bp的片段(見圖1)。實(shí)施例2PARP1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物電泳回收后，用T4 DNA連接酶連接至中間載體PCR Blunt中，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5 α，挑選克隆，搖菌并抽提質(zhì)粒。電泳鑒定后選取有插入的克隆進(jìn)行酶切鑒定，然 后測(cè)序，測(cè)序正確的克隆可以利用限制性內(nèi)切酶切下目的片段，插入到最終轉(zhuǎn)基因載體中 (本發(fā)明申請(qǐng)中為ΡΑΚΚ687)(見圖2)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。得到的克隆經(jīng)酶切鑒定正確后進(jìn)行 質(zhì)粒擴(kuò)增，以備轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。實(shí)施例3PARP1啟動(dòng)子在不同組織中的活性分析按常規(guī)轉(zhuǎn)化方法將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，抗性篩選后進(jìn)行PCR鑒定。 鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子通過花序浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥，收取Ttl代種子進(jìn)行Basta抗性篩選。取 T1代種子分離比為3 1的小苗進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，觀察GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥各 個(gè)植物器官的表達(dá)情況，拍照。GUS染色發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子在3-5天苗期基根處以及早期花藥中 (第八期前)具有短暫活性，但在雄蕊花絲頂部中一直表現(xiàn)出活性(見圖3)，在其它組織中 未觀察到明顯活性。實(shí)施例4PARP1啟動(dòng)子在不同抗生素濃度誘導(dǎo)下的活性分析取轉(zhuǎn)基因陽性植株的不同組織，置于含22μ g/ml絲裂霉素+1. 5μ g/ml博萊霉素 的離心管中分別處理5h、30h。⑶S染色分析發(fā)現(xiàn)抗生素強(qiáng)烈誘導(dǎo)了⑶S報(bào)告基因的表達(dá)。 在花穗中，誘導(dǎo)前除了花絲頂部，整個(gè)花穗中GUS表達(dá)水平都很低，誘導(dǎo)后在花柄、整個(gè)花 絲、莖及雌蕊中GUS都被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，但在花藥中誘導(dǎo)程度相對(duì)較弱；在培養(yǎng)基上生長了 7天 的幼苗，在抗生素誘導(dǎo)之前未檢測(cè)到GUS信號(hào)，誘導(dǎo)5h后信號(hào)開始出現(xiàn)，誘導(dǎo)30h之后，整個(gè)根、葉脈、莖尖等位置均有藍(lán)色出現(xiàn)，信號(hào)強(qiáng)烈(圖4僅顯示30h的情況)，誘導(dǎo)所達(dá)到的 強(qiáng)度可與目前廣泛使用的高表達(dá)啟動(dòng)子花椰菜病毒35S啟動(dòng)子幾乎接近(圖6)。未誘導(dǎo)之 前在幼嫩果莢中未檢測(cè)到GUS信號(hào)，誘導(dǎo)5h后首先在果莢兩端出現(xiàn)藍(lán)色信號(hào)，誘導(dǎo)了 30h 后，藍(lán)色信號(hào)遍布整個(gè)果莢(圖4)。其它組織如莖、莖生葉、蓮座葉在誘導(dǎo)了 30h之后，在莖 的切口處、蓮座葉、莖生葉的葉脈都能檢測(cè)到藍(lán)色信號(hào)，但信號(hào)不如苗中強(qiáng)(未顯示)，所以 本啟動(dòng)子更適合于在苗期的整個(gè)植物中或者開花植物的花中誘導(dǎo)外源基因產(chǎn)物的高表達(dá)。實(shí)施例5PARP1啟動(dòng)子在抗生素誘導(dǎo)下的活性定量分析本實(shí)驗(yàn)用定量PCR手段檢測(cè)了用22μ g/ml絲裂霉素+1. 5μ g/ml的博萊霉素誘 導(dǎo)30h前后花和蓮座葉中⑶S的表達(dá)量變化，引物序列如下F-primer :5’ -AGT GGC AGT GAAGGG CGA ACA GT-3’ ；R-primer 5' -TCA GCG TAA GGG TAA TGC GAG GT-3，。見 SEQ IDN0. 3。950C 3min ；95°C 5s, 60°C 30s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)強(qiáng)度較高的花中誘導(dǎo)提 高了 32倍，在誘導(dǎo)較弱的蓮座葉中誘導(dǎo)提高了 7倍(見圖5)。實(shí)施例6抗生素濃度對(duì)植物生長的影響分析試驗(yàn)更低的抗生素濃度，以及利用博萊霉素和絲裂霉素分別進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 相對(duì)于博萊霉素來說，絲裂霉素的誘導(dǎo)效果較弱，當(dāng)用1. O μ g/ml的博萊霉素誘導(dǎo)50h的效 果與用22 μ g/ml絲裂霉素+1. 5 μ g/ml的博萊霉素誘導(dǎo)30h的效果相當(dāng)(圖6)，故而實(shí)際 應(yīng)用時(shí)可以采用1. 0 μ g/ml的博萊霉素來進(jìn)行誘導(dǎo)。將擬南芥種子消毒后均勻撒種至含有1. 0 μ g/ml的博萊霉素的1/2MS培養(yǎng)基上， 置4°C春化兩天后移至光照培養(yǎng)箱，一周后發(fā)現(xiàn)擬南芥的生長未受到明顯的影響(見圖7)， 說明該誘導(dǎo)濃度對(duì)最為敏感的苗期植物生長沒有明顯不利影響，可用于啟動(dòng)子的誘導(dǎo)。實(shí)施例7PARP1基因?qū)ζ渌饨绛h(huán)境條件以及內(nèi)源生物因素的響應(yīng)情況分析擬南芥信息網(wǎng)站(www.arabidopsis.org)目前幾乎綜合了所有關(guān)于擬南芥基因 組水平的一些信息，它利用來自不同實(shí)驗(yàn)室的基因芯片結(jié)果，提供了擬南芥轉(zhuǎn)錄組在不同 外界因素影響下的變化情況。根據(jù)該網(wǎng)站提供的信息我們可以查詢某一基因在不同環(huán)境因 素影響下的變化情況。我們發(fā)現(xiàn)在擬南芥苗中(氣生部分以及根)PARPl基因的表達(dá)(圖 8)幾乎不受其它常見的外界脅迫因素如冷、熱、干旱、鹽、氧化、傷害等的影響，僅僅在用 Genotoxin(絲裂霉素+博萊霉素)處理時(shí)誘導(dǎo)大幅度提高。這從另一方面說明PARPl啟動(dòng) 子受誘導(dǎo)的特異性非常強(qiáng)，應(yīng)用時(shí)不易受其它因素的干擾。序列表
1. SEQ ID NO. 1 的信息
(i)序列特征長2179bp，線性核苷_I
( )分子類型核酸
(iii)序列及序列標(biāo)記紅色(5’ -UTR)；藍(lán)色ATG(PARP1基因起始密碼子)
1-50TTTTGAGGCGGTGGAGTTTCTATTGATTGGTTATCGATGACCACTTGCAT
F-primer
51-100CGTCAAATGGTTCTTTGATTCGTGGTTTCGGCCCCAGCTTCATACTATCA
101-150CGAGACTCGACCATCTTGTTTTTTTCTTCTTCTTCTTGGTAAATGGTTTC
151-200ACAACTTGGTTCCTCTTTCTTTCATTTTATTTTATATACTATCATAGCAT
2151-2200 GAACTATTCTCCTGAAGAAGAAGACGAAAA TG0098]0099]R-primer0100]2. SEQ ID NO. 20101]用于擴(kuò)增PARPl啟動(dòng)子的引物0102]不含有酶切位點(diǎn)0103]上游引物5’ -ATTTTGAGGCGGTGGAGTTTC-3，0104]下游引物5，-CGTCGACTTTGAGCTTGTTCG-3'0105]含有酶切位點(diǎn)0106]上游引物5，-GAATTCTTTTGAGGCGGTGGA GTT TC-3'0107]下游引物5，-CCCGGGTTTCGTCTTCTTCTT CAG GAG AAT0108]3. SEQ ID NO. 30109]用于定量PCR的引物0110]上游引物:5，-AGTGGCAGTGAAGGGCGAACA GT-3'0111]下游引物5，-TCAGCGTAAGGGTAATGCGAG GT-3，。
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權(quán)利要求
一個(gè)化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其特征在于該啟動(dòng)子為一段從擬南芥中克隆到的DNA序列，具有SEQ ID No.1所述的核苷酸順序。
2.如權(quán)利要求1所述化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子在組織特異性表達(dá)中的應(yīng)用，其特征在于用于將 外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中定位表達(dá)，以提高外源基因在特定部位的表達(dá)水平，增加轉(zhuǎn)基因 的目的。
3.如權(quán)利要求1所述化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體中的應(yīng)用，其特征在于用于轉(zhuǎn) 基因載體的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的人工調(diào)控，使目的基因定時(shí)、定量、定位地表達(dá)。
4.一種對(duì)權(quán)利要求1所述化學(xué)啟動(dòng)子進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)的方法，其特征在于受到低濃度絲 裂霉素和博萊霉素誘導(dǎo)時(shí)，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下游基因強(qiáng)烈表達(dá)。
5.一種包含權(quán)利要求1所述化學(xué)啟動(dòng)子的重組載體。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子。包括受絲裂霉素和博萊霉素誘導(dǎo)的化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的克隆方法、利用該啟動(dòng)子的植物轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方法、啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因表達(dá)模式分析以及使用和誘導(dǎo)該啟動(dòng)子的方法。該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因在植物中的絕大部分組織中沒有表達(dá)或低水平表達(dá)；經(jīng)抗生素處理后該啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在整個(gè)苗期以及花穗中強(qiáng)烈表達(dá)。除了抗生素外，該啟動(dòng)子幾乎不受其它因素的誘導(dǎo)，特異性強(qiáng)，故該啟動(dòng)子可被用于構(gòu)建抗生素誘導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，在科研和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101921764SQ20101017558
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者劉偉偉, 張海磊, 葛曉春 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)