專利名稱：一種提高抗真菌蛋白質(zhì)抗菌活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護(hù)學(xué)以及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種賦予抗菌蛋白靶向 結(jié)合真菌細(xì)胞壁能力的方法。
背景技術(shù)：
抗真菌蛋白質(zhì)是一類對真菌生長具有抑制作用的蛋白質(zhì)，一般分子量較小，結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定，結(jié)合到真菌細(xì)胞表面后起到可以起到抑制真菌生長的作用?？怪参锊≡婢牡?白質(zhì)由于不易使真菌產(chǎn)生耐藥性，對環(huán)境友好，對人畜安全而可以作為生物農(nóng)藥使用?？?真菌蛋白的抗菌機(jī)制主要有在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上形成孔道，造成離子泄漏，對真菌產(chǎn)生 破壞作用；或者具有類似于去垢劑的功能，使真菌的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜受到破壞(Zasloff et al，2002)。目前已報道的抗真菌蛋白包括植物防御素(plant defensins)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移 蛋白(lipidtransfer proteins, LTPs)、硫素(thionins)、蛻皮素(snakins)、橡膠蛋白類 (hevein-lik印印tides)、打結(jié)素類(knottin-like ρ印tides)、鳳仙花素(IbAMPs)，MBPl 和新近發(fā)現(xiàn)的薺菜素(sh印herdins)、環(huán)肽(cyclotides)等。幾丁質(zhì)(chitin)是真菌細(xì)胞壁所特有的重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，植物細(xì)胞壁及哺乳動物 細(xì)胞中均不含此類物質(zhì)。幾丁質(zhì)結(jié)合域(chitin-binding domain, CBD)是一段多肽，多 見于幾丁質(zhì)酶(chitinase)，可幫助蛋白質(zhì)結(jié)合于幾丁質(zhì)底物，但幾丁質(zhì)結(jié)合域本身并無 抑菌活性。幾丁質(zhì)結(jié)合域是一種高度保守的結(jié)構(gòu)域，各種不同來源的幾丁質(zhì)結(jié)合域同源 性非常高，可普遍地結(jié)合于真菌細(xì)胞表面的幾丁質(zhì)，從而產(chǎn)生對真菌細(xì)胞壁的親和作用。 Tantimavanich(1998)發(fā)現(xiàn)，若將源于黑麥種子的幾丁質(zhì)酶RSC_a的幾丁質(zhì)結(jié)合域去掉， RSC-a對水溶性乙二醇幾丁質(zhì)的水解活性幾乎沒有變化，而對不溶于水、存在于真菌細(xì)胞壁 的膠狀幾丁質(zhì)的活性只相當(dāng)于完整RSC-a的28%。而且RSC-a的幾丁質(zhì)結(jié)合域?qū)锥≠|(zhì)的 結(jié)合是獨立于催化區(qū)的，暗示幾丁質(zhì)結(jié)合域可以使蛋白質(zhì)集中于真菌的細(xì)胞壁而起作用。 此外，在Iseli B. (1993)對煙草class I幾丁質(zhì)酶的研究中發(fā)現(xiàn)，具1個幾丁質(zhì)結(jié)合域的 幾丁質(zhì)酶的抗真菌能力比不具幾丁質(zhì)結(jié)合域的相同的酶要高3倍。如果將幾丁質(zhì)結(jié)合域去 掉，幾丁質(zhì)酶的抗真菌能力將大大下降(Itoh et al.，2002)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高抗真菌蛋白質(zhì)抗菌活性的方法，以改造抗真菌蛋 白質(zhì)，提高其對真菌細(xì)胞壁的結(jié)合能力，從而提高抗菌蛋白質(zhì)作用的有效濃度。本發(fā)明方法包括將編碼幾丁質(zhì)結(jié)合域(chitin-binding domain, CBD)的DNA序列 與編碼抗真菌蛋白質(zhì)的cDNA序列以正確讀碼框連接，然后克隆到蛋白質(zhì)表達(dá)載體中，使用 工程菌對融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)一步利用商業(yè)化介質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。還包括純化后的 蛋白質(zhì)的幾丁質(zhì)結(jié)合能力的檢測，以及融合了幾丁質(zhì)結(jié)合域的蛋白質(zhì)抗真菌活性與原來抗 真菌蛋白質(zhì)抗菌活性的優(yōu)劣比較分析。本發(fā)明提供的將幾丁質(zhì)結(jié)合域以正確讀碼框連接到抗真菌蛋白質(zhì)的N末端進(jìn)行
3融合表達(dá)與純化的方法，其步驟如下(1)通過PCR或其它手段，得到抗真菌蛋白質(zhì)的開放閱讀框序列，克隆到適當(dāng)?shù)谋?達(dá)載體中，然后將幾丁質(zhì)結(jié)合域的編碼序列再次插入到該載體中，與抗真菌蛋白質(zhì)的讀碼 框相融合，注意間隔適當(dāng)核苷酸以保證酶切位點及閱讀框的正確；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到的基因工程菌接種于LB液體培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)到對數(shù)生長期后以IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，然后超聲破菌，獲得總的菌體蛋 白質(zhì)；(3)利用載體所帶的蛋白質(zhì)表達(dá)標(biāo)簽的親和介質(zhì)純化步驟(2)所得蛋白質(zhì)，透析， 獲得純化了的帶有幾丁質(zhì)結(jié)合域的抗真菌蛋白質(zhì)。應(yīng)注意到，除了利用基因工程手段生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)外，操作者還可以將抗菌蛋白 質(zhì)的閱讀框與CBD編碼序列融合后插入到轉(zhuǎn)基因載體中，然后轉(zhuǎn)化目的物種，以產(chǎn)生抗病 能力更強(qiáng)的新物種。本發(fā)明還提供測試改造過的融合蛋白質(zhì)與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力的方法，其步驟為 將表達(dá)了融合蛋白質(zhì)的大腸桿菌總蛋白與幾丁質(zhì)珠(市售)溫育，洗去非特異性結(jié)合的蛋 白質(zhì)，收集親和柱上樣流出液并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過檢驗各上樣流出液中是否含有目 的融合蛋白及目的融合蛋白的量來判斷目的融合蛋白的幾丁質(zhì)結(jié)合能力。本發(fā)明還提供將改造過的融合蛋白質(zhì)與原先蛋白質(zhì)的抑菌能力相互比較的方法， 其步驟如下將融合蛋白和原蛋白質(zhì)分別與植物病原真菌孢子定量混合培養(yǎng)，通過定時測 量培養(yǎng)液吸光度以測定病原真菌生長情況，從而判定兩種蛋白質(zhì)對該植物病原真菌生長所 起的抑制作用，比較它們的抑菌能力。在本發(fā)明中，術(shù)語“幾丁質(zhì)結(jié)合域”與“CBD”交替使用，意指一類多肽或結(jié)構(gòu)域，具 有結(jié)合幾丁質(zhì)的能力，包括來源于微生物與植物的各種擁有該種特性或功能的多肽或結(jié)構(gòu) 域。術(shù)語“抗真菌蛋白質(zhì)”指一類對真菌具有抑制或殺滅作用的蛋白質(zhì)，包括來源于植 物或其它物種的各類擁有該特性或功能的蛋白質(zhì)，尤其指不含有幾丁質(zhì)結(jié)合域的該種蛋白 質(zhì)。術(shù)語“有效濃度”指一定濃度的溶液中，實際起作用的成分的濃度，一般低于該成 分的實際濃度。依照本發(fā)明的方法，可將幾丁質(zhì)結(jié)合域與所有不含有幾丁質(zhì)結(jié)合域的抗真菌蛋白 質(zhì)融合，賦予抗真菌蛋白質(zhì)靶向結(jié)合真菌細(xì)胞壁的能力，從而提高該種蛋白質(zhì)抑制真菌的 有效濃度。本發(fā)明提供了一種將幾丁質(zhì)結(jié)合域添加到不含幾丁質(zhì)結(jié)合域的抗真菌蛋白質(zhì) 末端，使之形成融合蛋白的方法，目的是提高抗菌蛋白質(zhì)與真菌細(xì)胞壁的結(jié)合能力，從而 提高抗菌蛋白的作用效率。應(yīng)理解實施例中所采用的抗真菌蛋白質(zhì)Ace-AMPl (Allium cepaantimicrobial protein 1)僅僅作為實施該方法的一個例子，而不為限制該專利申請 的應(yīng)用范圍。該發(fā)明所提供的方法同樣可以應(yīng)用于其它抗真菌蛋白的活性改造。采用Ace-AMPl抗菌蛋白作為例子是因為該蛋白是目前所報道的植物抗真菌蛋 白中作用最強(qiáng)的蛋白之一。它是一種來自于洋蔥種子的蛋白質(zhì)，具有較為廣譜的抗真菌 能力(Cammue et al.，1995)。實施例中所采用的幾丁質(zhì)結(jié)合域CBD。hiA是環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)幾丁質(zhì)酶chiA的幾丁質(zhì)結(jié)合域，已證明其對幾丁質(zhì)的結(jié)合性則很強(qiáng) (ffatanabeet al. ，1994)。本發(fā)明中也僅僅采用CBD。hiA作為幾丁質(zhì)結(jié)合域的一個例子，并不局限于此結(jié)合 域，任何其它被證明具有幾丁質(zhì)結(jié)合能力的CBD同樣可被應(yīng)用于本發(fā)明中提到的方法。本 發(fā)明為提高抗真菌蛋白質(zhì)的作用效率提供了重要方法，可以利用本發(fā)明中提到的方法改造 任何現(xiàn)有的抗菌蛋白質(zhì)。


圖1為按照本發(fā)明的方法構(gòu)建所獲得的幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)與抗真菌蛋白質(zhì) (Ace-AMPl)的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)載體示意2為按照本發(fā)明的方法構(gòu)建所獲得的融合蛋白的表達(dá)以及純化結(jié)果。列1表示 未加IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白質(zhì)；列2表示加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌總蛋白質(zhì)；列3 表示經(jīng)鎳柱純化以及透析過后的CBD。hiA與Ace-AMPl的融合蛋白質(zhì)TRX-CBD-Ace-AMPl。圖3為按照本發(fā)明提供的方法所獲得的融合蛋白的幾丁質(zhì)結(jié)合能力檢測結(jié)果。 列1表示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的含有改造過的融合蛋白質(zhì)的大腸桿菌總蛋白質(zhì)；列2-列7表 示緩沖液洗下的雜蛋白質(zhì)；列8表示經(jīng)過緩沖液洗滌后仍結(jié)合于幾丁質(zhì)珠上的CBD。hiA與 Ace-AMPl 的融合蛋白質(zhì) TRX-CBD-Ace-AMPl。圖4與圖5為按照本發(fā)明的方法所獲得的融合蛋白與原蛋白質(zhì)的對毛霉抑菌活性 比較的結(jié)果。“ TRX，，、“ TRX-Ace-AMP 1 ”及“ TRX-CBD-Ace-AMP 1，，分別表示載體所帶的標(biāo)簽蛋 白質(zhì)、改造前的抗菌蛋白質(zhì)、改造后的CBD融合抗菌蛋白質(zhì)。圖4表示在不同濃度的三種蛋 白質(zhì)存在下，104個/ml的毛霉孢子于25°C生長60h的情況。圖5表示不同濃度的三種蛋 白質(zhì)對毛霉于25°C生長60h孢子萌發(fā)的影響，OD405值越小，代表蛋白質(zhì)的抑菌效果越好。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等所著《分子克隆實驗指南》(New York =Cold Spring Harbor LabortatryPress, 1989)中所敘述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1幾丁質(zhì)結(jié)合域與抗真菌蛋白質(zhì)融合基因的構(gòu)建1.合成CBD。hiA片段(SEQ ID NO. 1，源于幾丁質(zhì)酶Al的幾丁質(zhì)結(jié)合域的編碼核酸 序列，可編碼氨基酸序列如SEQ ID而.2所示的多肽)，應(yīng)注意本實驗僅以080。1^片段為 例，所選取的幾丁質(zhì)結(jié)合域片段并不局限于此。設(shè)計引物CBDchiA-F與CBDchiA-R，在兩端 分別引入限制性內(nèi)切酶識別位點，PCR后得到帶有限制性內(nèi)切酶位點的片斷(視即將選用 的載體而定，此實施例引入的酶切位點為BglII與KpnI)，引物序列見SEQ ID NO. 5。2.提取洋蔥種子中總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR后獲得抗真菌蛋白質(zhì)Ace-AMPl的cDNA 片段(SEQ ID NO. 3，一種源于洋蔥種子的不含幾丁質(zhì)結(jié)合域的抗真菌蛋白質(zhì)的編碼核酸序 列，可編碼氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示的多肽，Cammue等，1995)，應(yīng)該注意到本實驗僅 以Ace-AMPl的cDNA為例，所選取的抗真菌蛋白質(zhì)并不局限于此?？寺r根據(jù)該片段設(shè)計 引物AceAMPl-F與AceAMPl-R，并在兩端分別弓丨入限制性內(nèi)切酶識別位點(視選用的載體而
5定，此實施例引入的酶切位點為NcoII與XhoI)，引物序列見SEQ ID NO. 5。3.將步驟2中擴(kuò)增所得序列正向插入合適的表達(dá)載體(視具體的表達(dá)蛋白質(zhì)而 定，此實施例選用的表達(dá)載體為pET-32a，但并不局限于此)，測序正確后，然后再插入步驟 1所獲得的片斷，得到CBD。hiA與Ace-AMPl的編碼序列相融合的表達(dá)載體。構(gòu)建所得的表達(dá) 載體如圖1所示。實施例2融合抗真菌蛋白質(zhì)的獲得1.將實施例1獲得的含CBD。hiA與Ace-AMPl的融合蛋白質(zhì)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化基因工程 菌Origami (DE3)，應(yīng)該注意到本實驗僅以CBD。hiA作為幾丁質(zhì)結(jié)合域的代表，Ace-AMPl蛋白 作為抗真菌蛋白質(zhì)的代表，而不用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。2.待轉(zhuǎn)化菌落長出后，將平板上的菌落接種至300ml含有卡那霉素、氨芐青霉 素及四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6-0. 8，加入終濃度0. 05mM的 IPTG，30 V培養(yǎng)4h或20 V培養(yǎng)過夜。3.將步驟2所得的大腸桿菌菌液離心去上清，菌體以IXPBS洗滌后重懸于 His-tag融合蛋白純化所需的IX初始緩沖液，加入終濃度ImM的PMSF，超聲破菌，離心后 取上清并以0. 45 μ m孔徑濾膜過濾，濾過液使用鎳柱進(jìn)行純化，純化后蛋白對1 XPBS溶液 透析。將透析產(chǎn)物以0.22 μ m濾膜過濾除菌，得到純化的CBD。hiA與Ace-AMPl的融合蛋白。 表達(dá)及純化的結(jié)果如圖2電泳所示。實施例3融合抗真菌蛋白質(zhì)的幾丁質(zhì)結(jié)合能力測試1.依照實施例2中步驟1，2的方法表達(dá)融合蛋白質(zhì)，應(yīng)該注意到此處僅以CBD。hiA 的作為幾丁質(zhì)結(jié)合域的代表，Ace-AMPl蛋白作為抗真菌蛋白質(zhì)的代表，而不用于限制本發(fā) 明的應(yīng)用范圍。2.將所得菌液離心后，以1 XPBS洗滌，重懸于幾丁質(zhì)結(jié)合所需的1 X結(jié)合緩沖液 中。加入終濃度為ImM的PMSF后超聲破菌，離心后得到的上清蛋白質(zhì)以0.45 μ m孔徑的濾 膜過濾。加入幾丁質(zhì)珠與上清蛋白質(zhì)溫育lh，以大量緩沖液洗滌雜蛋白質(zhì)多次，最后吸取少 量幾丁質(zhì)珠與2XSDS上樣緩沖液混勻煮沸，進(jìn)行電泳檢測。電泳檢測的結(jié)果如圖3所示。實施例4改造過的融合蛋白質(zhì)與原抗菌蛋白質(zhì)抗毛霉孢子萌發(fā)能力的比較以下體系加樣毛霉孢子懸液各2 μ 1+改造過的融合蛋白質(zhì)、或原蛋白質(zhì)或標(biāo)簽 蛋白質(zhì)，使終濃度分別為0μ g/ml，10y g/ml，20y g/ml，50y g/ml，100y g/ml+馬鈴薯葡萄 糖液體培養(yǎng)基167 μ 1，利用IXPBS將每孔終體積補(bǔ)齊至200 μ 1，每種濃度于同一塊板中作 三組重復(fù)。25°C培養(yǎng)，于60h后測量0D405。三種蛋白質(zhì)對于植物病原真菌的抑制效果如圖 4與圖5所示。實驗結(jié)果表明，標(biāo)簽蛋白質(zhì)明顯沒有抗性，而實施例2中得到的融合抗真菌 蛋白抗毛霉孢子萌發(fā)的能力顯著優(yōu)于改造前的蛋白質(zhì)。將幾丁質(zhì)結(jié)合域連接到抗真菌蛋白質(zhì)的末端形成融合蛋白的方法，可賦予抗真菌 蛋白質(zhì)靶向結(jié)合到真菌細(xì)胞壁的能力，從而使抗真菌蛋白質(zhì)對真菌作用的有效濃度提高。 該技術(shù)可用于生物農(nóng)藥的生產(chǎn)上，或者用于利用轉(zhuǎn)基因手段改造物種的抗病能力上。1. SEQ ID NO. 1 的信息(1)序列特征長153bp，線性單鏈核苷酸(2)分子類型核酸(3)序列及序列標(biāo)記
61 121
ACAAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTC CBDchiA-F
ACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAA CCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGCTTCAA
CBDchiA-R
注核苷酸序列位點在左側(cè)加以標(biāo)識，序列起始點定為+1。CBDchiA-F, CBDchiA-R
指PCR擴(kuò)增CBD。hiA用到的引物(F-正向；R-反向)


2.SEQ ID NO. 2 的信息
(1)序列特征長為53殘基的單鏈線性多肽
(2)分子類型多肽
(3)序列及序列標(biāo)記
TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ
3.SEQ ID NO. 3 的信息
(1)序列特征長279bp，線性單鏈核苷酸
(2)分子類型核酸
(3)序列及序列標(biāo)記
1 CAGAACATATGCCCAAGGGTTAATCGAATTGTGACACCCTGTGTGGCCTACGGACTCGGA
AceAMPl-F
61 AGGGCACCAATCGCCCCATGCTGCAGAGCCCTGAACGATCTACGGTTTGTGAATACTAGA AACCTACGACGTGCTGCATGCCGCTGCCTCGTAGGGGTAGTGAACCGGAACCCCGGTCTG AGACGAAACCCTAGATTTCAGAACATTCCTCGTGATTGTCGCAACACCTTTGTTCGTCCC TTCTGGTGGCGTCCAAGAATTCAATGCGGCAGGATTAAC
121 181 241
AceAMPl-R
注核苷酸序列位點在左側(cè)加以標(biāo)識，序列起始點定為+1。AceAMPl-F,AceAMPl-R 指反式PCR獲得Ace-AMPl的cDNA片段中用到的引物(F-正向；R-反向)。4. SEQ ID NO. 4 的信息(1)序列特征長為93殘基的單鏈線性多肽(2)分子類型多肽(3)序列及序列標(biāo)記QNICPRVNRIVTPCVAYGLGRAPIAPCCRALNDLRFVNTRNLRRAACRCLVGVVNRNPGLRRNPRFQNI PRDCRNTFVRPFffffRPRIQCGRIN5. SEQ ID NO.的信息
權(quán)利要求
一種用于改造抗真菌蛋白質(zhì)的方法，其特征在于將具有真菌結(jié)合能力的幾丁質(zhì)結(jié)合域與抗菌蛋白質(zhì)相連，使原抗菌蛋白質(zhì)帶有幾丁質(zhì)結(jié)合域；具體步驟如下(1)通過PCR手段，得到抗真菌蛋白質(zhì)的開放閱讀框序列，克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，然后將幾丁質(zhì)結(jié)合域的編碼序列再次插入到該載體中，與抗真菌蛋白質(zhì)的讀碼框相融合，間隔適當(dāng)核苷酸以保證酶切位點及閱讀框的正確；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到的基因工程菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到對數(shù)生長期后以IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，然后超聲破菌，獲得總的菌體蛋白質(zhì)；(3)利用載體所帶的蛋白質(zhì)表達(dá)標(biāo)簽的親和介質(zhì)純化步驟(2)所得蛋白質(zhì)，透析，獲得純化的帶有幾丁質(zhì)結(jié)合域的抗真菌蛋白質(zhì)。
2.—種將CBD域融合到目標(biāo)蛋白質(zhì)的末端的方法，其特征在于將編碼CBD域的核苷酸 序列連接到編碼抗真菌蛋白質(zhì)的核苷酸序列的N末端或C末端，使兩者的讀碼框一致，從而 表達(dá)出融合蛋白。
3.—種如權(quán)利要求2所得到的改造過的抗真菌蛋白質(zhì)的編碼序列插入到蛋白質(zhì)表達(dá) 載體，轉(zhuǎn)入基因工程菌所生產(chǎn)的抗真菌蛋白質(zhì)。全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種用于改造抗真菌蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明包括將編碼幾丁質(zhì)結(jié)合域的DNA序列與編碼抗真菌蛋白質(zhì)的cDNA序列以正確讀碼框連接，然后克隆到蛋白質(zhì)表達(dá)載體中，使用工程菌對融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)一步利用商業(yè)化介質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。還包括純化后的蛋白質(zhì)的幾丁質(zhì)結(jié)合能力的檢測以及抗真菌活性分析。本發(fā)明可提高抗真菌蛋白質(zhì)的抗菌效率。應(yīng)用本發(fā)明可以改造現(xiàn)有抗真菌蛋白質(zhì)的活性，提高它們對真菌細(xì)胞壁的靶向結(jié)合能力。
文檔編號C12N15/62GK101921792SQ20101017559
公開日2010年12月22日 申請日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者何玥, 吳殷, 葛曉春 申請人:復(fù)旦大學(xué)