專(zhuān)利名稱(chēng)：幽門(mén)螺桿菌尿素酶b抗原表位多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位(UreB)蛋 白B細(xì)胞抗原表位多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1982年澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall首次從慢性活動(dòng)性胃炎病人胃黏膜中分 離并培養(yǎng)出幽門(mén)螺桿菌(Helicabucter pylori，H. pylori)，該菌的發(fā)現(xiàn)揭開(kāi)了胃微生物研 究的新時(shí)代。幽門(mén)螺桿菌分布極為廣泛，世界范圍內(nèi)人群感染率高達(dá)50%左右。業(yè)已證實(shí)， 幽門(mén)螺桿菌感染是慢性慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍的主要病因，幽門(mén)螺桿菌的持續(xù)性 感染還與胃腺癌(gastric adenocarcinoma)和胃淋巴瘤(gastric lymphoma)的發(fā)生密切 相關(guān)。1994年，世界衛(wèi)生組織將它定為I類(lèi)致癌因子(Type I carcinogen)。現(xiàn)在針對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染的治療主要是采用兩種抗生素聯(lián)合質(zhì)子泵抑制劑，然 而，這一治療手段有著諸多缺點(diǎn)，如花費(fèi)過(guò)高，患者依從性差和產(chǎn)生藥物抗性菌株的高風(fēng)險(xiǎn) 性等，尤其是抗生素治療不能防止再度感染。所以，現(xiàn)普遍認(rèn)為疫苗是在全球范圍內(nèi)控制幽 門(mén)螺桿菌感染的最有效的方法。早期的幽門(mén)螺桿菌疫苗研究大多應(yīng)用幽門(mén)螺桿菌全菌成 分，存在著效果差、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)。目前幽門(mén)螺桿菌疫苗抗原的研究集中在幽門(mén)螺桿菌 中具有免疫保護(hù)作用的抗原上。目前在小鼠模型上已證實(shí)多種幽門(mén)螺桿菌抗原，包括空泡 毒素(VacA)、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(CagA)、熱休克蛋白A和B (HspA和HspB)、尿素酶和過(guò)氧化 氫酶等。其中尿素酶蛋白被視為最有前途的幽門(mén)螺桿菌疫苗候選，是研究最多的一個(gè)。尿 素酶不僅對(duì)幽門(mén)螺桿菌在胃內(nèi)酸性環(huán)境下定植提供保護(hù)作用，而且是幽門(mén)螺桿菌中的一種 保守蛋白，不同菌株間的保守性達(dá)98%以上。已有大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了它作為疫苗抗原的 安全性和有效性。尿素酶包括尿素酶A(UreA)和B(UreB)兩個(gè)結(jié)構(gòu)亞單位，其中UreB是尿 素酶的主要功能單位，含有尿素酶的活性位點(diǎn)，其保護(hù)性優(yōu)于UreA。疫苗是控制感染性疾病最為經(jīng)濟(jì)有效的辦法，疫苗接種能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生不同于 自然感染導(dǎo)致的特異性免疫應(yīng)答，可以達(dá)到預(yù)防或者治療幽門(mén)螺桿菌感染的目的。目前尿 素酶疫苗預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染已在許多動(dòng)物模型上獲得成功，國(guó)外多個(gè)研究組報(bào)告口服幽 門(mén)螺桿菌尿素酶能防止小鼠感染貓螺桿菌。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)幽門(mén)螺桿菌疫苗的研究主 要是采用模擬自然抗原的方法進(jìn)行蛋白疫苗的研制，單獨(dú)表達(dá)某個(gè)抗原分子或融合表達(dá)幾 個(gè)抗原分子，亦或?qū)⒖乖肿优c粘膜免疫佐劑融合表達(dá)，可部分獲得一定時(shí)期內(nèi)的免疫保 護(hù)作用。目前，表位疫苗已成為研制感染性疾病和惡性腫瘤疫苗的方向，且已在HIV、瘧疾、 乙肝病毒、腫瘤等方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。鑒于此，在表位水平上進(jìn)行選擇和重組來(lái)設(shè)計(jì)疫 苗，可能會(huì)是一種有效的預(yù)防和治療幽門(mén)螺桿菌感染的疫苗形式。利用幽門(mén)螺桿菌保護(hù)性 抗原的表位來(lái)設(shè)計(jì)疫苗，通過(guò)單個(gè)或串連表達(dá)保護(hù)性抗原上的特異性表位，并輔以能有效 誘發(fā)黏膜免疫的佐劑來(lái)激發(fā)機(jī)本更強(qiáng)、更特異的、不同于自然感染時(shí)的免疫應(yīng)答，有可能打 破免疫耐受，從而可以達(dá)到預(yù)防或治療幽門(mén)螺桿菌感染的目的。已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)表明，尿素酶B亞單位(UreB)不僅對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染具有預(yù)防作用，而且還可以在一定程度上清除體內(nèi)已經(jīng)感染的幽門(mén)螺桿菌。研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)UreB不同表 位的單抗可以抑制尿素酶的活性，從而阻斷幽門(mén)螺桿菌的感染，但用完整的尿素酶免疫動(dòng) 物并不能很好的抑制尿素酶的活性，因而不能完全阻止幽門(mén)螺桿菌在胃內(nèi)的定植
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位 (UreB)蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位中和性B細(xì)胞抗原表位多肽，來(lái)源于幽 門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)，名稱(chēng)為UP38，，是如下1)或2)的多肽1)由序列表中序列37所示的氨基酸序列組成的多肽；2)將序列表中序列37的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有幽門(mén)螺桿菌尿素酶抗原表位功能的由1)衍生的多肽。序列表中序列37由15個(gè)氨基酸殘基組成，來(lái)源于幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位 (UreB)上第181-195位氨基酸殘基。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加可為1-10個(gè)氨基酸殘 基的取代和/或缺失和/或添加；所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加可發(fā)生在上述結(jié)構(gòu)域之外。上述表位多肽的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，，所述編碼基因?yàn)?)、2)、3) 或4)1)序列表中序列28的DNA ；2)編碼序列表中序列37的蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。4)與序列表中序列28同源性在80%以上并且編碼幽門(mén)螺桿菌尿素酶抗原表位功 能的多肽的核苷酸。上述嚴(yán)格條件可為用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實(shí)驗(yàn)中65°C下雜交并洗膜。序列表中的序列28由45個(gè)核苷酸組成，自5'端第1至45位核苷酸為編碼序列。本發(fā)明還提供檢測(cè)、預(yù)防或治療幽門(mén)螺桿菌感染的免疫制劑，其活性成分包括上 述表位多肽，如該免疫制劑由上述表位多肽和序列表中序列34所示的表位多肽、序列表中 序列31所示的表位多肽組成多聯(lián)多聚表位疫苗制劑，該免疫制劑的活性成分也可以單獨(dú) 為上述序列表中序列37所示的表位多肽。本發(fā)明還提供抑制尿素酶的活性的藥物，其活性 成分包括上述表位多肽和/或其抗體。如該由上述表位多肽和序列表中序列34所示的表 位多肽、序列表中序列31所示的表位多肽組成的藥物；該藥物活性成分也可以單獨(dú)為上述 表位多肽和/或其抗體；該抗體為體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞系獲得的抗體。本發(fā)明還提供上述幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞基中和性B細(xì)胞抗原表位多肽的篩選方 法，主要包括以下步驟(1)將幽門(mén)螺桿菌的UreB抗原采用截短法分段構(gòu)建并進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，通過(guò) 免疫印跡分析，初步確定單抗A1H10、B3D9、A3C10所針對(duì)的表位范圍；(2)根據(jù)上述步驟(1)所確定的幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所針對(duì)的抗原表位所在區(qū)域，進(jìn)行第二次和第三次的截短分段構(gòu)建UreB抗原，將單抗A1H10、B3D9、A3C10所針對(duì)的抗原表位精確定位在UreB特定的位置；(3)化學(xué)合成上述步驟(2)鑒定出來(lái)的抗原表位，通過(guò)間接ELISA法，以進(jìn)一步確 定抗幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所針對(duì)的抗原表位。本發(fā)明運(yùn)用分子生物學(xué)結(jié)合分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定的方法，篩選得到了由15個(gè)氨 基酸殘基構(gòu)成的表位多肽，經(jīng)濟(jì)、有效，為抗原表位的篩選提供了參考。本發(fā)明為新型的多 聯(lián)多聚表位疫苗的開(kāi)發(fā)尊定了基礎(chǔ)，也為基于蛋白表位的病原生物診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)及治 療制劑的研制帶來(lái)新的思路。獲得的抗原表位對(duì)H. pylori發(fā)病機(jī)制的研究具有重要的意 義，有助于更有效的預(yù)防和控制幽門(mén)螺桿菌的感染。本發(fā)明提供的抗原表位多肽具有良好的免疫原性，在小鼠動(dòng)物模型中可以誘導(dǎo)產(chǎn) 生針對(duì)此B細(xì)胞表位的特異性體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的抗血清不僅能夠中和尿素酶的活性， 而且還能與H. pylori天然菌株的尿素酶發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)。同時(shí)采用血清學(xué)分析 方法證實(shí)臨床感染幽門(mén)螺桿菌患者血清中產(chǎn)生了針對(duì)該UreB抗原表位的抗體。本發(fā)明提供的抗原表位多肽激發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體可抑制尿素酶活性，為尿素 酶抗原表位的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的抗原表位多肽能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗幽門(mén) 螺桿菌保護(hù)性免疫反應(yīng)，并可以避免產(chǎn)生構(gòu)象表位特異性抗體，從而增強(qiáng)對(duì)幽門(mén)螺桿菌感 染的抑制和清除效果，對(duì)相應(yīng)疫苗的研發(fā)、致病機(jī)理的研究以及臨床診斷中起到很好的推 動(dòng)作用。本發(fā)明的激發(fā)機(jī)體抗H. pylori的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原表位在體外檢測(cè)和產(chǎn)生 免疫保護(hù)上的具有很有價(jià)值的應(yīng)用。


圖1不同截短UreB片段相對(duì)應(yīng)的位置圖(數(shù)字表示在UreB中所對(duì)應(yīng)的位置，白 色條表示與單克隆抗體A1H10、B3D9或A3C10 western blot反應(yīng)為陰性，灰色條表示與單 克隆抗體A1H10、B3D9或A3C10western blot反應(yīng)為陽(yáng)性)圖2幽門(mén)螺桿菌(H. pylori)尿素酶B亞單位各截短抗原PCR擴(kuò)增結(jié)果；其中，A 泳道1為核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2為目的基因UPl的PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物(400bp)；泳道3為目的基因UP2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(430bp)；泳道4為目的基因UP3的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(450bp)；泳道5為目的基因UP4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(660bp)；B 泳道1為核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2為目的基因U21的PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物(IOObp)；泳道3為目的基因U22的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(85bp)；泳道4為目的基因U23的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(IOObp)；泳道5為目的基因U24的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(115bp)；泳道6為目的基 因U25的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(115bp)；泳道7為目的基因U26的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(IOObp)。 C 泳道1為核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2為目的基因GST-UP32的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(60bp)；泳道3為目的基因GST-UP33的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(60bp)；泳道4為目的基因 GST-UP34的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(60bp)；泳道5為目的基因GST-UP36的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(60bp)； 泳道6為目的基因GST-UP38的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(60bp)；泳道7為目的基因GST-UP39的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(60bp) D 泳道1為核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2為目的基因GST-UP31的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(330bp)；泳道3為目的基因GST-UP35的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(330bp)；泳道4為目的基因GST-UP37的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(330bp)；結(jié)果表明各目的基因的PCR克隆擴(kuò)增效果良好。
圖3為幽門(mén)螺桿菌(H. pylori)尿素酶B亞單位各截短抗原基因重組菌TPTG誘導(dǎo) 表達(dá)SDS-PAGE電泳圖；其中，A 泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2為空載體菌誘導(dǎo)4h ；泳道3為表 達(dá)UPl基因的重組菌誘導(dǎo)4h ；泳道4為表達(dá)UP2基因重組菌誘導(dǎo)4h ；泳道5為表達(dá)UP3基 因重組菌誘導(dǎo)4h ；泳道6為表達(dá)UP4基因重組菌誘導(dǎo)4h ；B 泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2為宿主菌誘導(dǎo)4h ；泳道3為空載 體菌誘導(dǎo)4h ；泳道4為基因重組菌UP21誘導(dǎo)4h ；泳道5為基因重組菌UP22誘導(dǎo)4h ；泳道6 為基因重組菌UP23誘導(dǎo)4h ；泳道7為基因重組菌UP24誘導(dǎo)4h ；泳道8為基因重組菌UP25 誘導(dǎo)4h ；泳道9為基因重組菌UP26誘導(dǎo)4h ；C 泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2為宿主菌誘導(dǎo)4h ；泳道3為空載 體菌誘導(dǎo)4h ；泳道4為基因重組菌GST-UP32誘導(dǎo)4h ；泳道5為基因重組菌GST-UP33誘導(dǎo) 4h ；泳道6為基因重組菌GST-UP34誘導(dǎo)4h ；泳道7為基因重組菌GST-UP36誘導(dǎo)4h ；泳道8 為基因重組菌GST-UP38誘導(dǎo)4h ；泳道9、10為基因重組菌GST-UP39誘導(dǎo)4h ；D 泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2為宿主菌誘導(dǎo)4h ；泳道3為空載 體菌誘導(dǎo)4h ；泳道4為基因重組菌GST-UP31誘導(dǎo)4h ；泳道5為基因重組菌GST-UP35誘導(dǎo) 4h ；泳道6為基因重組菌GST-UP37誘導(dǎo)4h圖4為截短的UreB片段與單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10免疫印跡圖；其中，A第 一次分段表達(dá)的截短抗原(UP1、UP2、UP3和UP4)與單克隆抗體A1H10、B3D9或A3C10免疫 印跡分析；(1)UP1、UP2、UP3和UP4與單克隆抗體AlHlO的免疫印跡結(jié)果；(2)UP1、UP2、UP3 和UP4與單克隆抗體B3D9的免疫印跡結(jié)果；(3)UP1、UP2、UP3和UP4與單克隆抗體A3C10 的免疫印跡結(jié)果；B為第二次分段表達(dá)的截短抗原(UP21、UP22、UP23、UP24、UP25和UP26)與單克 隆抗體 A1H10、B3D9 或 A3C10 免疫印跡分析；(1)UP21、UP22、UP23、UP24、UP25 和 UP26 與單 克隆抗體AlHlO的免疫印跡結(jié)果；(2)UP21、UP22、UP23、UP24、UP25和UP26與單克隆抗體 B3D9的免疫印跡結(jié)果；(3)UP21、UP22、UP23、UP24、UP25* UP26與單克隆抗體A3C10的免 疫印跡結(jié)果；C 為第三次分段表達(dá)的截短抗原(GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33，GST-UP34、 GST-UP35、GST-UP36，GST-UP37、GST-UP38 和 GST-UP39)與單克隆抗體 A1H10、B3D9 或 A3C10 免疫印跡分析；(1)GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33與單克隆抗體AlHlO的免疫印跡結(jié)果； (2)GST-UP34、GST-UP35、GST-UP36 與單克隆抗體 B3D9 的免疫印跡結(jié)果；(3)GST-UP37、 GST-UP38、GST-UP39與單克隆抗體A3C10的免疫印跡結(jié)果圖 5 為融合表位月太 GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38 分別與 AlHlO、B3D9、A3C10 間 接ELISA分析。圖6為單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10對(duì)合成表位肽的識(shí)別的間接ILISA分析圖7為表位肽對(duì)H. pylori病人血清的識(shí)別。A :H. pylori 病人血清與融合表位 GST_UP32、GST_UP35 和 GST-UP38 的 ELISA 反應(yīng)； B :H. pylori病人血清與合成表位肽UP32、UP35和UP38的ELISA反應(yīng)。圖8為鼠抗融合表位肽血清對(duì)融合表位肽、合成肽、不同天然H. pylori菌株尿素酶B亞單位蛋白的識(shí)別；A抗表位血清與對(duì)應(yīng)融合肽的Western blot分析；B抗表位血清與 對(duì)應(yīng)合成肽的ELISA反應(yīng)；C抗表位血清與天然H. pylori菌株尿素酶B亞單位蛋白ELISA 反應(yīng)。圖9為單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10及抗融合表位多抗抑制幽門(mén)螺桿菌尿素酶
活性實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、抗幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10抗原識(shí)別 表位的鑒定通過(guò)多次截短分段表達(dá)尿素酶B片段篩選抗原表位，各次截?cái)嗥卧谟拈T(mén)螺桿菌 尿素酶B亞單位的位置關(guān)系如圖1所示。一、UreB截短蛋白的第一次分段表達(dá)及抗原表位的初步鑒定1、截短的幽門(mén)螺桿菌UreB分段抗原UPl (序列5)、UP2 (序列6)、UP3 (序列7)、 UP4(序列8)的重組表達(dá)1)幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori)的培養(yǎng)幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori) 26695 (ATCC No. 700392)采用固體培養(yǎng)，培養(yǎng) 基為空腸彎曲菌瓊脂基質(zhì)(中國(guó)腹瀉病控制上海試劑供應(yīng)研究中心)43g/L、脫纖維羊血 (由市場(chǎng)采購(gòu)活羊經(jīng)頸動(dòng)脈取血后用玻璃珠脫纖維處理后即得)50ml/L、抗菌素多粘菌素 B (購(gòu)自Merck) 0. 38mg/L、萬(wàn)古霉素(購(gòu)自Amresco) 10mg/L和兩性霉素B (購(gòu)自Sigma) 5mg/ L。37°C微需氧環(huán)境(5% O2,10% CO2,85% N2)中培養(yǎng)48_72hr，改良布氏肉湯收集菌體。2)幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori)基因組DNA的制備幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori) 26695基因組DNA提取按照promega公司細(xì) 菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3)引物序列設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank已公布的H. pylori國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株26695的基因組序列找到UreB的基 因序列(gi :21637177)，利用Primerf. 0軟件設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，在上游和下游引物 中分別加入SacI和Hind III酶切位點(diǎn)(下劃線示酶切位點(diǎn))，它們的序列如下所示擴(kuò)增UPl的編碼基因(序列表中序列1)的引物UP1-F CGAGCTCAAAAAGATTAGCAGAAAAG ；UPl-R CCCAAGCTTTTAAGCAGTTACGATC。擴(kuò)增UP2的編碼基因(序列表中序列2)的引物UP2-F CGAGCTCAATCTTAGCGTAGGTCC ；UP2-R CCCAAGCTTTTAGTCTGTGTGGATAG。擴(kuò)增UP3的編碼基因(序列表中序列3)的引物UP3-F CGAGCTCATCAATCATGCGTTAG ；UP3-R CCCAAGCTTTTACCAAGTTCTAGTGATA。擴(kuò)增UP4的編碼基因(序列表中序列4)的引物UP4-F :GAGCTCATTTTCTCAATCACCAG ；UP4-R CCCAAGCTTGAAAATGCTAAAGAGTT。4) PCR擴(kuò)增目的基因以幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori) 26695株基因組DNA為模板，加入相應(yīng)引物，經(jīng)過(guò)30個(gè)PCR循環(huán)擴(kuò)增得到UreB分段片段UPl (編碼基因具有序列表中序列1的核苷酸序列)、UP2 (編碼基因有序列表中序列2的核苷酸序列)、UP3 (編碼基因具有序列表中 序列3的核苷酸序列)、UP4(編碼基因具有序列表中序列4的核苷酸序列)的編碼基因，經(jīng) 1.0%瓊脂糖電泳顯示，各目的片段與擴(kuò)增基因的理論大小一致。各段目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2中A所示，表明目的基因UP1、UP2、UP3、UP4 編碼基因的PCR克隆擴(kuò)增效果較好，分別擴(kuò)增出了約400bp、430bp、450bp、660bp大小的目 的片段，經(jīng)測(cè)序表明序列正確。2、分段抗原UP1、UP2、UP3、UP4表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)將步驟1擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物UP1、UP2、UP3、UP4編碼基因純化后分別用SacI 和Hind III雙酶切與經(jīng)同樣酶雙酶切的質(zhì)粒pET-28a(+)(購(gòu)自Merck)連接后轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α (購(gòu)自天根生化)，在終濃度為50 μ g/ml卡那霉素抗性的培養(yǎng)基篩選后進(jìn)行酶切和 測(cè)序鑒定，將酶切和測(cè)序鑒定表明正確的重組載體命名為pET-UPl、pET-UP2、pET_UP3、 PET-UP4。提取重組質(zhì)粒pET-UPl、pET-UP2、pET-UP3、pET-UP4并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (購(gòu)自 天根生化)株，在終濃度為50 μ g/ml卡那霉素抗性的培養(yǎng)基篩選后，質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得 到鑒定無(wú)誤的表達(dá)UP1、UP2、UP3或UP4的重組菌。取鑒定無(wú)誤的重組菌接種于5ml含卡 那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。次日，將過(guò)夜培養(yǎng)的重組菌按1 100的比例 轉(zhuǎn)種于5ml含卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)液中，37°C，200rpm培養(yǎng)至OD6tltl值約為0. 6時(shí)加入 IPTG至終濃度1. OmM,誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，取Iml培養(yǎng)物，離心收集菌體，用80 μ 1 PBS (0. 01mol/L, pH7. 4)重懸，加入20 μ 1 5倍SDS-PAGE上樣緩沖液(1L溶液中含15. Ig Tris堿，94g甘氨 酸，5gSDS)，混均后沸水中煮5分鐘，離心收上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。同時(shí)，以轉(zhuǎn)pET_28a (+) 的大腸桿菌BL21重組菌為對(duì)照。SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況，篩選高效表達(dá)菌株。誘導(dǎo)表達(dá)鑒定結(jié)果如圖3中A所示，結(jié)果顯示UPl在相對(duì)分子質(zhì)量約18kD、UP2在 相對(duì)分子質(zhì)量約20kD、UP3在相對(duì)分子質(zhì)量約21kD、UP4在相對(duì)分子質(zhì)量約28kD處有的特 異蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期的融合蛋白大小一致。3, Western blot鑒定A1H10、B3D9、A3C10單克隆抗體識(shí)別的表位所在區(qū)域Western blot具體操作步驟如下按照步驟2的方法，分別培養(yǎng)表達(dá)UP1、UP2、UP3或UP4的重組菌，制備蛋白電泳樣 品，進(jìn)行15%的SDS-PAGE電泳。電泳完畢，50V電壓濕轉(zhuǎn)4h至NC膜上。加入含5%脫脂奶 粉的PBST室溫封閉2h，PBST洗3次，每次5min。分別加入1 5000稀釋的三株小鼠抗UreB 單抗B3D9(生物技術(shù)通訊，2007 ；18(2) :246_8，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程 研究所在專(zhuān)利保護(hù)期限內(nèi)提供)、A1H10 (生物技術(shù)通訊，2007 ；18(2) :246_8，中國(guó)人民解放 軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所在專(zhuān)利保護(hù)期限內(nèi)提供)、A3C10 (生物技術(shù)通訊，2007 ； 18(2) :246-8，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所在專(zhuān)利保護(hù)期限內(nèi)提供)， 室溫放置lh，PBST洗3次。加入1 50000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(Sigma)，室溫 放置Ih，PBST洗3次。DAB顯色。Western blot結(jié)果見(jiàn)圖4中A，免疫印跡結(jié)果顯示重組UP2蛋白與小鼠抗UreB單 抗AlHlO和B3D9發(fā)生了抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，重組UP3和UP4蛋白與小鼠抗UreB單 抗A3C10發(fā)生了抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，說(shuō)明了單克隆抗體AlHlO和B3D9所針對(duì)的抗原 表位位于UreB蛋白UP2內(nèi)，單克隆抗體A3C10所針對(duì)的抗原表位位于UP3和UP4疊加的位置。
為了將三株單抗識(shí)別UreB各段的抗原表位限定到比校小的范圍內(nèi)，我們又將第 一次表達(dá)能被這三株單抗識(shí)別的段進(jìn)行第二次的表達(dá)及鑒定。二、UreB截短蛋白的第二次分段表達(dá)及抗原表位的進(jìn)一步鑒定UreB截短蛋白的第二次分段表達(dá)及抗原表位的進(jìn)一步鑒定所用的方法與第一次 分段表達(dá)鑒定的方法類(lèi)似，所用的表達(dá)載體為PGEX-4T-2 (購(gòu)自Amersham)。第二次分段分成六段UreB截短蛋白UP21 (序列表中序列15)、UP22 (序列表中 序列16)、UP23 (序列表中序列17)、UP24 (序列表中序列18)、UP25 (序列表中序列19)禾口 UP26 (序列表中序列20)，表達(dá)UP21、UP22、UP23、UP24、UP25、UP26的各編碼基因引物表如 下，在上游和下游引物中分別加入EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)，下劃線示酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增UP21編碼基因(序列表中序列9)的引物對(duì)UP21F CCGGAATTCTAGATGGCGTTAAAAA ；UP21R CCGCTCGAGTCATGTGTCAATACCA。擴(kuò)增UP22編碼基因(序列表中序列10)的引物對(duì)UP22F CCGGAATTCTCGGTGGTATTGACA ；UP22R CCGCTCGAGTTAGGTTGTTACACCGCTT。擴(kuò)增UP23編碼基因(序列表中序列11)的引物對(duì)UP23F CCGGAATTCTAAGCGGTGTAACAAC ；UP23R CCGCTCGAGTTATTTTAAATTTCTTCTG。擴(kuò)增UP24編碼基因(序列表中序列12)的引物對(duì)UP24F CCGGAATTCTAACTATCACTCCAGGCA ；UP24R CCGCTCGAGTTACGCGTCGTTAGAAG。擴(kuò)增UP25編碼基因(序列表中序列13)的引物對(duì)UP25F CCGGAATTCTAGCTTCTAACGACGCG ；UP25R CCGCTCGAGTTATAACGCATGATTGATT。擴(kuò)增UP26編碼基因(序列表中序列14)的引物對(duì)UP26F CGGAATTCTACCTCAAACCATTGCGGC ；UP26R CCGCTCGAGTTAACCCACACGACCCATAG。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2B所示，分別擴(kuò)增出UP21、UP22、UP23、UP24、UP25、UP26編碼 基因，它們的大小約1 OObp、85bp、1 OObp、115bp、115bp、1 OObp大小的目的片段。按照步驟一中的步驟2的方法分別構(gòu)建表達(dá)UP21、UP22、UP23、UP24、UP25或UP26 的重組載體，只是將出發(fā)載體由PGEX-4T-2替換pET-28a(+)。鑒定表明正確的重組載體命 名為 PGEX-UP21、PGEX-UP22、PGEX-UP23、PGEX-UP24、PGEX-UP25、PGEX-UP26。按照步驟一 的步驟2所述的方法誘導(dǎo)表達(dá)UP21、UP22、UP23、UP24、UP25或UP26蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況，篩選高效表達(dá)菌株。蛋白誘導(dǎo)表達(dá)鑒定結(jié)果如圖3中B所示，表明基因重組菌經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后，在約 28KDa 29KDa處有增加的蛋白表達(dá)條帶，與目的蛋白分子量大小一致。參照步驟一的步驟3的方法進(jìn)行UP21、UP22、UP23、UP24、UP25或UP26蛋白 Western blot檢測(cè)，Western blot結(jié)果如圖4中B所示，重組UP23蛋白能被小鼠抗UreB 單抗AlHlO識(shí)別，UP24蛋白能被小鼠抗UreB單抗B3D9識(shí)別，UP26蛋白能被小鼠抗UreB單 抗A3C10識(shí)別，出現(xiàn)特異性的反應(yīng)條帶，表明單克隆抗體AlHlO所針對(duì)的抗原表位位于UreB 蛋白UP23內(nèi)，單克隆抗體B3D9所針對(duì)的抗原表位位于UP24內(nèi)，單克隆抗體A3C10所針對(duì) 的抗原表位位于UP26內(nèi)。為了將三株單抗識(shí)別UreB各段的抗原表位精確定位到更小的范圍，同樣將第二次鑒定為陽(yáng)性的片段進(jìn)行更小的分段鑒定。三、UreB截短蛋白的第三次分段表達(dá)及抗原表位的精確定位 第三次分段分成九段UreB截短蛋白，表達(dá)引物表如下，在GST-UP32 (UP32序列為 序列表中序列31)、GST-UP33 (UP33序列為序列表中序列32)、GST-UP34 (UP34序列為序列 表中序列33)、GST-UP36 (UP36序列為序列表中序列35)、GST-UP38 (UP38序列為序列表中 序列37)、GST-UP39 (UP39序列為序列表中序列38)上游和下游引物中分別加入EcoR I和 Xho I酶切位點(diǎn)，在GST-UP31 (UP31序列為序列表中序列30)、GST_UP35 (UP35序列為序列表 中序列34)、GST-UP37 (UP37序列為序列表中序列36)上游和下游引物中分別加入BstB I 和Xho I酶切位點(diǎn)(下劃線示酶切位點(diǎn))擴(kuò)增GST-UP31編碼基因(UP31編碼基因序列為序列表中序列21)的引物對(duì) GST-UP31F GAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCA ；GST-UP31R CCGCTCGAGATCAGCAGGACCAGTTCCGCCACCAATCATGGTTGTTACACCGCTACGCGGAACCAGATC。擴(kuò)增GST-UP32編碼基因(UP32編碼基因序列為序列表中序列22)的引物對(duì) GST-UP32F CGGAATTCTAGGTGGCGGAACTGGTCCTGCTGATGGC ；GST-UP32R CCGCTCGAGTCAGATAGTAGTCGCATTAGTGCCATCAGCAGGAC。擴(kuò)增GST-UP33編碼基因(UP33編碼基因序列為序列表中序列23)的引物對(duì) GST-UP33F CCGGAATTCTCGGCACTAATGCGACTACTATCACTCCAGGC ；GST-UP33R CCGCTCGAGCTATTTTAAATTTCTTCTGCCTGGAGTGAT。擴(kuò)增GST-UP34編碼基因(UP34編碼基因序列為序列表中序列24)的引物對(duì) GST-UP34F CCGGAATTCTGACTATCACTCCAGGCAGAAGAAATTTAAAA ；GST-UP34R CCGCTCGAGTTACGCTCTGAGCATCCATTTTAAATTTCT。擴(kuò)增GST-UP35編碼基因(UP35編碼基因序列為序列表中序列25)的引物對(duì) GST-UP35F GAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCA ；GST-UP35R CCGCTCGAGGAAACCTAAGTTCATAGAATATTCTTCAGCCGCTCTGAGCATCCAACGCGGAACCAGATC。擴(kuò)增GST-UP36編碼基因(UP36編碼基因序列為序列表中序列26)的引物對(duì) GST-UP36F CGGAATTCTAATGAACTTAGGTTTCTTGGCTAAAGGTAACGC ；GST-UP36R CCGCTCGAGTTACGCGTCGTTAGAAGCGTTACCTTTA。擴(kuò)增GST-UP37編碼基因(UP37編碼基因序列為序列表中序列27)的引物對(duì) GST-UP37F GAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCA ；GST-UP37R CCGCTCGAGCCCCATGTCATGCAAAGTGTCTTCAGCCGCAATGGTTTGAGGACGCGGAA
CCAGATC。 擴(kuò)增GST-UP38編碼基因(UP38編碼基因序列為序列表中序列28)的引物對(duì) GST-UP38F CGGGAATTCTAACTTTGCATGACATGGGGATTTTCTCAATCAC ；GST-UP38R CCGCTCGAGTTAAGAGTCAGAGCTGGTGATTGAGAAAATCC。擴(kuò)增GST-UP39編碼基因(UP39編碼基因序列為序列表中序列29)的引物對(duì) GST-UP39F GGAATTCTAATTTTCTCAATCACCAGCTCTGACTCTCAAGCTATGGG ；GST-UP39R CCGCTCGAGTTAACCCACACGACCCATAGCTTGA。GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、GST-UP36、GST-UP38、GST-UP39 以兩個(gè)長(zhǎng)引物直 接退火合成，GST-UP31、GST-UP35、GST-UP37以PGEX-4T-2為模板，用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增得 到。PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖 2C、2D 所示，擴(kuò)增出了 GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、 GST-UP36、GST-UP38、GST-UP39的編碼基因約60bp大小的特異性目的片段，擴(kuò)增得到 GST-UP31、GST-UP35、GST-UP37的編碼基因?yàn)榧s330bp大小的特異性目的片段。按照步驟一中的步驟2的方法分別構(gòu)建表達(dá)GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33、 GST-UP34、GST-UP35、GST-UP36、GST-UP37、GST-UP38、GST-UP39 的重組載體，只是將出發(fā)載 體由PGEX-4T-2替換pET-28a (+)。鑒定表明正確的重組載體命名為PGEX-UP31、PGEX-UP32、 PGEX-UP33、PGEX-UP34、PGEX-UP35、PGEX-UP36、PGEX-UP37、PGEX-UP38、PGEX-UP39。按 照步驟一的步驟2所述的方法構(gòu)建表達(dá)GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、 GST-UP35、GST-UP36、GST-UP37、GST-UP38、GST-UP39目的蛋白的大腸桿菌工程菌，并誘導(dǎo) 表達(dá) GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、GST-UP35、GST-UP36、GST-UP37、GST-UP38、 GST-UP39并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況，篩選高效表達(dá)菌株。蛋白誘導(dǎo)表達(dá)鑒定結(jié)果如圖3中C、圖3中D所示，表明基因重組菌經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后，在 約27KDa 28KDa處有增加的蛋白表達(dá)條帶，與目的蛋白分子量大小一致。參照步驟一的步驟3 的方法對(duì) GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、 GST-UP35、GST-UP36、GST-UP37、GST-UP38、GST-UP39進(jìn)行Western blot檢測(cè)，Western blot 結(jié)果如圖4中C所示，結(jié)果顯示重組GST-UP32蛋白與單抗AlHlO發(fā)生了特異性結(jié)合反應(yīng)， GST-UP35蛋白與單抗B3D9發(fā)生了特異性結(jié)合反應(yīng)，GST-UP38蛋白與單抗A3C10發(fā)生了特 異性結(jié)合反應(yīng)，表明單克隆抗體AlHlO說(shuō)明單抗所對(duì)應(yīng)表位為GST-UP32，單克隆抗體B3D9 所對(duì)應(yīng)表位為GST-UP35，單克隆抗體A3C10所對(duì)應(yīng)表位為GST-UP38。四、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法確定單抗A1H10、B3D9、A3C10的表位同時(shí)，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法確定單抗A1H10、B3D9、A3C10的表位，將 通過(guò)GSTrap 4B親和柱純化的融合表位蛋白GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38分別包被ELISA 板，以檢測(cè)單抗A1H10、B3D9、A3C10所針對(duì)的表位。具體操作步驟如下1、重組蛋白樣品準(zhǔn)備將上述構(gòu)建的表達(dá)GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38目的蛋白的大腸桿菌工程菌于 含有相應(yīng)抗生素的LB平板上劃線，37°C活化16-20h ；挑單克隆接種于5ml LB培養(yǎng)基中， 37°C搖菌過(guò)夜；次日，以1 100(重量比)接種量轉(zhuǎn)接到新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C搖菌至0D600 1. 0，加入IPTG (終濃度ImM)誘導(dǎo)培養(yǎng)3_4h ；收集菌體，每升菌液約以50mL預(yù)冷的 STE(10mM Tris HCl pH8.0、150m M NaClUmM EDTA, pH 8.0)的溶液重懸；超聲破碎菌 體，15000g, IOmin離心收集上清，通過(guò)GSTrap 4B親和柱純化融合表位蛋白，具體是在上清 中加入適量Triton x-100至終濃度為l%，h) 0.45 μ m濾膜注射器過(guò)濾，上清4°C保存?zhèn)溆茫?在8mL上清中加入 ImL用預(yù)冷 IX PBS(140mM NaCl, 2. 7mM KCl，10mMNa2HP04，1. 8mM KH2P04, PH 7.3)洗滌過(guò)的GST樹(shù)脂，輕輕晃動(dòng)令其吸附蛋白0.5h。將含有GST融合蛋白的溶液注 入已平衡好的層析柱中，當(dāng)含有融合蛋白的溶液全部進(jìn)入柱中時(shí)，以30倍體積的預(yù)冷PBS 洗滌，加入ImL新鮮配制的15mM的谷胱甘肽洗脫液(IOmM的谷胱甘肽、50mM的Tris-HCl中 PH8. 0)，輕輕懸起后靜置lOmin，收集洗脫液，重復(fù)洗脫兩次；分別取等量的含有GST融合蛋 白(PGEX-4T-2表達(dá)蛋白純化)的流出液，洗滌液和洗脫的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE以分析 目的蛋白；收集含有目的蛋白的洗脫部分；然后通過(guò)PBS透析或去除游離的谷胱甘肽，樣品 進(jìn)行SDS-PAGE后采集凝膠照片，用BandScan5. 0軟件進(jìn)行分析，檢測(cè)表面純化得到的融合 蛋白純度為90%以上。2、用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法確定單抗A1H10、B3D9、A3C10的表位1)抗原包被用包被液分別將抗原(步驟1獲得的蛋白)稀釋為3 μ g/mL的混懸 液，加入ELISA板，IOOul/孔，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照(即純化的GST融合蛋白)，4°C包被過(guò)夜；2)洗滌用洗滌液PBST洗滌ELISA板各孔3次，每次5分鐘，浙干；3)封閉每孔加入含5%脫脂奶粉的PBST溶液各200 μ L，置37°C孵育2h ；4)加入用保溫液(含0.5%脫脂奶粉的PBST溶液)適當(dāng)稀釋(1 400-1 1000 倍)的單克隆抗體々1!110、830943(10，10(^1/孔，每個(gè)稀釋度各加兩孔。置37°C孵育2h， 洗滌同步驟2)；5)加入酶結(jié)合物(二抗)用保溫液將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠二抗適當(dāng)稀 釋(1 50000)加入反應(yīng)孔，每孔100 μ L。置37°C孵育lh，洗滌同步驟(2)；6)顯色加入顯色底物溶液，每孔100 μ L，室溫避光顯色5-lOmin ；7)終止反應(yīng)加入終止液2M/L H2SO4,每孔50 μ L ；8)測(cè)定OD值用酶聯(lián)檢測(cè)儀于492nm波長(zhǎng)測(cè)定各反應(yīng)孔的OD值，記錄結(jié)果；9)結(jié)果判斷以純化的GST OD492平均值作為陰性對(duì)照，融合表位蛋白OD492彡2. 1 倍陰性對(duì)照值(P/N ^ 2. 1)視為單抗所針對(duì)的抗原表位。上述反應(yīng)結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，如圖5所示，表明單克隆抗體A1H10、 B3D9、A3C10與融合表位蛋白GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38發(fā)生了特異性結(jié)合反應(yīng)，說(shuō)明 單克隆抗體 A1H10、B3D9、A3C10 所對(duì)應(yīng)的表位分別為 GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38。實(shí)施例2、合成表位多肽以進(jìn)一步確證單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所針對(duì)的抗 原表位1、表位肽的合成針對(duì)實(shí)施例1中所確定的單抗識(shí)別表位，采用化學(xué)合成法合成表位多肽(送北京 中科亞光生物有限公司合成)，分別命名為UP32(氨基酸序列為序列表中序列31)、UP35(氨 基酸序列為序列表中序列34)、UP38(氨基酸序列為序列表中序列37)純度為90%以上，合 成量為4mg。2、ELISA方法確定單抗A1H10、B3D9、A3C10所針對(duì)的抗原表位
將合成的3條表位多肽UP32、UP35、UP38 (10 μ g/ml)分別包被ELISA板(IOOul/ 孔)，以檢測(cè)A1H10、B3D9、A3C10單抗所針對(duì)的表位。具體操作步驟同實(shí)施例1的步驟四。
反應(yīng)結(jié)果如圖6所示，表明單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10與融合表位蛋白 GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38發(fā)生了特異性結(jié)合反應(yīng)，說(shuō)明單克隆抗體A1H10、B3D9、 A3C10所對(duì)應(yīng)的表位分別為UP32、UP35、UP38。實(shí)施例3、融合表位肽和合成表位肽與病人血清的識(shí)別實(shí)驗(yàn)為了檢測(cè)臨床感染H. pylori病人血清中是否產(chǎn)生針對(duì)本發(fā)明鑒定出的抗原 表位的特異性抗體，我們將實(shí)施例1制備的融合表位肽(3yg/ml)GST-UP32、GST-UP35、 GST-UP38及實(shí)施例2合成的表位肽(10μ g/ml)UP32、UP35、UP38分別包被ELISA板(IOOul/ 孔)，以本實(shí)驗(yàn)室收集并用S001幽門(mén)螺桿菌尿素酶檢測(cè)試劑盒(膠體金法，北京康美天鴻生 物技術(shù)有限公司)鑒定為UreB陽(yáng)性的病人血清3份和2份正常人血清作為一抗(1 100) 進(jìn)行ELISA分析，具體操作步驟同實(shí)施例1的步驟四。反應(yīng)結(jié)果如圖7所示，融合表位蛋白和合成表位肽均與3份幽門(mén)螺桿菌感染患者 血清發(fā)生了陽(yáng)性反應(yīng)，與2份正常人血清均不發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明幽門(mén)螺桿菌感染病人中產(chǎn)生 了針對(duì)本發(fā)明表位肽的抗體，這為多價(jià)表位疫苗和診斷試劑的研制提供了新的思路。實(shí)施例4、表位抗原的多克隆抗血清對(duì)合成肽和天然UreB蛋白的識(shí)別1、鼠抗血清的制備1)動(dòng)物免疫選取6-8周齡的SPF級(jí)雌性BALB/C小鼠，于背部皮下多點(diǎn)注射實(shí)施例1中所 純化的融合表位蛋白GST-UP32、GST-UP35及GST-UP38進(jìn)行免疫，3次免疫抗原劑量均為 100μ g/只。首次免疫時(shí)將抗原加等量完全弗氏佐劑(CFA)充分混合乳化后皮下多點(diǎn)注射， 每隔2周再以抗原加等量不完全弗氏佐劑(IFA)乳化后加強(qiáng)免疫兩次。同時(shí)設(shè)立只注射 PBS緩沖液(pH7. 0，50mmol/L)和GST蛋白免疫組作為對(duì)照免疫組，免疫程序相同，每組5只 小鼠。3次免疫后10天耳緣靜脈采血，檢測(cè)抗血清效價(jià)，達(dá)到較理想的滴度后，于免疫程序 結(jié)束后14天，取血并收集免疫后多克隆抗血清。2)間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)對(duì)抗體效價(jià)的檢測(cè)采用間接ELISA法進(jìn)行。用純化的GST-UP32、GST-UP35、 GST-UP38融合蛋白以包被液稀釋至3 μ g/ml，包被于酶標(biāo)板中，每孔100μ 1，4°C包被過(guò) 夜。次日加入不同稀釋度待檢抗血清，以1 100稀釋的正常小鼠血清為對(duì)照，二抗為 1 50000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，顯色底物為鄰苯二胺(OPD)，顯色結(jié)果用酶標(biāo)儀在波 長(zhǎng)490nm處進(jìn)行測(cè)定，P/N大于2. 1為陽(yáng)性。結(jié)果顯示，三次免疫后，各實(shí)驗(yàn)組的抗體效價(jià)可達(dá)1 25600-1 51200，而PBS對(duì) 照組基本不與任何一個(gè)融合表位反應(yīng)，說(shuō)明本發(fā)明構(gòu)建融合表位蛋白能夠很好地激發(fā)機(jī)體 的體液免疫應(yīng)答。2、ELISA法檢測(cè)多克隆抗血清與不同表位合成肽和天然UreB蛋白的識(shí)別1)蛋白樣品的準(zhǔn)備(1)幽門(mén)螺桿菌的培養(yǎng)幽門(mén)螺桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC I 1637(購(gòu)自英國(guó)的國(guó)立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所 (NCTC))、幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori) 26695的培養(yǎng)同實(shí)施例1的步驟1中的步驟1)。(2)幽門(mén)螺桿菌NCTC I 1637、26695全菌蛋白樣品的制備 用肉湯從幽門(mén)螺桿菌固體培養(yǎng)板上刮下幽門(mén)螺桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC I 1637或 幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori) 26695菌體，4°C，5000g離心IOmin收集菌體，用預(yù)冷 的低鹽PBS緩沖液(ρΗ7· 0，50mmol/L)洗3次，每次均為4°C，5000g離心IOmin,最后用低 鹽PBS(pH7.0，50mmol/L)重懸。冰浴超聲lOmin，使細(xì)胞徹底破碎。然后將溶液室溫放置 0.5h，充分溶解蛋白質(zhì)，SOOOg離心20min去掉不溶物。收集上清，即為全菌蛋白溶液。2)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多克隆抗血清與不同表位合成肽天然UreB蛋白的識(shí)別將實(shí)施例2合成的表位肽UP32、UP35、UP38及幽門(mén)螺桿菌NCTC I 1637,26695 全菌蛋白樣品以lOOOng/lOOul/孔的量包被ELISA板。一抗為融合蛋白免疫的鼠抗血清 (1 100)，具體實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1。反應(yīng)結(jié)果如圖8A、8B所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫的鼠抗血清能夠很好地識(shí)別相應(yīng)的表 位合成肽，同時(shí)也能與天然的UreB發(fā)生反應(yīng)。3、多克隆抗血清與天然UreB蛋白的western blot分析將上述準(zhǔn)備好的幽門(mén)螺桿菌26695全菌蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，然后與 實(shí)施例1中所純化的融合表位蛋白GST-UP32、GST-UP35及GST-UP38免疫小鼠后抗血清 進(jìn)行免疫印跡分析，以純化的融合表位蛋白及截短的UreB蛋白UreBM(是UreB蛋白上第 106-377位的多肽，按照實(shí)施例1的方法表達(dá)純化，其編碼基因的擴(kuò)增引物為F CGAGCTCAATCTTAGCGTAGGTCC(SacI) ；R CCCAAGCTTCCAAGTTCTAGTGATAA(Hind HL)；利用該引物，以幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori) 26695基因組為模板，擴(kuò)出目標(biāo)基 因片段，再插入pET28a (+)載體的SacI和Hind III酶切位點(diǎn)之間構(gòu)建得到重組載體，將重組 載體轉(zhuǎn)化BL21后表達(dá)，純化就可以得到用于陽(yáng)性對(duì)照的UreBM)作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)以BSA 作為陰性對(duì)照，抗血清按1 200倍稀釋其余具體操作步驟同實(shí)施例1。結(jié)果如圖8C所示，抗血清與純化的融合表位蛋白及截短的UreB蛋白UreBM發(fā)生 了陽(yáng)性反應(yīng)，并且與天然幽門(mén)螺桿菌26695的UreaB也發(fā)生了特異性抗原抗體反應(yīng)，而與 BSA未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)發(fā)生，說(shuō)明由融合表位蛋白免疫BALB/e小鼠制備的抗血清能夠識(shí)別天 然的UreB蛋白，進(jìn)一步說(shuō)明我們鑒定出來(lái)的表位是有效的表位，可作為表位疫苗的候選分 子。實(shí)施例5、單抗及多抗血清抑制尿素酶活性試驗(yàn)含有尿素酶活性的提取物來(lái)自于上述制備的幽門(mén)螺桿菌NCTC 11637全菌破碎物 的離心上清。取含有尿素酶的提取物稀釋于25μ 1 PBS (ρΗ7. 0)中，分別與同樣稀釋于25 μ 1 PBS(ρΗ7. 0)的實(shí)施例4中制備的GST-UP32、GST-UP35及GST-UP38多克隆抗血清、單克隆 抗體Α1Η10、B3D9、A3C10共孵育于酶聯(lián)板中，4°C過(guò)夜。取含有500mM尿素，0. 02%酚紅和 0. ImM DTT的50mM磷酸鹽緩沖液(pH6. 8) 50 μ 1加于酶聯(lián)孔中，室溫孵育5h后測(cè)量560nm 處的OD值。同時(shí)以抗GST的多抗鼠血清、用實(shí)施例4中PBS免疫的小鼠血清作為對(duì)照。抑 制率(％)=(無(wú)抗體的OD值-加抗體后的OD值)/(無(wú)抗體的OD值)X100。試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，與對(duì)照組相比，單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10對(duì)尿素酶 有顯著的抑制作用，當(dāng)劑量達(dá)到25yg時(shí)，抑制率均可達(dá)70%，GST-UP32、GST-UP35及 GST-UP38多克隆抗血清對(duì)尿素酶也有一定的抑制作用，當(dāng)加入的抗體劑量為30μ g時(shí)，抑制率均可達(dá)50%，而且這種抑制具有劑量依賴(lài)性，隨著加入抗體劑量的增加，抑制率呈上升 趨勢(shì)。
根據(jù)以上試驗(yàn)可證明，本發(fā)明利用分段截短法構(gòu)建分段抗原并用western blot方 法確定了各單抗所針對(duì)的抗原表位。本發(fā)明鑒定出來(lái)的表位免疫動(dòng)物后，能夠有效地激發(fā) 機(jī)體的特異性體液免疫應(yīng)答，證實(shí)了它們具有良好免疫原性，并且產(chǎn)生的抗血清具有一定 的尿素酶活性抑制作用，并可以避免產(chǎn)生構(gòu)象表位特異性抗體，增強(qiáng)對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染的 抑制和清除效果，對(duì)相應(yīng)疫苗的研發(fā)、致病機(jī)理的研究以及臨床診斷中起到很好的推動(dòng)作 用。同時(shí)，本發(fā)明的表位產(chǎn)生的抗血清能夠和天然幽門(mén)螺桿菌菌株的尿素酶發(fā)生反應(yīng)，表明 本發(fā)明的表位可以應(yīng)用于蛋白表位的病原生物診斷。
權(quán)利要求
一種多肽，是如下1)或2)的多肽1)由序列表中序列37所示的氨基酸序列組成的多肽；2)將序列表中序列37的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有幽門(mén)螺桿菌尿素酶抗原表位功能的由1)衍生的多肽。
2.權(quán)利要求1所述的多肽的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)?)、2)、3)或4)1)序列表中序列28的DNA；2)編碼序列表中序列37的蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。4)與序列表中序列28同源性在80%以上并且編碼幽門(mén)螺桿菌尿素酶抗原表位功能的 多肽的核苷酸。
4.權(quán)利要求1所述的多肽或其編碼基因在制備預(yù)防或治療幽門(mén)螺桿菌感染的免疫制 劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述免疫制劑為表位疫苗制劑，優(yōu)選為多 聯(lián)多聚表位疫苗制劑。
6.權(quán)利要求1所述的多肽或其編碼基因在制備抑制尿素酶的活性的藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的多肽或其編碼基因在制備幽門(mén)螺桿菌體外檢測(cè)試劑中的應(yīng)用
8.檢測(cè)、預(yù)防或治療幽門(mén)螺桿菌感染的免疫制劑，其活性成分包括權(quán)利要求1所述的 多肽。
9.抑制尿素酶的活性的藥物，其活性成分包括權(quán)利要求1所述的多肽和/或其抗體。
10.一種篩選權(quán)利要求1所述幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞基中和性B細(xì)胞抗原表位多肽的 方法，主要包括以下步驟(1)將幽門(mén)螺桿菌的UreB抗原采用截短法分段構(gòu)建并進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，通過(guò)免疫 印跡分析，初步確定單抗A1H10、B3D9、A3C10所針對(duì)的表位范圍；(2)根據(jù)上述步驟(1)所確定的幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體A1H10、B3D9、 A3C10所針對(duì)的抗原表位所在區(qū)域，進(jìn)行第二次和第三次的截短分段構(gòu)建UreB抗原，將單 抗A1H10、B3D9、A3C10所針對(duì)的抗原表位精確定位在UreB特定的位置；(3)化學(xué)合成上述步驟(2)鑒定出來(lái)的抗原表位，通過(guò)間接ELISA法，以進(jìn)一步確定抗 幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所針對(duì)的抗原表位。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種幽門(mén)螺桿菌尿素酶B抗原表位多肽及其應(yīng)用。該抗原表位多肽，其氨基酸序列為序列表中序列37。它的編碼基因序列為序列表中序列28。本發(fā)明提供的抗原表位多肽能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗幽門(mén)螺桿菌保護(hù)性免疫反應(yīng)，從而增強(qiáng)對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染的抑制作用，提高機(jī)體清除病菌的能力，對(duì)相應(yīng)疫苗的研發(fā)、致病機(jī)理的研究以及臨床診斷中起到很好的推動(dòng)作用。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101863965SQ20101018225
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者劉純杰, 王艷春, 邱炎, 陶好霞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所