專利名稱：一種低產(chǎn)尿素的黃酒酵母代謝工程菌及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種低產(chǎn)尿素的黃酒酵母代謝工程菌及其構建方法，屬于微生物遺傳工程領域。
背景技術：
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，簡稱EC)，俗稱烏拉坦⑴rethane)，分子式為 NH2COOC2H5(CAS#51-79-6)。動物毒理學試驗顯示，EC對多個物種(包括小鼠、大鼠、倉鼠、 猴)具有致癌作用，能引起動物肺癌、淋巴癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、皮膚癌等惡性腫瘤的發(fā)生，表明EC是人類潛在的致癌物質(zhì)。1974年，EC被世界衛(wèi)生組織(WHO)下屬的國際癌癥研究機構(IARC)劃為2組B類可致癌物質(zhì)；2007年3月，IARC進一步提高了 EC的致癌風險等級，將其劃分進2組A類可致癌物質(zhì)名單。
EC是各種發(fā)酵酒精飲料(包括中國黃酒、葡萄酒、日本清酒等)釀造過程中伴隨產(chǎn)生的副產(chǎn)物，不少國家尤其是一些歐美發(fā)達國家對市場上各酒種中的EC含量制定了嚴格的限定標準。黃酒是我國特有傳統(tǒng)酒種，當前黃酒中EC含量較高的現(xiàn)狀已成為嚴重制約我國黃酒業(yè)發(fā)展尤其是國際化發(fā)展的瓶頸之一，嚴重阻礙了我國黃酒向國際市場的開拓， 同時在高度重視食品安全的今天，對國內(nèi)消費者也是一個潛在的威脅。因此，研究出適合我國黃酒企業(yè)控制EC含量的策略和方法，降低黃酒中EC含量，使其至少與日本清酒國際標準 (< 100 μ g/L)接軌，對于整個中國黃酒業(yè)的發(fā)展迫在眉睫，具有重大意義。截至目前，我國尚未針對黃酒、葡萄酒等制定EC限量標準，但國家衛(wèi)生部近兩年已開始關注此問題，相信標準的出臺只是時間問題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種低產(chǎn)尿素的黃酒酵母代謝工程菌。
本發(fā)明提供的低產(chǎn)尿素的黃酒酵母代謝工程菌，是將脲基酰胺酶基因(DUR1，2) 編碼框置于釀酒酵母組成型高表達TPIl轉錄啟動子(TPI1 promoter，簡寫為TPIlp)和轉錄終止子(TPI1 terminator，簡寫為TPIlt)控制之下，通過同源重組將TPIlp_DURl， 2-TPIlt基因盒穩(wěn)定整合入菌株黃酒酵母菌株基因組中得到的黃酒酵母代謝工程菌。
所述脲基酰胺酶基因(DURlJ)的核苷酸序列的GenBank號為NM_001178556。
釀酒酵母組成型高表達TPIl轉錄啟動子、轉錄終止子TPIlp來源于大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒p^(212 (Invitrogen)。
所述出發(fā)菌株黃酒酵母也稱為釀酒酵母，購自CICC(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)，菌株保藏號為CICC30395。
本發(fā)明的第二個目的是提供上述低產(chǎn)尿素的黃酒酵母代謝工程菌的構建方法。
本發(fā)明提供的構建上述低產(chǎn)尿素的代謝工程菌的方法，是利用代謝工程手段，將脲基酰胺酶基因(DUR1，2)編碼框置于釀酒酵母組成型高表達TPIl轉錄啟動子(TPIlp)和轉錄終止子(TPIlt)控制之下，再通過兩端分別連接一段酪氨酸酶相關蛋白1基因(TRPl)同源臂，構建trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl同源重組基因盒，隨后通過同源重組原理將 TPIIp-DURl，2-TPIIt基因序列整合入出發(fā)菌株黃酒酵母基因組的TRPl位點，使DUR1，2基因獲得穩(wěn)定高水平表達。
所述酪氨酸酶相關蛋白1基因核苷酸序列的GenBank號為NM_001180315。
本發(fā)明所述代謝工程菌可以使細胞能及時分解由精氨酸酶水解精氨酸產(chǎn)生的過多尿素，強化尿素降解途徑，大大減少酵母細胞的尿素分泌量。小試黃酒發(fā)酵試驗表明， 與出發(fā)菌株相比，成功構建的低產(chǎn)尿素黃酒酵母代謝工程菌使發(fā)酵液中尿素含量下降至 8. 5mg/L (下降了 3. 3倍)，最終使酒液中的EC含量下降至53. 4 μ g/L (下降了 3. 5倍)。 本發(fā)明的黃酒酵母代謝工程菌株具有明顯的產(chǎn)尿素水平低的特點，利用其發(fā)酵生產(chǎn)的黃酒 EC含量低，且風味基本保持不變。


圖1是提取的出發(fā)菌株黃酒酵母基因組總DNA電泳圖(M =Marker ；1，2，3 黃酒酵母基因組總DNA)。
圖 2 是 PCR 擴增 DURl，2 基因電泳圖(M :Marker ;1，2 :DUR1，2 基因)。
圖3是pTO212-DURl，2重組質(zhì)粒構建過程示意圖。
圖4是pYX212-DURl，2重組質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖(M :Marker ;1，2 :EcoR I和 BamH I雙酶切重組質(zhì)粒)。
圖5 是 YRp7-trpl-TPIlp-DURl，2-TPIlt-trpl 重組質(zhì)粒構建過程示意圖。
圖6是生長在選擇培養(yǎng)基平板上轉化子的照片。
具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、TPIIp-DURl，2-TPIIt基因盒的構建
采用酵母基因組提取試劑盒提取黃酒酵母基因組總DNA(圖1)。利用因特網(wǎng)上公開的釀酒酵母(S. cerevisiae)標準菌株基因組序列數(shù)據(jù)庫(http//www. yeastgenome. org/)信息，設計合適的引物和酶切位點(PI :ACTGAGGAATTCATGACAGTTAGTTCCGATACAACTGC TG, EcoR I ；P2 TCAGGAGGATCCTCATGCCAATGTCTCTATGACGGCCACT，BamH I)，以提取的基因組 DNA為模板，PCR擴增獲得DURl，2基因編碼框序列(圖2)，雙酶切基因與大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒P^(212 (Invitrogen)后，通過DNA連接反應構建重組質(zhì)粒pTO212-DURl，2，使 DURl，2的表達置于釀酒酵母組成型高表達啟動子TPI Ip及終止子TPI It控制下(圖3和4)； 通過在TPIlp&TPIlt頭尾設計引物，以上述重組質(zhì)粒為模板，即可一步擴增出TPIIp-DURI, 2-TPIlt基因盒序列。
實施例2、trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl 基因盒的構建
設計弓I物(P3 TCAGGACCATGGCATTTAATAGAACAGCATCGT，Nco I ；P4 ACTGAGAAGCTTCTTCTGAATCAAACAAG，Hind III)，從黃酒酵母基因組中克隆獲得長度1104bp 的包含編碼框及部分上下游序列的TRPl基因片段，通過DNA酶切、連接反應亞克隆入載體 YRp7，構建重組質(zhì)粒YRp7-trpl。設計引物，利用PCR在TPIIp-DURl，2-TPIIt基因盒兩端加入酶切位點EcoR V。同時用EcoR V單酶切YRp7-TRPl和TPIlp-DURl，2-TPIlt，通過DNA連接，最終構建出重組質(zhì)粒YRp7-(trpl-TPIlp-DURl，2-TPIlt-trpl)(圖幻。通過設計頭尾引物，以重組質(zhì)粒為模板進行PCR，即可一步擴增出兩端分別帶有562bp*M2bp trpl同源臂的 trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl 基因盒序列。
實施例3、整合有TPIIp-DURl，2-TPIIt基因盒的工程菌株的獲得
采用醋酸鋰轉化法，以線形trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl基因盒片段與環(huán)形質(zhì)粒pUT332 (含phleomycin抗性基因)為外源DNA，將兩者共轉化感受態(tài)黃酒酵母，然后以選擇培養(yǎng)基平板(YPD+100 μ g/mL phleomycin)篩選轉化子，菌落PCR鑒定出TPIlp_DURl， 2-TPIlt基因盒成功整合入TRPl基因位點的工程菌株，并通過DNA測序確證整合序列的正確性(圖6)。利用非選擇培養(yǎng)基(YPD)對酵母工程菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，利用野生型釀酒酵母胞內(nèi)質(zhì)粒不穩(wěn)定易丟失的現(xiàn)象(野生型釀酒酵母連續(xù)傳代10代后胞內(nèi)質(zhì)粒丟失概率 80%)，篩選鑒定出丟失抗性(即丟失質(zhì)粒pUT33》的工程菌株，并通過設計抗性基因的擴增引物，進行菌落PCR，最終獲得不含外源物種DNA、整合有TPI Ip-DURl，2-TPI It基因盒的工程菌株。
實施例4、工程菌株與出發(fā)菌株的小型發(fā)酵試驗比較兩者發(fā)酵指標、尿素、EC及風味物質(zhì)含量
利用大米醪培養(yǎng)液(濃度14° Bx)以工程菌株和出發(fā)菌株分別進行小試規(guī)模黃酒發(fā)酵，常規(guī)方法考察兩者綜合發(fā)酵性能(包括總失重量、總酸、酒精度、氨基態(tài)氮)， 發(fā)現(xiàn)兩者綜合發(fā)酵性能基本一致(表1)；利用尿素檢測試劑盒檢測兩者發(fā)酵液中尿素的含量，發(fā)現(xiàn)工程菌株相較出發(fā)菌株下降了 3.3倍(表1)；利用固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用 (SPME-GC-MS)法檢測兩者酒液中EC含量，發(fā)現(xiàn)工程菌株相較出發(fā)菌株下降了 3. 5倍(表 2)；常規(guī)方法考察兩者的基本風味物質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)基本一致(表幻，表明構建的工程菌株具有明顯的低產(chǎn)尿素效果，利用其發(fā)酵生產(chǎn)的黃酒EC含量低，且風味基本保持不變，具有實際工業(yè)應用潛力。
表1利用出發(fā)菌株和工程菌株發(fā)酵黃酒時各項發(fā)酵指標及發(fā)酵液中的尿素濃度
權利要求
1.一種低產(chǎn)尿素的黃酒酵母代謝工程菌，是將脲基酰胺酶基因DUR1，2編碼框置于釀酒酵母組成型高表達TPIl轉錄啟動子和TPIl轉錄終止子控制之下，通過同源重組將 TPIlp-DURl，2-TPIlt基因盒穩(wěn)定整合入菌株黃酒酵母菌株基因組中得到的黃酒酵母代謝工程菌。
2.如權利要求1所述代謝工程菌，其特征在于，所述黃酒酵母來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CICC 30395。
3.權利要求1所述代謝工程菌的構建方法，其特征在于，將脲基酰胺酶基因DUR1，2編碼框置于釀酒酵母組成型高表達TPIl轉錄啟動子和TPIl轉錄終止子控制之下，再通過兩端分別連接一段酪氨酸酶相關蛋白1基因同源臂，構建trpl-TPIlp-DURl，2-TPIlt-trpl同源重組基因盒，隨后采用同源重組方法將TPIIp-DURl，2-TPIIt基因序列整合入出發(fā)菌株黃酒酵母基因組的TRPl位點。
4.如權利要求3所述方法，其特征在于，所述黃酒酵母為CICC30395。
5.如權利要求3所述方法，其特征在于，所述脲基酰胺酶基因DURl，2與大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒Ρ^(212連接，構建重組質(zhì)粒pTO212-DURl，2，使DURl，2的表達置于釀酒酵母組成型高表達啟動子TPIlp及終止子TPIlt控制下。
6.如權利要求3所述方法，其特征在于，所述trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl構建方法為1)從黃酒酵母基因組中克隆獲得長度1104bp的包含編碼框及部分上下游序列的TRPl 基因片段，通過DNA酶切、連接反應亞克隆入載體YRp7，構建重組質(zhì)粒YRp7-trpl ；2)設計引物，利用PCR在TPIIp-DURl，2-TPIIt基因盒兩端加入酶切位點EcoRV，同時用EcoR V單酶切YRp7-TRPl和TPIIp-DURl，2_TPIlt，通過DNA連接，最終構建出重組質(zhì)粒 YRp7-trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl ；3)通過設計頭尾引物擴增出兩端分別帶有562bp和M2bptrpl同源臂的 trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl 基因盒序列。
7.如權利要求3所述方法，其特征在于，同源重組方法為采用醋酸鋰轉化法，以線形 trpI-TPI Ip-DURl，2-TPI lt_trpl基因盒片段與含phleomycin抗性基因的環(huán)形質(zhì)粒pUT332 為外源DNA，將兩者共轉化感受態(tài)黃酒酵母，然后篩選轉化子。
8.權利要求1所述低產(chǎn)尿素的黃酒酵母代謝工程菌應用于發(fā)酵生產(chǎn)黃酒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低產(chǎn)尿素的黃酒酵母代謝工程菌及其構建方法，是將脲基酰胺酶基因DUR1，2編碼框置于釀酒酵母組成型高表達TPI1轉錄啟動子和TPI1轉錄終止子控制之下，通過同源重組將TPI1p-DUR1，2-TPI1t基因盒穩(wěn)定整合入菌株黃酒酵母菌株基因組中得到的黃酒酵母代謝工程菌；本發(fā)明的黃酒酵母代謝工程菌株具有明顯的產(chǎn)尿素水平低的特點，利用其發(fā)酵生產(chǎn)的黃酒EC含量低，且風味基本保持不變，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/19GK102533573SQ20111035535
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月10日 優(yōu)先權日2011年11月10日
發(fā)明者周景文, 朱旭亞, 管政兵, 陸健, 陳堅 申請人:江南大學