專利名稱：Agt1r基因snp檢測(cè)液相芯片和特異性引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于 分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體地是涉及一種AGTlR 基因SNP檢測(cè)液相芯片和特異性引物。
背景技術(shù)：
血管緊張素II (angiotensin II，Ang II)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng) (rennin-angiotensinaldosterone system, RAAS)中調(diào)節(jié)血管收縮、維持血容量的主要效應(yīng) 分子，血管緊張素II受體(angiotensin II receptor, ATR)介導(dǎo)Ang II的生理學(xué)效應(yīng)，分 為I型血管緊張素II受體(angiotensinll type lreceptor, ATI, AT1R)和II型血管緊張素 II受體(AT2R)兩種亞型，其中，主要發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的是AT1R，ATlR主要調(diào)節(jié)Ang II的活性，參與Ang II的縮血管作用和正性肌力作用，包括血管收縮、加壓反應(yīng)、腎小 管鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)和醛固酮分泌，是RAAS作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，關(guān)于ATlR的編碼基因 AGTlR的多態(tài)性研究較多，AGTlR位于染色體3q21-q25區(qū)域，包括3個(gè)外顯子，而且 全部編碼區(qū)都位于第3外顯子。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少50種多態(tài)性位點(diǎn)，特別是與嚴(yán)重類 型的原發(fā)性高血壓相關(guān)的A1166C(rs5186)多態(tài)性位點(diǎn)備受關(guān)注，A1163C位于3’非編碼 區(qū)(3，UTR)，A1163C與高血壓、大動(dòng)脈硬化、左心室肥胖、糖尿病性腎病變和缺血性 心臟病等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的提高相關(guān)，此位點(diǎn)與氯沙坦對(duì)腎素水平和腎臟血流動(dòng)力學(xué)的影響相 關(guān)，A1166C基因型與AA型相比，在小劑量血管緊張素II(Ang II)滴注時(shí)，盡管腎血流量 也減少但腎小球?yàn)V過率不減少。此外，有研究表明，AGTRl基因啟動(dòng)子-153位A被G 取代后可能增加原發(fā)性高血壓患者合并冠心病可能性。AGTlR基因的A_153G(rs275653) 位點(diǎn)突變，將使攜帶-153G等位基因的高血壓老年患者(年齡大于55歲)比野生型攜帶 者更大可能患上動(dòng)脈硬化，而與1166AA野生型攜帶者相比任何年齡攜帶1166C等位基因 的高血壓患者，其患上動(dòng)脈硬化的幾率更大，同時(shí)攜帶1166C和-153G等位基因其患動(dòng) 脈硬化的幾率呈相加效應(yīng)。目前對(duì)AGTlR多態(tài)性的檢測(cè)產(chǎn)品一般是基于PCR技術(shù)的PCR-限制性片段長(zhǎng)度 多態(tài)性(RFLP)及直接測(cè)序法等，存在靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高的缺點(diǎn)，同時(shí) 由于檢測(cè)通量的局限性，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供AGTlR基因SNP檢測(cè)液相芯片。該液相芯片可用于 檢測(cè)AGTlR基因兩種常見基因型A1166C(rs5186)和/或A-153G (rs275653)的野生型和
突變型。一種AGTlR基因SNP檢測(cè)液相芯片，包括有(1)針對(duì)每種型別的SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型ASPE引物對(duì)，每種 ASPE引物對(duì)由5’端的tag序列和3’端的針對(duì)目的基因SNP位點(diǎn)的特異性引物序列組 成，所述特異性引物序列分別選自SEQIDN0.5&SEQIDN0.6、和/或SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8 ；所述tag序列選自SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.4中的序列；(2)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag 序列能相應(yīng)地與(1)中所選tag序列互補(bǔ)配對(duì)，所述anti-tag序列選自SEQ ID N0.9 SEQ I D N0.12中的序列，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；(3)用于擴(kuò)增具有A1166C和/或A-153G SNP位點(diǎn)的AGTlR基因目標(biāo)序列的 引物。優(yōu)選地，所述野生型及突變型ASPE引物對(duì)選自針對(duì)A1166C SNP位點(diǎn)的由 SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.5組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6組成的序列、 禾口 /或針對(duì)A-153GSNP位點(diǎn)的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.7組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.8組成的序列。優(yōu)選地，所述用于擴(kuò)增的引物包括針對(duì)A1166C SNP位點(diǎn)的SEQ ID NO. 13禾口 SEQ IDN0.14 ；禾口 / 或針對(duì) A-153G SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID N0.16。本發(fā)明的另一目的是提供AGTlR基因SNP檢測(cè)的特異性引物，該引物特異性 強(qiáng)，能準(zhǔn)確區(qū)分各種基因型，并且多位點(diǎn)同步檢測(cè)不存在交叉反應(yīng)率。用于AGTlR基因SNP檢測(cè)的特異性引物，包括有針對(duì)Al 166C SNP位點(diǎn)的野 生型和突變型的SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6 ；和/或針對(duì)A-153G SNP位點(diǎn)的野生型和 突變型的 SEQID N0.7 和 SEQ ID N0.8。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明所提供的液相芯片與測(cè)序法的檢測(cè)結(jié)果吻合率高達(dá)100%。所制備 的AGTlR基因SNP檢測(cè)液相芯片具有非常好的信號(hào)-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及 anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、anti-tag標(biāo)簽序列的選取以及 tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)SNP位點(diǎn)的并行檢 測(cè)。2.本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各種型別 的基因型。3.運(yùn)用本發(fā)明所述的液相芯片的的檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)單，兩種SNPs檢測(cè)可通過一 步多重PCR即可完成兩個(gè)含有SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜 操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時(shí)定 性、定量分析特征。4.本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測(cè)序技術(shù)，特別符合 實(shí)際應(yīng)用需要。5.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性差的缺 陷，同時(shí)對(duì)現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測(cè)項(xiàng)目， 具有很強(qiáng)的拓展性。檢測(cè)的熒光信號(hào)值大大提高，從而使得檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步得到提 高，信噪比增強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例IAGTlR基因SNP檢測(cè)液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物
針對(duì)AGTlR基因兩種常見基因型A1166C和A-153G的野生型和突變型，分別 設(shè)計(jì)特異性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物 序列如下表所示表IAGTlR的ASPE引物序列(Tag序列+特異性引物序列)
ASPE引物 基因型 類型 --
Tag序列特異性引物序列
5' TCATTTCACAATTCAATTACTCAAACTTCACTACCAAATGAGCA 3'
A1166C -W
(SEQIDNO.l)(SEQIDNO.5)
A1166C ---
5' AATCTACAAATCCAATAATCTCATACTTCACTACCAAATGAGCC 3'
A1166C-m
(SEQIDN0.2)(SEQIDN0.6)
5' TTACTCAAAATCTACACTTTTTCAATCATCCTTGCTGCCGTCAA 3'
A-153G-W
(SEQIDNO.3)(SEQIDNO.7)
A-153G---
5' C AATTC ATTTC ATTCAC AATCAATATCATCCTTGCTGCCGTCAG 3'
A-153G-m
(SEQ ID N0.4 )(SEQ ID N0.8)每條ASPE引物包括兩個(gè)部分，5’端為針對(duì)相應(yīng)微球上anti-tag序列的特異性 tag序列，3’端為突變型或野生型特異的特異性引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的每條引物分別用lOmmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的貯存液。二、anti-tag序列包被的微球根據(jù)所設(shè)計(jì)的ASPE特異性引物片段，選擇tag序列，最大限度地減少各微球的 anti-tag序列之間以及tag與ASPE特異性引物片段可能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，選擇的4種微球 編號(hào)與微球上相應(yīng)的anti-tag序列如表2所示表2微球編號(hào)與微球上相應(yīng)的anti-tag序列
SEQID
基因型類型 微球編號(hào)微球上對(duì)應(yīng)的anti-tag序列(5’- 30NO.
9A1166C-W45 TTGAGTAATTGAATTGTGAAATGA - A1166C---
10A1166C-m60 ATGAGATTATTGGATTTGTAGATT
11A-153G -w 26 TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA -A-153G---
12A-153G-m36ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG
選擇的四種微球購自美國(guó)Luminex公司，將anti_tag序列包被與微球上。anti-tag 序列與微球之間連接有5-10個(gè)T的間隔臂序列，即在每個(gè)anti-tag序列前加上一段5-10 個(gè)T的間隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成 的anti-tag序列用滅菌ddH20配成100nmol/ml的貯存液。所述間隔臂為用于將anti-tag 與微球表面間隔開來或是將anti-tag置于親水性環(huán)境中的序列。通過在anti-tag序列與微 球之間設(shè)置適當(dāng)長(zhǎng)度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反 應(yīng)的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2) η間隔臂(23)，如(CH2) 12、(CH2)18等。另外，如果存在poly (dA)干擾，還可以用 poly(TTG)作為間隔臂。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5-10個(gè)T，微球包被的過程如下分別取5X IO6個(gè)上述編號(hào)的羧基化的微球(購自Luminex公司)懸浮于50U1 0.1mol/L 的 MES 溶液中(pH4.5)，加入 IOul 合成的 anti-tag 分子(100nmol/ml)。配制 10ng/ml 的 EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(購自 Pierce Chemical 公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液，恒溫孵育30分鐘，再加入2.5ul 的EDC工作液，再恒溫孵育30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用0.02%的Tween-20洗滌一次， 再用0.1 %的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有anti-tag序列的微球重懸于IOOul的 Tris-EDTA 溶液[10mmol/L Tris (pH8.0) ]，lmmol/LEDTA 中，2-8 V避光保存。三、擴(kuò)增出含有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物針對(duì)AGTlR基因兩種常見基因型A1166C和A-153G的SNP突變位點(diǎn)，利用 Primer5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物對(duì)(見表3)，分別擴(kuò)增出兩條含有SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列。表3擴(kuò)增出AGTIR基因中具有SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物
權(quán)利要求
1.一種AGTlR基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征在于主要包括有(1)針對(duì)每種型別的SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型ASPE引物對(duì)，每種ASPE 引物由5’端的tag序列和3’端的針對(duì)目的基因SNP位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述 特異性引物序列分別選自SEQ ID N0.5及SEQ ID N0.6、禾Π /或SEQ ID Ν0.7及SEQ ID Ν0.8 ；所述tag序列選自SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.4中的序列； (2)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列 能相應(yīng)地與(1)中所選tag序列互補(bǔ)配對(duì)，所述anti-tag序列選自SEQ ID N0.9 SEQ ID N0.12中的序列，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；(3)用于擴(kuò)增具有Al166C和/或A-153G SNP位點(diǎn)的AGTIR基因目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AGTlR基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征在于所述野生型 及突變型ASPE引物對(duì)選自針對(duì)A1166C SNP位點(diǎn)的由SEQIDN0.1和SEQIDN0.5組 成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6組成的序列、禾Π /或針對(duì)A-153G SNP位點(diǎn) 的由SEQ ID Ν0.3和SEQID Ν0.7組成的序列及由SEQ ID Ν0.4和SEQ ID NO.8組成的 序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AGTlR基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征在于所述用于擴(kuò) 增的引物包括針對(duì)A1166C SNP位點(diǎn)的SEQ ID NO.13和SEQ ID N0.14 ；和/或針對(duì) A-153G SNP 位點(diǎn)的 SEQID N0.15 和 SEQ ID N0.16。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AGTlR基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征在于主要包括有(1)所述野生型及突變型ASPE引物對(duì)為針對(duì)A1166CSNP位點(diǎn)的由SEQ ID N0.1 和SEQ IDN0.5組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6組成的序列；和針對(duì) A-153GSNP位點(diǎn)的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.7組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.8組成的序列；(2)分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選 tag序列互補(bǔ)配對(duì)；所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序 列為SEQ ID N0.9 SEQ IDN0.12中的序列，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有 間隔臂序列；(3)用于擴(kuò)增的引物包括針對(duì)A1166CSNP位點(diǎn)的SEQIDN0.13和SEQIDN0.14 ； 和針對(duì) A-153G SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的AGTlR基因SNP檢測(cè)液相芯片，其特征在于所 述間隔臂序列為5-10個(gè)T。
6.用于AGTlR基因SNP檢測(cè)的特異性引物，其特征在于包括有針對(duì)A1166C SNP位點(diǎn)的野生型和突變型的SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6 ；和/或針對(duì)A-153G SNP位 點(diǎn)的野生型和突變型的SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8。
全文摘要
本發(fā)明公開了AGT1R基因SNP檢測(cè)特異性引物和液相芯片，所述液相芯片主要包括由5’端的tag序列和3’端的針對(duì)SNP位點(diǎn)的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列分別選自SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6、和/或SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；所述tag序列選自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4中的序列；微球；擴(kuò)增引物。所制備的AGT1R基因SNP檢測(cè)液相芯片具有非常好的信號(hào)-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各種類型的突變位點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102021236SQ20101019680
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月8日
發(fā)明者余剛, 曾濤, 秦會(huì)娟, 許嘉森 申請(qǐng)人:廣州益善生物技術(shù)有限公司