專利名稱：菠蘿蔗糖磷酸合成酶基因Ac-SPS1、其編碼蛋白質(zhì)以及其基因克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因及其克隆方法，同時(shí)也涉及到基因編碼蛋白質(zhì)，屬于生物技術(shù)領(lǐng) 域，具體涉及一種菠蘿蔗糖磷酸合成酶基因AC-SPS1、其編碼蛋白質(zhì)以及基因克隆方法。
背景技術(shù)：
菠蘿(Ananas comosus)是鳳梨科多年生常綠草本植物，其果實(shí)富含多種糖分、有 機(jī)酸、礦質(zhì)元素以及人體必須的多種維生素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受人們的喜愛。如今菠蘿已成 為世界性的重要水果，據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，2006年世界菠蘿產(chǎn)量為1826萬噸，是繼香蕉和芒果之后 的世界第三大熱帶水果。我國自17世紀(jì)初開始引種菠蘿，主要分布在廣東、廣西、海南、云 南、福建等省區(qū)。近年來，我國菠蘿產(chǎn)業(yè)迅速增長(zhǎng)，在世界上僅次于泰國、菲律賓之后的第三 大菠蘿生產(chǎn)國。雖然菠蘿是我國相對(duì)比較有優(yōu)勢(shì)的熱帶果品，但我國菠蘿的出口比例較小，國際 和國內(nèi)市場(chǎng)價(jià)格明顯偏低，經(jīng)濟(jì)效益不高，嚴(yán)重挫傷了果農(nóng)的生產(chǎn)積極性，阻礙了我國菠蘿 產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步健康發(fā)展。造成這一結(jié)果的原因很多，但品質(zhì)較差無疑是最主要的原因之一。 因此提高菠蘿品質(zhì)已成為我國菠蘿產(chǎn)業(yè)今后能否經(jīng)受住市場(chǎng)沖擊，并在競(jìng)爭(zhēng)中獲得長(zhǎng)足發(fā) 展的關(guān)鍵問題。菠蘿果實(shí)品質(zhì)包括外觀和內(nèi)在品質(zhì)兩個(gè)方面，而糖分是造成果實(shí)品質(zhì)優(yōu)劣 的主導(dǎo)因素。因此，研究果實(shí)中糖代謝對(duì)改善果實(shí)的品質(zhì)具有重要的意義。蔗糖磷酸合成酶(SPS)在蔗糖合成過程起著重要的作用，Huber研究表明，SPS是 合成蔗糖的關(guān)鍵酶之一，SPS活力越高，蔗糖積累得越多(Huber and Huber，1996)，蔗糖磷 酸合成酶活性與淀粉積累呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而與蔗糖形成呈正比關(guān)系，因此SPS的活力大小直 接影響光合產(chǎn)物在淀粉與蔗糖之間的分配(Huber，1983)。目前編碼基因的SPS也已從玉 米、菠菜、馬鈴薯、甜菜、柑桔、蘋果、甘蔗、水稻、甜瓜、巨龍竹等14種植物中克隆得到，多為 3000-3600bp的mRNA片段(吳平等，2000)。Li等(2003)從熱帶附生植物紫蝴蝶蘭中克隆 出SPS基因的全長(zhǎng)cDNA來，該cDNA被命名為spsl，長(zhǎng)為3820bp，含有3182bp的開放閱讀 框，并編碼1061個(gè)氨基酸，該氨基酸序列與玉米和菠菜的同源性分別為56%和69%。番茄 中克隆得到的SPS基因的全長(zhǎng)cDNA，長(zhǎng)為3373bp，編碼區(qū)序列長(zhǎng)為3162bp，編碼1054個(gè)氨 基酸(孫麗萍等，2005)。Komatsu等(1996)在柑橘中克隆到了 3個(gè)編碼SPS的cDNA同工 型片段，分別命名為CitSPSl、CUSPS2和CUSPS3，隨后用CitSPSl和果實(shí)的cDNA文庫雜 交獲得了一個(gè)全長(zhǎng)3539bp的cDNA-CitSPSl。此cDNA編碼1個(gè)含1057個(gè)氨基酸、分子量為 117. 8kD的多肽鏈，與小麥和菠菜SPS的同源性分別為55. 8%和74. 0%，含有磷酸化位點(diǎn) Ser15°，與鈣調(diào)素依賴蛋白激酶II(CaM-d印endent protein kinase II)和磷酸化激酶位點(diǎn) (Argl47-Ile-Ser-Ser-Vall51)的共同序列RXXSV匹配，而且磷酸化絲氨酸在C-端有酸性 殘基(Aspl52, Glul55)，這在酪蛋白激酶II位點(diǎn)上也有(Komatsu等，1996)。在菠菜和甜 菜(Hesse等，1995)中克隆得到的SPS cDNA也有這些特異位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)。但目前還沒有關(guān)于菠蘿果實(shí)蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的相關(guān)報(bào)道，因此，對(duì)菠
3蘿蔗糖磷酸合成酶基因的克隆以及對(duì)他們的生物學(xué)功能研究，將有助于明確菠蘿果實(shí)糖代 謝的分子機(jī)理，為調(diào)控果實(shí)品質(zhì)等研究奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種首次從菠蘿果實(shí)中獲得的菠蘿果 實(shí)蔗糖磷酸合成酶基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供菠蘿蔗糖磷酸合成酶編碼的氨基酸序列及編碼蛋白 性質(zhì)的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。同時(shí)，本發(fā)明還提供該菠蘿蔗糖磷酸合成酶基因的克隆方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所提供的菠蘿蔗糖磷酸合成酶，從菠蘿(Ananas comosus)中克隆，命名為 Ac-SPSl基因，核苷酸序列如SEQ ID NO :1。上述菠蘿蔗糖磷酸合成酶編碼的蛋白質(zhì)，命名為Ac-SPSl蛋白質(zhì)，其氨基酸序列 如 SEQ IDNO :2ο上述菠蘿蔗糖磷酸合成酶基因Ac-SPSl的克隆方法，包括如下步驟(1)選用菠蘿果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料，采用改良SDS法提取菠蘿果實(shí)中的總RNA，RNA含 量及質(zhì)量采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)采用Takara公司生產(chǎn)的mRNA Selective PCR Kit Ver 1. 1 二步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 獲得cDNA ；(3)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST信息設(shè)計(jì)菠蘿Ac-SPSl基因編碼區(qū)引物正向引物5，-GGA(G/A) CTTGG (T/A/G/C) CG (T/G) GATTCTGATA-3，反向引物5，-CAGGAAC(A/T/C) TC (A/T) GA (C/T) TG (C/T) TTGTG-3，反應(yīng)體系為10XPCRBuffer II 2. 5 μ l,25mM MgCl2 1. 5μ IUOmM dNTP/ analog Mixturel μ 1、ExTaq 0. 2μ1、10μ1 cDNA 樣品、正向引物(20 μ Μ) 1 μ 1、反向引物 (20 μ Μ) 1 μ 1、再補(bǔ)足Rnase Free H2O至總體積25 μ 1 ；擴(kuò)增程序?yàn)?5°C變性lmin_52°C復(fù) 性lmin-72°C延伸2min，28個(gè)循環(huán)后，72°C延伸IOmin ；(4)PCR產(chǎn)物回收后與pGEM-T easy Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε· coli DH 5 α 感受態(tài)細(xì)胞，采用藍(lán)白斑法篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證后測(cè)序，獲得 Ac-SPSl 基因。本發(fā)明的Ac-SPSl基因擴(kuò)增片段大小為1133bp，其編碼376個(gè)氨基酸，含有典型的 糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。經(jīng)同源序列比較發(fā)現(xiàn)，所克隆的菠蘿Ac-SPSl基因的氨基酸序列中包 含了 SPS蛋白家族的兩個(gè)絲氨酸保守結(jié)構(gòu)域，一個(gè)為14-3-3蛋白特異結(jié)合位點(diǎn)，另一個(gè)是 滲透脅迫的激活位點(diǎn)，它們可被相應(yīng)的蛋白激酶或磷酸酶分別磷酸化或脫磷酸化而改變酶 活性，也可與14-3-3蛋白特異結(jié)合改變酶活性。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明對(duì)菠蘿蔗糖磷酸合成酶基因的克隆以及對(duì)他們的生物學(xué)功能研究，將有助 于明確菠蘿果實(shí)糖代謝的分子機(jī)理，為調(diào)控果實(shí)品質(zhì)等研究奠定基礎(chǔ)，為改善菠蘿果實(shí)的 品質(zhì)做出積極地貢獻(xiàn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，這些實(shí)施例只用來說明本發(fā) 明，并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)例1菠蘿蔗糖磷酸合成酶基因Ac-SPSl的分子克隆選用巴厘菠蘿果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料，提取果肉中的總RNA。以獲得的總RNA為摸板， 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST信息設(shè)計(jì)菠蘿Ac-SPSl基因編碼區(qū)引物正 向引物5，-GGA(G/A)CTTGG(T/A/G/C)CG(T/G)GATTCTGATA-3，，反向引物5，-CAGGA AC(A/ T/C) TC (A/T) GA (C/T) TG (C/T) TTGTG-3，。采用 Takara 的 Ex-Taq 酶進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物 回收后與pGEM-T easy Vector (Promega)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε. coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞， 采用藍(lán)白斑篩選陽性克隆。篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證后測(cè)序，獲得Ac-SPSl基因。實(shí)例2Ac-SPSl的序列信息與特性分析本發(fā)明的Ac-SPSl基因長(zhǎng)為1133bp，其該基因片段編碼376個(gè)氨基酸，含有典型的 糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。經(jīng)同源序列比較發(fā)現(xiàn)，所克隆的菠蘿Ac-SPSl基因的氨基酸序列中包 含了 SPS蛋白家族的兩個(gè)絲氨酸保守結(jié)構(gòu)域，一個(gè)為14-3-3蛋白特異結(jié)合位點(diǎn)，另一個(gè)是 滲透脅迫的激活位點(diǎn)，它們可被相應(yīng)的蛋白激酶或磷酸酶分別磷酸化或脫磷酸化而改變酶 活性，也可與14-3-3蛋白特異結(jié)合改變酶活性。序列的對(duì)比分析還表明Ac-SPSl與水稻、 甘蔗、砂梨、桃、馬鈴薯、甜瓜、番茄、煙草、考順竹和黑麥草的同源性較高。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種菠蘿果實(shí)蔗糖磷酸合成酶基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO1。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的菠蘿蔗糖磷酸合成酶基因，其特征在于擴(kuò)增片斷大小為 1133bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的菠蘿蔗糖磷酸合成酶基因，其特征在于該基因片段編碼 376個(gè)氨基酸，含有典型的糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述菠蘿蔗糖磷酸合成酶基因，其特征在于還包含了SPS蛋 白家族的兩個(gè)絲氨酸保守結(jié)構(gòu)域，分別為14-3-3蛋白特異結(jié)合位點(diǎn)，另一個(gè)是滲透脅迫的 激活位點(diǎn)，它們被相應(yīng)的蛋白激酶或磷酸酶分別磷酸化或脫磷酸化而改變酶活性，或者與 14-3-3蛋白特異結(jié)合改變酶活性。
5.權(quán)利要求1所述的菠蘿蔗糖磷酸合成酶基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ IDNO :2。
6.權(quán)利要求1所述的菠蘿蔗糖磷酸合成酶基因的克隆方法，包括如下步驟(1)選用菠蘿果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料，采用改良SDS法提取菠蘿果實(shí)中的總RNA，RNA含量 及質(zhì)量采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)采用Takara公司生產(chǎn)的mRNASelective PCR Kit Verl. 1 二步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA ；(3)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST信息設(shè)計(jì)菠蘿Ac-SPSl基因編碼區(qū)引物正向引物5，-GGA(G/A)CTTGG(T/A/G/C)CG(T/G)GATTCTGATA-3‘反向引物5，-CAGGAAC(A/T/C)TC(A/T)GA(C/T)TG(C/T)TTGTG-3‘反應(yīng)體系為10XPCR Buffer II 2. 5 μ l,25mM MgCl2 1.5 μ l、10mM dNTP/analog Mixturely 1、ExTaq 0· 2 μ 1、10 μ 1 cDNA 樣品、正向弓丨物(20 μ Μ) 1 μ 1、反向弓丨物 (20 μ Μ) 1 μ 1、再補(bǔ)足Rnase Free H2O至總體積25 μ 1 ；擴(kuò)增程序?yàn)?5°C變性lmin_52°C復(fù) 性lmin-72°C延伸2min，28個(gè)循環(huán)后，72°C延伸IOmin ；(4)PCR產(chǎn)物回收后與pGEM-Teasy Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε. coli DH 5 α感 受態(tài)細(xì)胞，采用藍(lán)白斑法篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證后測(cè)序，獲得 Ac-SPSl 基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種菠蘿蔗糖磷酸合成酶的基因如SEQ ID NO1及其編碼蛋白質(zhì)如SEQ ID NO2，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；本發(fā)明還涉及該基因的克隆方法提取菠蘿果實(shí)中的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)該菠蘿果實(shí)中的總RNA，以總RNA為摸板，以O(shè)ligo dT為引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy載體連接，轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證后測(cè)序，獲得Ac-SPS1基因；本發(fā)明的基因可為從分子水平進(jìn)行菠蘿果實(shí)糖積累的機(jī)理研究提供理論依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/52GK101899453SQ20101019670
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月8日
發(fā)明者姚艷麗, 孫光明, 張秀梅, 杜麗清, 謝江輝 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所