專利名稱：一種肝臟靶向性的基因工程干擾素及其制備方法
一種肝臟靶向性的基因工程干擾素及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種基因工程干擾素。具體而言，本發(fā)明 涉及經(jīng)半乳糖基修飾的基因工程干擾素及其制備方法，該基因工程干擾素具有明確的靶向 肝臟的特性。
發(fā)明背景
干擾素(Interferon，IFN)是臨床用于治療病毒性肝炎的常用藥物。普通干擾素 在體內(nèi)半衰期短，需反復(fù)多次給藥，導(dǎo)致患者生理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重，并且容易引發(fā)副反應(yīng)， 限制了其臨床應(yīng)用。
對(duì)于IFN這類具有生理或藥理活性的生物活性蛋白，通常采用緩釋、化學(xué)修飾和 基因工程改造等手段來(lái)改善其生物活性。例如羅氏和先靈葆雅的PEG化干擾素、白蛋白融 合干擾素均具有較長(zhǎng)的半衰期；美國(guó)專利US4695623和US4897471設(shè)計(jì)的復(fù)合干擾素，可使 用3-5倍于普通干擾素的劑量而副反應(yīng)沒(méi)有增加。
然而，無(wú)論是普通干擾素還是長(zhǎng)效干擾素，其在肝臟的分布均不到給全部給藥劑 量的10%，不得不依靠加大給藥劑量來(lái)彌補(bǔ)肝靶向性較差的不足。提高干擾素向肝臟的運(yùn) 輸，減少干擾素與其它器官的結(jié)合，對(duì)于增強(qiáng)其治療效果、減少副反應(yīng)將具有很大的益處。
利用肝臟中特異的去唾液酸糖蛋白受體識(shí)別藥物中的半乳糖組分，來(lái)提高藥物肝 靶向性的研究已有報(bào)導(dǎo)。中國(guó)專利申請(qǐng)CN1087093A就采用半乳糖化學(xué)修飾的方法來(lái)提高 干擾素的肝靶向性；申請(qǐng)?zhí)枮?00810021401.X的中國(guó)申請(qǐng)中則采用向干擾素融合的白蛋 白上加入半乳糖的方式，來(lái)提高其肝靶向性。但是，這些改造方式均屬于人工分子改造，改 造后蛋白分子與天然分子的差異較大，因此可能會(huì)引發(fā)人體較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，不僅影響其 治療活性，而且往往會(huì)帶來(lái)很強(qiáng)的副反應(yīng)。
眾所周知，天然干擾素多屬于糖蛋白。因此如果能夠通過(guò)基因工程方法，改變干擾 素分子中糖基化修飾糖鏈類型或結(jié)構(gòu)從而改變干擾素的靶向特性，則能夠最大限度減少免 疫原性的引入。并且通過(guò)基因工程方法獲得的糖基修飾工程化干擾素還具有分子高度均一 的特點(diǎn)，這對(duì)于生物技術(shù)藥物的成藥性而言至關(guān)重要。
本發(fā)明人通過(guò)大量研究，借助基因工程手段，實(shí)現(xiàn)在干擾素修飾糖鏈的末端引入 特定的糖基，使改造后的干擾素與肝臟上相應(yīng)受體具有更高的結(jié)合能力，從而實(shí)現(xiàn)提高其 肝靶向性的目的。發(fā)明內(nèi)容
本方面旨在提供一種肝靶向性的基因工程干擾素。
本發(fā)明基于以下設(shè)計(jì)原理天然IFN-β含有166個(gè)氨基酸，在Asn80處存在一個(gè) N-糖基化位點(diǎn)(Asn-Glu-Thr)，因此在Thr上連有N-修飾糖鏈；同理，將IFN- α 1分子中位 于Asn34下游的Arg36突變?yōu)镾er，則可在突變后的Ser上引入一個(gè)N-糖基化修飾糖鏈。 在此基礎(chǔ)上，通過(guò)改變干擾素分子中糖基化修飾糖鏈類型或結(jié)構(gòu)來(lái)改變干擾素的靶向分布 特性，利用糖基工程化的畢赤酵母作為表達(dá)宿主菌，實(shí)現(xiàn)在干擾素修飾糖鏈的末端引入特定糖基如半乳糖分子，使其具有fedGlcNAcMan5GlcNAc2或Gal2GlcNAcMan5GlcNAc2的結(jié)構(gòu)， 改造后的干擾素與肝臟非唾液酸受體具有更高的結(jié)合能力，從而實(shí)現(xiàn)提高其肝靶向性的目 的。
一方面，本發(fā)明提供了一種半乳糖基化基因工程干擾素，所述干擾素用基因工程 方法生產(chǎn)，為具有N-糖基化修飾的糖蛋白，修飾糖鏈末端為半乳糖殘基。
所述基因工程干擾素中的N-糖基化位點(diǎn)可以是天然存在的，或者通過(guò)突變引入。
在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，其中所述的干擾素為干擾素β，其氨基酸由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列編碼。
其中所述修飾糖鏈具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2 或 Gal2GlcNAcMan5GlcNAc2 的結(jié)構(gòu) 特征。
另一方面，本發(fā)明提供了一種制備所述基因工程干擾素的方法，該方法包括
a)根據(jù)畢赤酵母密碼子偏嗜性設(shè)計(jì)并合成編碼所述干擾素蛋白分子的cDNA ；
b)將所述cDNA克隆至表達(dá)載體，并導(dǎo)入畢赤酵母中構(gòu)建表達(dá)工程菌；
c)誘導(dǎo)所述工程菌表達(dá)重組干擾素；
d)從培養(yǎng)液中純化重組干擾素。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所7J\ ο
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
1.本發(fā)明提供的基因工程干擾素在性能和生產(chǎn)方式上均區(qū)別于傳統(tǒng)的干擾素，在 靶向性和安全性上比傳統(tǒng)干擾素更具優(yōu)勢(shì)。
2.另一方面，這種通過(guò)基因工程方法獲得的糖基修飾工程化干擾素還具有分子高 度均一的特點(diǎn)，這對(duì)于生物技術(shù)藥物的成藥性而言至關(guān)重要。


圖1圖示的是重組半乳糖基化IFN-β的糖鏈分析測(cè)定結(jié)果。
圖2圖示的是半乳糖修飾基因工程干擾素β的組織分布情況，其中圖加圖示的 是糖鏈修飾結(jié)構(gòu)為^dGlcNAcMan5GlcNAc2的重組干擾素β組織分布圖；圖2b圖示的是未 經(jīng)糖基化修飾的重組干擾素β組織分布圖。其中總放代表總放射性，酸沉代表沉淀的干擾 素蛋白分子的放射性。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅 用于說(shuō)明本發(fā)明而絕不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。除另有說(shuō)明外，本申請(qǐng)中的所有科 技術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。本申請(qǐng)中引用的任一 專利、專利申請(qǐng)和出版物在此引入作為參考。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通 常采用常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的方法。實(shí)施例
實(shí)施例1肝靶向性基因工程干擾素β的制備
1. 1重組IFN-β表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
1. 1. IIFN-β編碼基因的優(yōu)化與合成4
IFN-β采用Genebank公開(kāi)的氨基酸序列(ΝΡ_002167)，其糖蛋白分子在Asn80處 含有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(參見(jiàn)J. Biol. Chem. 262 (30)，14600-14605 (1987))。根據(jù)畢赤酵 母密碼子偏嗜性，使用DNAW0RK3. 1設(shè)計(jì)優(yōu)化的IFN-β的編碼cDNA序列，如SEQ ID NO 1 所示。在SEQ ID NO 1所示cDNA序列的上、下游引入BioI和)(baI酶切位點(diǎn)，然后克隆于 PUC19載體中，命名為pUC19-IFN質(zhì)粒。所述序列由上海生工生物工程有限公司合成。
1.1.2目的片段和鑒定
用Xho I /Xba I雙酶切上述pUC19_IFN質(zhì)粒，于長(zhǎng)波紫外光下切下500bp條帶，放 在1. 5mLEppendorf管中；加入3倍體積的溶膠液，室溫放置5min，其間輕搖幾次，使膠完全 溶化；加入10 μ L玻璃奶，顛倒混勻，冰浴放置lOmin，間隔2_;3min混勻一次；加入250 μ L漂 洗液，將玻璃奶混勻，12000rpm離心30s，吸棄上清；再重復(fù)洗滌一次，離心后將漂洗液吸干 凈，放入37°C溫箱干燥15-20min ；最后加入適量的蒸餾水，混勻，60°C水浴5min，12000rpm 離心lmin，洗脫上清鑒定后備用。
1.1. 3載體與目的片段連接
以Xho I /Xba I雙酶切pPICZ α A (Invitrogen，USA)載體，酶切產(chǎn)物直接采用玻 璃奶回收，回收產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，大小為3600bp。
取載體1μ 1，1· 2 中回收的目的片段 7μ 1，10χΤ4 ligase buffer 與 T4 DNA ligase 各Ιμ 進(jìn)行連接反應(yīng)，16°C過(guò)夜.
1. 1. 4轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞ToplO
取5ul過(guò)夜連接產(chǎn)物加入IOOul感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋幾次以混勻內(nèi)容物，在冰上 放置30min，再轉(zhuǎn)入42°C循環(huán)水浴中，放置90s，不要搖動(dòng)EP管.將EP管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使 細(xì)胞冷卻l_2min，加入500ulLLB培養(yǎng)基，37°C溫育45min，將200ul感受態(tài)細(xì)胞加入到含 25ug/mlZeocin抗生素的LLB培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌涂布器將轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂在瓊脂平板表面， 于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
1.1.5重組質(zhì)粒鑒定
從培養(yǎng)板上挑取菌落，接入含25ug/ml kocin的5mL LLB液體培養(yǎng)基中，37°C、 220rpm搖床振蕩培養(yǎng)14h，使用天根質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒。具體步驟為取2mL菌 液，12000rpm室溫離心5min，棄上清，用250 μ L細(xì)胞重懸液將細(xì)菌完全懸?。患尤?50 μ L 堿性細(xì)胞裂解液，顛倒6-8次。加入350 μ L中和緩沖液，顛倒6-8次，12000rpm室溫離心 lOmin，將上清轉(zhuǎn)入離心柱中；12000rpm室溫離心lmin，倒掉收集管中的廢液；加入750 μ L 的漂洗液到離心柱中，12000rpm室溫離心lmin，倒掉收集管中的廢液，再加入250 μ L的漂 洗液到離心柱中，12000rpm室溫離心!Min ；將離心柱插入無(wú)菌的1. 5mL Eppendorf管中， 在離心柱中加入10(^1^無(wú)核酸酶的蒸餾水，12000印!11室溫離心lmin，洗脫上清回收備用。 將質(zhì)粒)(ho I /Xba I雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示，已成功將500bp的IFN-β編碼序列插入 PPICZaA載體中，重組質(zhì)粒命名為pPICZaA-IFNb。
進(jìn)一步對(duì)重組質(zhì)粒pPICZaA-IFNb進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證明IFN- β編碼序列按照正確 的位置插入載體中，所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒序列正確。
1. 2.半乳糖化基因工程IFN-β畢赤酵母表達(dá)菌株的構(gòu)建
1. 2. 1制備畢赤酵母GSl 15感受態(tài)并轉(zhuǎn)入質(zhì)粒
將重組質(zhì)粒pPICZaA-IFNb經(jīng)I酶切以使質(zhì)粒線性化，酶切產(chǎn)物在0. 8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并用玻璃奶膠純化回收試劑盒回收備用。
轉(zhuǎn)化在含5mlYPD的50ml離心管中，接種畢赤酵母GSV2培養(yǎng)16小時(shí)。取0. Iml 過(guò)夜培養(yǎng)物，接種于含200ml新鮮YPD的IL搖瓶中，過(guò)夜培養(yǎng)至0D600 = 1. 3。4°C,1500g 離心5min收集細(xì)胞，用200ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞。如上離心，用IOOml預(yù)冷的滅菌水 懸浮細(xì)胞。如上離心，用20ml預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細(xì)胞。如上離心，用200 μ 1預(yù)冷的IM 山梨醇懸浮細(xì)胞。取上述細(xì)胞與純化后的線性質(zhì)粒1 μ g混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0. 2cm電轉(zhuǎn)杯 中。在冰上放置5min。根據(jù)所使用裝置推薦的釀酒酵母參數(shù)(1.3Κν，21Ω，7. 12%is)進(jìn)行 電擊。立即加入Iml預(yù)冷的IM山梨醇，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中，30°C溫育1. 5小時(shí)， 然后涂布于含lmg/ml Zeocin的YPD平板上，30°C培養(yǎng)至平板上長(zhǎng)出菌落。
1. 2. 2工程菌株的獲得
采用斑點(diǎn)免疫印記法篩選工程菌株
將平板上的菌落轉(zhuǎn)至鋪于BMGY固體培養(yǎng)基上的醋酸-硝酸纖維素雙層膜上，培 養(yǎng)48小時(shí)后將雙層膜移到BMMY固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)，每1 在培養(yǎng)皿蓋上補(bǔ)甲醇 IOOyl0 48小時(shí)后，將硝酸纖維素膜用5%脫脂奶粉封閉，依次與抗IFN-β單克隆抗體、酶 標(biāo)二抗反應(yīng)，最后與底物DAB進(jìn)行顯色反應(yīng)。經(jīng)對(duì)數(shù)百個(gè)菌落的篩選，篩選出的高表達(dá)陽(yáng)性 工程菌命名為GI-97。
1.2.3半乳糖基化IFN- β的搖瓶表達(dá)
誘導(dǎo)表達(dá)接種GI-97至BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh。離心收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基 重懸，于開(kāi)始誘導(dǎo)培養(yǎng)，每1 補(bǔ)充的甲醇至1 %和PTM鹽至1 %，每24h補(bǔ)充酪蛋白水 解物至1%，誘導(dǎo)培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE鑒定，表達(dá)的蛋白與唾液酸糖基化和非半乳糖基化 的IFN-β分子量間均存在差異。
Western印跡實(shí)驗(yàn)鑒定離心取上清，經(jīng)TCA-丙酮沉淀誘導(dǎo)蛋白，具體步驟如下 取IOOOul上清于EP管中，加入1/9體積的100% TCAjMgj 10次混勻。樣品置于冰浴中大 于0. 5h，過(guò)夜效果更好。15000g，離心10-20min，可見(jiàn)有棕黑色沉淀，倒掉上清，將EP管倒 扣在吸水紙上輕輕控幾下，除去殘余在管口的液體。加入200ul冰冷的丙酮，用手指輕彈EP 管，洗去管底和管壁殘余的TCA。15000g，離心10-20min，倒掉上清，將EP管倒扣在吸水紙 上輕輕控幾下，除去殘余在管口的液體。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，并以1 500的小鼠抗 人IFN-B單克隆抗體為一抗，1 1000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，進(jìn)行 Western印跡實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GI-97表達(dá)的重組IFN-β可被單抗特異性識(shí)別。
1.3.半乳糖基化基因工程IFN-β的發(fā)酵與純化
1. 3. 1 發(fā)酵
接種5ml GI-97至500ml YPD培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)M小時(shí)作為種子液。在5L發(fā)酵 罐中(B. Braun)加入4L FM22培養(yǎng)基，滅菌后，加入8ml PTM鹽，并以氨水調(diào)pH5. 0，將種子 液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，培養(yǎng)約M小時(shí)后，甘油耗盡。此時(shí)流加50%甘油，1小時(shí)后停止流加，3小 時(shí)后逐漸流加甲醇開(kāi)始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)持續(xù)60小時(shí)，離心收集發(fā)酵上清。
1. 3. 2 純化
采用含0. IM NaCl的0. 05M NaH2PO4-Na2HP O4緩沖液(磷酸緩沖液)平衡藍(lán)色瓊 脂糖凝膠層析柱，發(fā)酵上清用IM NaOH調(diào)pH7. 2后上樣。流速為5ml/min，用含2M NaCl的 磷酸緩沖液淋洗，最后用含2M NaCl，50%乙酰乙二醇的磷酸緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，所收集的^Onm峰值蛋白用磷酸緩沖液透析，并采用PEG包埋法濃縮，低溫保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2.半乳糖基化的基因工程IFN-β的糖鏈結(jié)構(gòu)測(cè)定
分別采用內(nèi)切-β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(New England Biolabs)從純化后 的 IFN 糖蛋白上切下糖鏈，并且采用 Qproteome O-Glycan Glycoprotein Kit(Qiagen, German)純化，采用質(zhì)譜法對(duì)其糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定，確認(rèn)IFN-β的N-糖基化修飾具有 GalGlcNAcMan5GlcNAcGlc2 的糖鏈結(jié)構(gòu)(圖 1)。
實(shí)施例3. IFN-β的生物活性鑒定
3. IWISH細(xì)胞的培養(yǎng)
取保存于液氮中的WISH細(xì)胞株(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供)，37°C水 浴解凍，1500Xg離心后用10%小牛血清的1640培養(yǎng)液懸浮，移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入適量培 養(yǎng)液置于含5% CO2的37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，每2-3天傳代一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液， 用PBS洗2次后消化并收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液稀釋成2. 5x10s個(gè)細(xì)胞/ml。接種于96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔IOOul。37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)4-6小時(shí)。將不同稀釋度的待測(cè)樣品 加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔IOOul0 37V,5% CO2條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)。
3. 2VSV病毒液的制備
用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液按100倍稀釋VSV病毒液，按種于生長(zhǎng)良好的單 層Wish細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，至細(xì)胞病變達(dá)75% -80%時(shí)，反復(fù)凍融、吹打，2000Xg離心10分 鐘，收集上清，滴定效價(jià)。
3. 3 攻毒
取制備的細(xì)胞培養(yǎng)板，甩去上清，加入提前稀釋好的VSV病毒液，攻毒劑量為 IOOTCID5q，每孔IOOul0 37V,5% CO2條件下培養(yǎng)M小時(shí)。每孔加入0. 05%的結(jié)晶紫染色 液50 μ 1，室溫放置30分鐘。用洗瓶小心沖去染色液，每孔加入100 μ 1脫色液(50%乙醇， 0. 1 %乙酸)，室溫放置5分鐘，測(cè)定波長(zhǎng)570nm的吸光值，結(jié)果如表1所示。
表1不同IFN-β生物活性測(cè)定
權(quán)利要求
1.一種半乳糖基化基因工程干擾素，其特征在于用基因工程方法生產(chǎn)，為具有N-糖基 化修飾的糖蛋白，修飾糖鏈的末端為半乳糖殘基。
2.權(quán)利要求1所述的半乳糖基化基因工程干擾素，所述干擾素具有優(yōu)于普通干擾素的 肝靶向性。
3.權(quán)利要求1或2所述的半乳糖化基因工程干擾素，其中所述的N-糖基化的位點(diǎn)是天 然存在的。
4.權(quán)利要求1或2所述的半乳糖化基因工程干擾素，其中所述的N-糖基化的位點(diǎn)是通 過(guò)突變引入的。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的半乳糖化基因工程干擾素，其中所述干擾素具有如 SEQID NO :1所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的半乳糖化基因工程干擾素，其中所述修飾糖鏈末端的 結(jié)構(gòu)為 GalGlcNAcMan5GlcNAc2 或 Gal2GlcNAcMan5GlcNAc2。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的半乳糖基化基因工程干擾素，其中所述的基因工程方法 包括用糖基工程化畢赤酵母進(jìn)行生產(chǎn)。
8.一種制備半乳糖基化基因工程干擾素的方法，該方法包括a)根據(jù)畢赤酵母密碼子 偏嗜性設(shè)計(jì)并合成編碼所述干擾素蛋白分子的cDNA ；b)將所述cDNA克隆至表達(dá)載體并導(dǎo) 入畢赤酵母中構(gòu)建表達(dá)工程菌；c)誘導(dǎo)所述工程菌表達(dá)重組干擾素；d)從培養(yǎng)液中純化重 組干擾素。
9.權(quán)利要求8所述的制備半乳糖基化基因工程干擾素的方法，其中所述的干擾素蛋白 分子的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域。本方面提供了具有更高肝臟靶向性的基因工程干擾素，所述基因工程干擾素具有N-糖基化修飾，糖鏈末端具有半乳糖分子，在動(dòng)物和人體內(nèi)具有明顯的肝靶向性，使所述基因工程干擾素更有利于病毒性肝炎的治療。
文檔編號(hào)C12N15/20GK102030823SQ201010204389
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者宋海峰, 王清清, 董立厚, 高新 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所