專利名稱：油菜類BnGLPP蛋白基因的抗旱性基因工程應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體是涉及油菜類BnGLPP蛋白基因的抗旱性基因工程應(yīng)用。
背景技術(shù)：
BnGLPP為發(fā)明人首次從油菜花粉中克隆到的花粉蛋白編碼基因，有關(guān)該基因的克隆及其編碼蛋白在油菜花粉形成及萌發(fā)過程中的作用還不清楚，查閱文獻(xiàn)未見相關(guān)報道，推測該蛋白可能參與油菜花粉粒萌發(fā)過程中。BnGLPP蛋白及其編碼基因的作用與應(yīng)用現(xiàn)狀還處于空白現(xiàn)狀，僅有的確切作用與 功能研究為本專利要求中提到的實例，主要包括在正常生長條件下BnGLPP基因僅在花粉中表達(dá)，在干旱和低溫脅迫下，該基因可在葉片中表達(dá)，屬于逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)類型基因。鑒于BnGLPP基因的表達(dá)特性，即受干旱和低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，表明該基因可能參與植物逆境應(yīng)答，與植物抗逆性能力有關(guān)，過量表達(dá)BnGLPP轉(zhuǎn)基因水稻抗旱性鑒定為上述論點提供了確切的證據(jù)。植物抗旱、抗寒和耐鹽性機理存在較大的交集，尤其是通過滲透調(diào)節(jié)方式提高植物抗旱性的同時都不同程度地提高相應(yīng)植物的抗寒和耐鹽能力，因此BnGLPP也可作為優(yōu)異基因資源改良轉(zhuǎn)基因植物的抗寒和耐鹽性狀。此外，蛋白主要在花粉中高水平表達(dá)表明該基因及其編碼蛋白可能與植物的花粉育性有關(guān)，可作為創(chuàng)制不育系材料的靶基因加以應(yīng)用。綜上所述，油菜類BnGLPP蛋白及其編碼基因的作用與應(yīng)用前景主要包括通過遺傳修飾以及轉(zhuǎn)基因途徑改良植物的抗旱、抗寒性和耐鹽能力，以及創(chuàng)制雄性不育系材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種油菜BnGLPP蛋白基因的抗旱性基因工程應(yīng)用，該基因的cDNA及其編碼氨基酸序列見SEQl和SEQ2。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種油菜類BnGLPP蛋白基因的抗旱性基因工程應(yīng)用。是下述核苷酸序列之一a)序列表中SEQl所示的cDNA序列序列；b)可與序列表中SEQl限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述的基因，其特征在于，與序列表中SEQl限定的DNA序列雜交的條件為
O.I X SSPE或O. 1XSSC、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下洗膜。所述的基因，其特征在于，該基因編碼一個類葡聚糖酶蛋白。所述的基因，其特征在于，該基因受干旱和低溫脅迫下后上調(diào)表達(dá)。所述的基因，其特征在于，該基因過量表達(dá)明顯提高受體植物對干旱的抗性。含有所述基因的表達(dá)載體。含有所述基因的宿主菌。所述基因在植物抗干旱改良中的應(yīng)用。所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
所述的應(yīng)用，其特征在于包括I)油菜總RNA的提?。?)油菜類葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的克隆以步驟I)獲得的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，設(shè)計兩端引物對BnPfl和 BnPrl，BnPfl 5-ATGTCAACTTTCTTGATGAG-3, BnPrI 5-TGGTTTATACTCATAGTGGCA-3,進(jìn)行PCR擴增獲得油菜類葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的cDNA序列SEQl ；
3)植物表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)油菜類葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的cDNA序列序列SEQl，設(shè)計擴增出包含完整編碼閱讀框的引物，并在上游引物BnPf2和下游引物BnPr2上分別引入限制性內(nèi)切酶位點Bgl II和BstE II，BnPf2和BnPr2引物序列為 BnPf2 5-AGATCTATGTCAACTTTCTTGATGAG-3, BnPr2 5-GGTGACCTGGTTTATACTCATAGTGGCA-3 ；以步驟2)中獲得的經(jīng)測序證實含有BnGLPP cDNA質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴增后，將BnGLPP的cDNA再次克隆至中間載體pGEM-T，利用Bgl II和BstE II雙酶切獲得目的基因，將BnGLPP克隆至雙元表達(dá)載體PCAMBIA3301，測序鑒定確保表達(dá)載體中編碼區(qū)閱讀框架正確，獲得含有 BnGLPP 基因的重組載體 pCAMBIA3301 =BnGLPP ；4)轉(zhuǎn)基因植株獲得將步驟3)獲得的表達(dá)載體pCAMBIA3301 =BnGLPP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入水稻品種，經(jīng)過PCR擴增驗證得到轉(zhuǎn)BnGLPP基因的水稻。一種含有油菜BnGLPP基因的抗旱植物表達(dá)載體。所述的表達(dá)載體，其特征在于是將BnGLPP基因克隆至克隆至雙元表達(dá)載體PCAMBIA3301的Bgl II和BstE II雙酶切位點所得。所述的表達(dá)載體在構(gòu)建具有抗旱能力轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。SEQl =BnGLPP基因的全長cDNA序列；核苷酸序列堿基組成155 a, 124 c，107 g,159 tATGTCAACTTTCTTGATGAGGATACTTCTTTCTTTGCTCGTCTTAGCATTGACAATTCCTCAACAGTCAGGTAATAATATCACTGAAATGTTCAAACTTGTGCACCTATATGCTGTCTTTTTCCTTATGAAAGATGTATCTATATACACAGAGGCAGAGTCGGAACAGTGGTGCATAGCAGATGAACAAACGCCAGACGATGAGTTGCAAGCAGCCTTAGACTGGGCTTGCTCGAAAGGCGGAGCAGACTGCAGCAAAATGCAGCAGGAAAACCAGCCTTGCTTCTTGCCCAACACAATCAGGGATCATGCCTCTGTTGCCTTTAACAGTTATTACCAAACATATAAGCACAAAGGTGGCTCTTGTTACTTCAAAGGCGCTGCCATGATCACTGAGCTTGACCCAAGTAAATTTTATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTAATTGAATCCTTTGAAACTTAGCTTATAGTGAACCAACAGTTGACTGATCCGGATATGATTGGAACAGGTCATGGTTCTTGCCACTATGAGTATAAACCASEQ2 =BnGLPP基因基因編碼的蛋白氨基酸序列MRILLSLLVLALTIPQQSGNNITEMFKLVHLYAVFFLMKDVSIYTEAESEQffCIADEQTPDDELQAALDWACSKGGADCSKMQQENQPCFLPNTIRDHASVAFNSYYQTYKHKGGSCYFKGAAMITELDPSKFYLSLSLSLSL本發(fā)明的工作原理與效果本發(fā)明涉及基因BnGLPP為油菜中首次報道的類葡聚糖酶蛋白基因，mRNA表達(dá)分析結(jié)果顯示該基因在油菜花粉中高豐度表達(dá)，在葉片和莖部受低溫和干旱誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炞C明該基因的過量表達(dá)提高了水稻對干旱和低溫的抗性。因此，BnGLPP可作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锏目箍购岛湍偷蜏啬芰Α?br>

圖I轉(zhuǎn)BnGLPP基因水稻抗旱性鑒定I :
5葉期I心轉(zhuǎn)基因及其對照斷水處理15天(A)及回水處理I天時的表現(xiàn)(B)圖2轉(zhuǎn)BnGLPP基因水稻抗旱性鑒定2:2葉期I心轉(zhuǎn)基因及其對照斷水處理15天圖3組成型表達(dá)載體pCAMBIA3301 =BnGLPP酶切鑒定M :DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000) ;1_2，分別為重組載體 pCAMBIA3301 : :BnGLPP 及其雙酶切鑒定樣品.圖4轉(zhuǎn)基因再生植株P(guān)CR檢測(T0代)MM =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000) ； I =BnGLPP陽性對照；2_3 :水樣空白和非轉(zhuǎn)基因DNA對照；4-17 :不同轉(zhuǎn)基因再生水稻株系。圖5部分轉(zhuǎn)基因株系BnGLPP轉(zhuǎn)錄表達(dá)半定量PCR檢測1-2分別為水樣空白和非轉(zhuǎn)基因DNA對照；3_8分比為不同轉(zhuǎn)基因株系樣品
具體實施例方式油菜類葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的基因工程應(yīng)用，包括I))總RNA的提取選用雙低油菜雜交種“雜雙4號”，待花蕾期(花前2天)取健康完整的花蕾，用無菌處理后的鑷子在超凈工作臺中剝?nèi)⊥暾幕ㄋ?，液氮冷凍，保存于_80°C冰箱；取部分花藥，在液氮條件下用研缽充分研磨，轉(zhuǎn)移入盛有Trizol裂解液的離心管中，充分振蕩后，抽提總RNA，電泳鑒定總RNA質(zhì)量，紫外分光光度計檢測總RNA的濃度。(4)油菜類葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的克隆設(shè)計兩端引物對BnPfl 和 BnPrl，BnPfl 5-ATGTCAACTTTCTTGATGAG-3, BnPrl 5-TGGTTTATACTCATAGTGGCA-3，將步驟I)獲得的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此為模板用高保真Taq酶進(jìn)行PCR擴增，PCR擴增程序如下94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性40 S，50°C復(fù)性40 3，721延伸1.5 min，32個循環(huán)后，72°C延伸8 min，最后用普通Taq酶72°C保溫8 min以便末端加A后克隆至pGEM-T載體，測序獲得油菜類葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的cDNA序列SEQl。(5)植物表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)油菜類葡聚糖酶蛋白基因BnGLPP的cDNA序列序列SEQ1，設(shè)計擴增出包含完整編碼閱讀框的引物，并在上游引物BnPf2和下游引物BnPr2上分別引入限制性內(nèi)切酶位點Bgl II和BstE II，BnPf2和BnPr2引物序列為 BnPf2 5-AGATCTATGTCAACTTTCTTGATGAG-3, BnPr2 5-GGTGACCTGGTTTATACTCATAGTGGCA-3 ；以步驟2)中獲得的經(jīng)測序證實含有BnGLPP cDNA質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴增后，將BnGLPP的cDNA再次克隆至中間載體pGEM-T，利用Bgl II和BstE II雙酶切獲得目的基因，將BnGLPP克隆至雙元表達(dá)載體PCAMBIA3301，測序鑒定確保表達(dá)載體中編碼區(qū)閱讀框架正確，獲得含有 BnGLPP 基因的重組載體 pCAMBIA3301 =BnGLPP0
載體鑒定見圖4。(6)轉(zhuǎn)基因植株的獲得將步驟3)獲得的表達(dá)載體pCAMBIA3301 : =BnGLPP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌宿主菌菌株EHA105，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入旱敏感水稻品種“Kittake”，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定，并進(jìn)行加代繁殖至純合(T3代)，在繁殖加代過程中同時使用BASTA噴施去除分離株，以及PCR鑒定核實，確保轉(zhuǎn)基因后代含有目的基因BnGLPP，將生長至5葉期I心的轉(zhuǎn)基因T4代植株及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ者M(jìn)行斷水干旱脅迫15天，而后恢復(fù)供水觀察吸水復(fù)漲情況，結(jié)果顯示在干旱15天之后轉(zhuǎn)基因及對照均出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因植株的含水量略高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，在?fù)水處理I天后轉(zhuǎn)基因植株均能復(fù)漲堅挺，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ找虺霈F(xiàn)永久性萎蔫迅速倒伏(圖I);與此同時，將將生長至2葉期I心的轉(zhuǎn)基因T4代植株及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ者M(jìn)行斷水干旱脅迫15天，調(diào)查轉(zhuǎn)基因植株及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑拇婊盥?，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株存活率為100%，而對照 的存活率在15%左右(圖2)。上述結(jié)果表明過量表達(dá)BnGLPP可顯著調(diào)高轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性，BnGLPP基因可作為抗旱優(yōu)異基因進(jìn)行植物抗逆性改良加以應(yīng)用。I)轉(zhuǎn)基因植株的檢測結(jié)果提取分化成株水稻葉片總DNA，質(zhì)量及濃度檢測后作為DNA擴增模板，以表達(dá)載體PCAMBIA3301 =BnGLPP構(gòu)建引物BnPf 2和BnPr2對上述模板進(jìn)行PCR擴增檢測，結(jié)果顯示所獲得的41個水稻再生單株均能擴增出目的片段，片段大小與預(yù)期相符，測序結(jié)果同樣證實所擴產(chǎn)物為目的基因。(I)轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)水平等數(shù)據(jù)和圖片提取T4代純合株系及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?葉I心期葉片總RNA，檢測質(zhì)量濃度調(diào)整之后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，采用半定量PCR對上述轉(zhuǎn)基因株系中BnGLPP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平進(jìn)行檢測，同時以水稻組成型表達(dá)基因actin作為內(nèi)參，BnGLPP和actin擴增引物分別為BnPf3和BnPr3，以及Acfl and Acrl0 BnGLPP基因引物序列為:ACTTCTTTCTTTGCTCGTCTTAG, GAGGCATGATCCCTGATTG ；actin 基因引物序列為CGGGAAATTGTGAGGGACAT, AGGAAGGCTGGAAGAGGACC。擴增結(jié)果顯示，在供試轉(zhuǎn)基因株系中均能檢測到外源目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而空白對照及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瘴匆娤鄳?yīng)條帶，但是表達(dá)水平存在較大差異，這可能是外源基因整合的拷貝數(shù)差異，或則是外源基因插入位點所致。
權(quán)利要求
1.一種油菜類BnGLPP蛋白基因的抗旱性基因工程應(yīng)用，是下述核苷酸序列之一 1)序列表中SEQl所不的cDNA序列序列； 2)可與序列表中SEQl限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因，其特征在于，與序列表中SEQl限定的DNA序列雜交的條件為O. IXSSPE或0.1XSSC、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下洗膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基因，其特征在于，該基因編碼一個類葡聚糖酶蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基因，其特征在于，該基因受干旱和低溫脅迫下后上調(diào)表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基因，其特征在于，該基因過量表達(dá)明顯提高受體植物對干旱的抗性。
6.含有權(quán)利要求I 5之一所述基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求I 5之一所述基因的宿主菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求I 5之一所述基因在植物抗干旱改良中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體是涉及油菜類BnGLPP蛋白基因的抗旱性基因工程應(yīng)用。本發(fā)明涉及基因BnGLPP為油菜中首次報道的類葡聚糖酶蛋白基因，mRNA表達(dá)分析結(jié)果顯示該基因在油菜花粉中高豐度表達(dá)，在葉片和莖部受低溫和干旱誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炞C明該基因的過量表達(dá)提高了水稻對干旱和低溫的抗性。因此，BnGLPP可作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锏目箍购岛湍偷蜏啬芰Α?br> 文檔編號C12N15/84GK102911951SQ201210299279
公開日2013年2月6日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者張保剛, 張燦, 吳照華, 岳繼承, 李洪生, 黃德偉, 翟從文, 江麗容 申請人:安徽綠億種業(yè)有限公司