專利名稱：棉花曲葉病毒檢測用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，具體地說涉及棉花曲葉病毒檢測用引物。
背景技術(shù)：
棉花曲葉病毒(Cottonleaf curl virus，CLCuV)為雙生病毒科(Geminiviridae) 菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)成員，病毒粒體為雙聯(lián)體結(jié)構(gòu)。該病毒自然寄主有海 島棉、咖啡、黃葵、黃麻、木槿等，侵染棉花導(dǎo)致棉花曲葉病(Cotton leaf curl disease, CLCuD)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在巴基斯坦，僅1992 1995年間CLCuD造成的經(jīng)濟(jì)損失就 超過50億美元。我國是世界上最大的棉花生產(chǎn)國和消費(fèi)國，棉花生產(chǎn)對我國棉花產(chǎn)業(yè)發(fā) 展意義重大。該病毒由煙粉虱傳播，目前傳播CLCuD的煙粉虱已遍及我國各棉區(qū)，危害呈逐 年上升趨勢，因而一旦該病毒傳入我國，極有可能導(dǎo)致CLCuD的大發(fā)生，其后果不堪設(shè)想。 鑒于該病毒對我國棉花生產(chǎn)已具有十分嚴(yán)重的潛在威脅，因此有必要開展該病毒的檢測工 作。酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)是植物病毒 檢測工作中使用最廣泛的一種方法，不過該方法需要高質(zhì)量的抗血清。然而粉虱傳雙生病 毒在血清學(xué)上密切相關(guān)，即由一個成員制備的血清會與同一屬的其它成員產(chǎn)生非特異性反 應(yīng)，因而難以采用ELISA方法來準(zhǔn)確檢測棉花曲葉病毒。近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分子檢測 領(lǐng)域的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerasechain reaction, PCR)為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)提供了解 決方案。本發(fā)明選擇CLCuV保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)用于PCR檢測的特異性引物，通過PCR擴(kuò)增建 立了 CLCuV的分子檢測方法，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)特異性擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于棉花曲葉病毒PCR檢測的弓丨物序列。本發(fā)明通過分析已報(bào)道的CLCuV保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)檢測用特異性引物。所述的引 物對由正向和反向引物組成，其核苷酸序列如序列表CLCuVf& CLCuVr所示。本發(fā)明還進(jìn)一步給出了應(yīng)用上述引物的PCR檢測方法，其以樣品總DNA為模板，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)特異性擴(kuò)增的IOOSbp DNA片段判定結(jié)果。PCR擴(kuò)增過程如下反應(yīng)體系為20 μ L，即在0. 2mL的PCR反應(yīng)管中加入樣品總DNA 2 μ L為模板，2 μ L 10 X buffer(含 Mg2+)、0·5μ L dNTP、1 對引物(10 μ mol/L)各 0. 5 μ L、2U/μ L Taq DNA 聚 合酶 lyL、DEPC7jC 13. 5 μ L0反應(yīng)程序?yàn)?4°C8min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin, 30 個循環(huán)；72°C 8min。進(jìn)一步，還可以將本發(fā)明引物及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。本發(fā)明根據(jù)棉花曲葉病毒保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，用于CLCuV的PCR檢測。本發(fā)明 檢測方法具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，能夠快速準(zhǔn)確地判斷樣品是否有CLCuV，為該病毒的檢測提供了保證。


圖1是應(yīng)用PCR檢測棉花曲葉病毒的結(jié)果，其中，M為DL2000DNA ladder，1為 CLCuV發(fā)病棉花葉片，2為南瓜曲葉病毒(Squashleaf curl virus, SLCV)陽性材料，3為健 康棉花葉片。圖2是本發(fā)明檢測方法的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果，其中，M為DL2000DNA ladder，l 6為 發(fā)病樣本，20 μ L 反應(yīng)體系中總 DNA 分別為 3 μ L，2 μ L，1 μ L，0. 5 μ L，0. 25 μ L，0. 125 μ L。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)和合成根據(jù)CLCuV保守區(qū)(GenBank No. AJ00242)的公開序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列為CLCuVf (正向)5，-ATTATGTCGAAGCGAGCTGC-3，CLCuVr (反向)5，-AGCTCTGGGAGTGCACAAGT-3，實(shí)施例2總DNA的提取(CTAB法)1)取病葉1. 5g于液氮中磨碎，加6mL 2-ME/CTAB抽提液混勻后轉(zhuǎn)入50mL離心管 中，于65°C溫浴Ihr，不時(shí)混勻；2)用等體積的氯仿/異戊醇(24 1)抽提，IOOOOrpm離心5min ；3)回收上相，加入等體積的CTAB沉淀液，顛倒混勻，于65°C溫浴Ihr ；4) IOOOOrpm離心5min，移出上清，用1. 5mL高鹽TE緩沖液重懸沉淀，加2倍體積
無水乙醇沉淀核酸；5) 12000rpm 離心 15min，70% 乙醇洗滌；6)37°C干燥后，溶于IOOyL MilliQ水中，_20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例3PCR擴(kuò)增方法的建立以總DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μ L，在0. 2mL的PCR反應(yīng)管中加 入樣品總 DNA 2yL 為模板，2yL IOXbuffer (含 Mg2+)、0· 5 μ L dNTP、1 對引物(10 μ mol/ L)各 0· 5 μ L、2U/ μ L TaqDNA 聚合酶 1 μ L、DEPC 水 13. 5 μ L。反應(yīng)程序?yàn)?4°C8min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin, 30 個循環(huán)；72°C 8min。實(shí)施例4 CLCuV PCR方法的特異性確定以表現(xiàn)癥狀的棉花葉片總DNA為模板，以健康葉片和ToGMOV作為對照，通過PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)CLCuV特異性擴(kuò)增DNA片段(IOOSbp)的位置判定結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果以表現(xiàn)癥狀的棉花葉片總DNA為模板，通過PCR檢測可觀察到IOOSbp的特異性擴(kuò) 增片段，而健康對照和ToGMOV則沒有特異性擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)。說明建立的PCR對CLCuV具 有良好的特異性，可將CLCuV與其同屬的ToGMOV區(qū)分開來，結(jié)果見圖1。實(shí)施例5 CLCuV RT-PCR方法的靈敏度確定在 20 μ L 反應(yīng)體系中，總 DNA 分別為 3 μ L，2 μ L，1 μ L，0· 5 μ L，0· 25μ L，0. 125 μ L。檢測結(jié)果如圖2所示。表明建立的PCR方法可從0. 25 μ L總DNA中成功檢測出CLCuV，具有 較高的靈敏度，符合檢測的要求。
權(quán)利要求
1.一種棉花曲葉病毒檢測用引物，其核苷酸序列為 CLCuVf :5’ -ATTATGTCGAAGCGAGCTGC-3’CLCuVr :5’ -AGCTCTGGGAGTGCACAAGT-3，。
2.一種檢測棉花曲葉病毒的方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)特異性擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于擴(kuò)增的退火溫度為56°C，延伸溫度為72°C。
4.含有權(quán)利要求1所述棉花曲葉病毒檢測用引物的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種棉花曲葉病毒檢測用引物，所述引物的核苷酸序列如序列表CLCuVf& CLCuVr所示。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了檢測棉花曲葉病毒的方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)特異性擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果。本發(fā)明引物特異性好，檢測方法快速簡單，靈敏度高，為進(jìn)出口安全提供了保證。
文檔編號C12N15/11GK102102133SQ201010528788
公開日2011年6月22日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者張永江, 朱水芳, 李明福, 李桂芬, 相寧, 趙文軍, 魏梅生 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院