專利名稱：一種甲型h1n1流感病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物病毒領(lǐng)域，涉及流感病毒株，具體涉及一種甲型Hmi病毒的新 毒株及其用途。
背景技術(shù)：
流感病毒分為甲、乙、丙三型，甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，流感大流行就是甲 型流感病毒出現(xiàn)新亞型或舊亞型重現(xiàn)引起的。流感甲型病毒的表面抗原會經(jīng)常發(fā)生細(xì)小變 異，這種變異被稱為“飄變” (drift)，形象地說，“飄變”就是病毒通過細(xì)小的變化偽裝自己， 從而達(dá)到躲避人體免疫系統(tǒng)識別的目的。甲型流感病毒“飄變”的結(jié)果是每年引發(fā)流感的 毒株都有可能不同，人們每年都需要重新接種流感疫苗進行預(yù)防?！稗D(zhuǎn)變”(shift)主要是 以前流行于人和動物的流感病毒基因片段重組的結(jié)果，導(dǎo)致一種新的病毒“亞型”出現(xiàn)。因 為人體內(nèi)幾乎沒有抵御這種新生病毒的抗體，所以“轉(zhuǎn)變”的結(jié)果往往會導(dǎo)致流感的全球性 大暴發(fā)。2009年4月，始發(fā)于北美的甲型Hmi流感，是北美豬重組株Hmi和歐亞豬流感 Hmi病毒重組而成，它包含了人、禽、豬三個來源的基因片段，并且通過了幾次重組。2009 年6月，WHO宣稱此次流感疫情為全球流感大流行。甲型流感病毒是引起人、畜、禽感染的重要人畜共患病毒病原，并可在世界范圍引 起人群發(fā)生流感大流行。接種流感疫苗是避免患流感最有效的方法。由于流感病毒經(jīng)常變 異，疫苗使用中的主要問題是毒種的選擇，制造疫苗的毒株力求接近流行株。目前人群流感 病毒的分離主要依靠細(xì)胞培養(yǎng)，也有用雞胚培養(yǎng)，鑒定型與亞型采用血凝抑制、免疫熒光、 RT-PCR等。2009年的12月，我國上海市區(qū)哨點醫(yī)院發(fā)生的流感樣患者，鑒定為新甲型Hmi 流感病毒。流感流行伴隨著死亡率的增加。增加的死亡率不僅僅由流感和肺炎引起，也與 流感引起的心肺疾病和其他慢性病惡化有關(guān)。因此，豐富病毒庫，完善對該病原引起感染監(jiān) 測體系是對預(yù)防、抑制甲型流感病毒有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株新型甲型Hmi流感病毒。為甲型Hmi流感病毒全基因 片段變異監(jiān)測提供生物信息，利用該株甲型Hmi流感病毒制備動物免疫血清，為甲型Hmi 的HA蛋白變異提供生物信息。本發(fā)明另一個目的是提供上述病毒株的制備方法及疫苗研允。本發(fā)明提供了一種甲型Hmi流感病毒，該病毒含有ΗΑ、ΝΑ、NP、PBU PB2、PA、NS、 M共8個片段，8個片段的核苷酸序列分別如說明書核苷酸序列表SEQ ID NO 1_8所示。該 病毒感染MDCK細(xì)胞，可致細(xì)胞產(chǎn)生拉網(wǎng)、團聚變圓、脫落現(xiàn)象。本發(fā)明采用流感樣患者咽拭標(biāo)本進行病毒的分離培養(yǎng)，單克隆熒光抗體鑒定培養(yǎng) 物為甲型流感病毒，RT-PCR鑒定亞型，為甲型Hmi亞型流感病毒。同時提取病毒核酸，采用 HA、NA、PB1、PB2、PA、M、NP、NS的8個片段的特異引物進行8個片段全基因RT-PCR擴增，擴 增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后測序。進入GenBank對8個片段全基因進行搜尋比對，證實8個基因均與 A/California/04/2009 (HlNl)及 WHO 推薦疫苗株 A/California/07/2009 (HlNl) 99% 同源。HA蛋白327位水解位點處氨基酸序列為“IPSIQSR丨GL”，為非高致病力毒株特征。 命名為 A/shanghai/570/2009 (HlNl)，保藏號為 CCTCC NO :V201015，保藏日期2009 年 6 月 10日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學(xué)。具體來說，本發(fā)明提供的甲型Hmi流感病毒A/shanghai/570/2009 (HlNl)，具有8 個片段全基因序列和下述特征1)感染MDCK細(xì)胞引起細(xì)胞拉網(wǎng)、團聚變圓、破碎；2)熒光標(biāo)記單克隆抗體觀察，顯示被感染細(xì)胞有綠色熒光；3)感染細(xì)胞培養(yǎng)上清能凝集雞紅細(xì)胞4) HA全基因序列與最早分離株A/California/04/2009 (HlNl) 99 %同源5) NA全基因序列與最早分離株A/Cal ifornia/04/2009 (HlNl) 99%同源6)PBl 全基因序列與最早分離株 A/California/04/2009(H1N1)99% 同源7)PB2 全基因序列與最早分離株 A/California/04/2009(H1N1)99% 同源8) PA全基因序列與最早分離株A/Cal ifornia/04/2009 (HlNl) 99%同源9) M全基因序列與最早分離株A/Cal ifornia/04/2009 (HlNl) 99%同源10) NP 全基因序列與最早分離株 A/Cal ifornia/04/2009 (HlNl) 99 % 同源11) NS 全基因序列與最早分離株 A/Cal ifornia/04/2009 (HlNl) 99 % 同源本發(fā)明提供了上述病毒的制備方法，包括如下步驟(1)取流感樣患者(哨點醫(yī)院)咽拭標(biāo)本，經(jīng)抗生素處理置4°C冰箱，4_5h后接種 于MDCK細(xì)胞，過夜；(2)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，病變細(xì)胞采用甲型流感病毒單克隆熒光抗體檢測，熒光顯 微鏡下觀察鑒定甲型流感病毒；(3)提取病毒 RNA，RNA 反轉(zhuǎn)錄為 c-DNA ；用 ΗΑ、ΝΑ、NP、PB1、PB2、PA、NS、M 共 8 個 片段的引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物測序。所述的抗生素可以是青霉素和鏈霉素。所述的細(xì)胞病變效應(yīng)是指細(xì)胞產(chǎn)生拉網(wǎng)、團聚變圓、脫落現(xiàn)象。步驟(3)中，可以先根據(jù)c-DNA擴增產(chǎn)物的堿基數(shù)鑒定甲型流感病毒亞型；然后再 用8個片段的引物進行PCR擴增。本發(fā)明的病毒株可以用于制備甲型流感病毒診斷試劑。也可以用于制備甲型流感
病毒疫苗。具體而言，本發(fā)明通過下述方法和步驟進行1)樣品采集哨點醫(yī)院流感樣患者咽拭標(biāo)本，保存在含BSA和雙抗的MEM緩沖液， 4h內(nèi)冷鏈運送至實驗室。2)病原體分離培養(yǎng)標(biāo)本經(jīng)抗生素處理置4°C冰箱，4h后接種于MDCK細(xì)胞，在5% C0237°C條件下培養(yǎng)，第二天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，病變細(xì)胞采用甲型、乙型流感病毒單 克隆熒光抗體檢測，熒光顯微鏡下觀察鑒定甲型、乙型流感病毒。3) RT-PCR鑒定用Trizol法提取病毒RNA ；以血凝素基因片段設(shè)計引物， MMLV(takara)37°C作用 Ih 將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 c_DNA ；進行 PCR，循環(huán)條件為94°C 5min ；94°C 30s，51°C 30s, 72°C 30s, 72°C 5min。擴增產(chǎn)物凝膠電泳觀察產(chǎn)物bp數(shù)，鑒定甲型流感病毒亞型。4) 8個片段測序引物RT-PCR及序列分析用Trizol法提取病毒RNA ；用Oligo(dT) 和隨機六核苷酸引物，MMLV(takara) 37°C作用Ih將RNA反轉(zhuǎn)錄為c_DNA ；以血凝素、神經(jīng)氨 酸酶、病毒聚合酶(PB1、PB2、PA)、基質(zhì)蛋白、核蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白8個基因片段設(shè)計引物，進 行 PCR，循環(huán)條件為94°C 5min ；94°C 30s，51°C 30s, 72°C 30s, 72°C 5min。擴增產(chǎn)物凝膠 電泳切割回收提純后在DNA序列自動分析儀上測序。5)8個片段基因進化分析用MEGA4軟件對測序的8個片段基因進行系統(tǒng)發(fā)生分 析構(gòu)建進化樹。結(jié)果顯示1)MDCK細(xì)胞為狗腎二倍體上皮細(xì)胞，細(xì)胞呈上皮樣形態(tài)；細(xì)胞感染流感病毒后可 以出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、拉網(wǎng)等的細(xì)胞病變。采用Dako Cytomation公司制備的IMAGEN 甲、乙型流感(Code no k6106)單克 隆熒光抗體，在熒光顯微鏡下觀察鑒定為甲型流感病毒。2)病毒經(jīng)Oligo (dT)和隨機六核苷酸引物RT為cDNA，經(jīng)HA片段特異引物PCR成 功擴增出Hl亞型43 Ibp目的條帶。3)分離株病毒經(jīng)Oligo (dT)和隨機六核苷酸引物RT為cDNAJ5HA、NA、PB1、PB2、 PA、M、NP、NS的8個片段的特異測序引物PCR成功擴增出1641bp的HA，1376bp的NA，2255bp 的 PB1，2229bp 的 PB2,2098bp 的 PA, 1015bp 的 M, 1492bp 的 NP 和 878bp 的 NS。4)本發(fā)明方法中采用的細(xì)胞系為本領(lǐng)域公知的MDCK細(xì)胞。5)本發(fā)明A/shanghai/570/2009 (HlNl)毒株是上海市2009年12月分離自哨點醫(yī) 院流感患者分離株，與2009年北美豬源甲型Hmi A/California/04/2009 (HlNl)及WHO推 薦疫苗株A/California/07/2009 (HlNl)基因99%同源。本發(fā)明甲型Hmi流感的基因序列 變異提供了重要的生物信息；補充了上海甲型Hmi基因數(shù)據(jù)和病毒毒種株；可用于疫苗的 研究。本發(fā)明屬微生物病毒領(lǐng)域，具體涉及一種新型甲型Hmi流感病毒毒株及其用途。 本發(fā)明通過患者咽拭標(biāo)本分離培養(yǎng)和DIF、RT-PCR鑒定，以及病毒的8個基因全序列測序比 對，證實所分離的病毒為甲型Hmi流感病毒毒株，命名為A/shanghai/570/2009 (HlNl)，保 藏號為CCTCCN0 :V201015。本發(fā)明毒株得到甲型Hmi的8個基因全序列，補充了我國流 感病毒的極有價值的遺傳信息和具有8個基因全序列測序的流感病毒毒種保存，對該病原 引起感染監(jiān)測體系的完善有重要作用。本發(fā)明A/shanghai/570/2009 (HlNl)毒株還可用于 制備甲型Hmi病毒感染的快速診斷試劑和疫苗研究。


圖1是培養(yǎng)液替換為不含病毒是病毒接種液后36小時的正常MDCK對照細(xì)胞。圖2是接種該流感病毒100 TCID50病毒后36小時的MDCK細(xì)胞。圖3是熒光顯微鏡觀察甲、乙型熒光標(biāo)記單克隆抗體染色的正常對照細(xì)胞。圖4為熒光顯微鏡觀察甲、乙型熒光標(biāo)記單克隆抗體染色的感染細(xì)胞。圖5是308bp甲1型流感病毒RT-PCR擴增電泳照片。其中，左第1孔為A/ shanghai/570/2009 (HlNl)，(308bp)；右第 M孔道為 maker (100、200、300、400、500、600bp)。
具體實施例方式采集我國上海市區(qū)哨點醫(yī)院流感樣發(fā)熱患者10例咽拭標(biāo)本進行培養(yǎng)鑒定。經(jīng)細(xì) 胞培養(yǎng)分離到能產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變并能穩(wěn)定傳代增殖的病毒7株，鑒定為甲型Hmi流感病毒。1)病原體分離培養(yǎng)咽拭標(biāo)本處理培養(yǎng)參照WHO推薦的方法，標(biāo)本青霉素、鏈霉素 處理(終濃度均為100ug/ml)大于4h，1500g 4°C離心lOmin，取上清接種于MDCK細(xì)胞，在 5%C02 37°C條件下培養(yǎng)，24h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，病變細(xì)胞經(jīng)DIF 染色，熒光顯微鏡觀察鑒定為甲型流感病毒。2) RT-PCR鑒定細(xì)胞培養(yǎng)液用invitrogen公司TRIzol LS Reagent試劑抽提病 毒核酸。設(shè)計HA片段引物，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega) 37°C作用Ih將RNA反轉(zhuǎn)錄為C-DNA， HA的循環(huán)條件為94°C lmin，54°C lmin，72°C IminX 40, 72°C 7min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝 膠電泳鑒定為新甲型Hmi。3)甲型Hmi流感病毒全基因測序分別采用8個基因片段的測序引物，對8個基因片段進行RT-PCR擴增。細(xì)胞培養(yǎng) 液用Invitrogen公司TRIzol LS Reagent試劑抽提病毒核酸，AMY逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega) 逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件為 42°C lh,95°C 5min。保真 PCR(Ex Taq，TaKaRa)，PCR 條件為94°C， 45s，50°C，45s，72°C，60s，擴增30個循環(huán)，72°C延伸7min。PCR擴增產(chǎn)物送上海市基康生物 技術(shù)有限公司測序。12)結(jié)果顯示，單克隆直接免疫熒光觀察，為甲型流感病毒；RT-PCR證實為甲型 HlNl ；對本發(fā)明病毒的HA基因全序列測序并采用MEGA4. O分析軟件進行同源性分析，證實 所分離株與始發(fā)于北美甲型Hmi最早分離株A/California/04/2009 (HlNl)氨基酸序列有 99%同源甲型Hmi流感病毒。而感染本發(fā)明病毒的MDCK細(xì)胞出現(xiàn)拉網(wǎng)、團縮、脫落的細(xì)胞病變。
權(quán)利要求
一種甲型H1N1流感病毒，其特征在于，該病毒含有HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、NS、M共8個片段，8個片段的核苷酸序列依次分別如SEQ ID NO 1 8所示該病毒的保藏號為CCTCC NOV201015。
2.如權(quán)利要求1所述的病毒，其特征在于，該病毒感染MDCK細(xì)胞，細(xì)胞產(chǎn)生拉網(wǎng)、團聚 變圓、脫落現(xiàn)象。
3.權(quán)利要求1所述的病毒的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)取流感樣患者咽拭標(biāo)本，經(jīng)抗生素處理置4°C冰箱，4-5h后接種于MDCK細(xì)胞，過夜；(2)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，病變細(xì)胞采用甲型流感病毒單克隆熒光抗體檢測，熒光顯微鏡 下觀察鑒定甲型流感病毒；(3)提取病毒RNA，RNA 反轉(zhuǎn)錄為 c-DNA ；用 ΗΑ、ΝΑ、NP、PB1、PB2、PA、NS、M 共 8 個片段 的弓I物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物測序。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的抗生素是青霉素和鏈霉素。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的細(xì)胞病變效應(yīng)是指細(xì)胞產(chǎn)生團 聚變圓、脫落現(xiàn)象。
6.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，先根據(jù)c-DNA擴增產(chǎn)物的 堿基數(shù)鑒定甲型流感病毒亞型；然后再用8個片段的引物進行PCR擴增。
7.權(quán)利要求1所述的病毒的應(yīng)用，其特征在于，該病毒株應(yīng)用于制備甲型流感病毒診 斷試劑。
8.權(quán)利要求1所述的病毒的應(yīng)用，其特征在于，該病毒株應(yīng)用于制備甲型流感病毒疫
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物病毒領(lǐng)域，提供了一種甲型H1N1流感病毒。該病毒含有HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、NS、M共8個片段，其核苷酸序列如說明書核苷酸序列表所示。本發(fā)明通過患者咽拭標(biāo)本分離培養(yǎng)和DIF、RT-PCR鑒定，以及病毒的8個基因全序列測序比對，獲得并證明所分離的病毒為甲型H1N1流感病毒毒株，命名為A/shanghai/570/2009(H1N1)，保藏號CCTCC NoV201015。本發(fā)明的毒株補充了我國甲型流感病毒的極有價值的遺傳信息，對該病原引起感染監(jiān)測體系的完善有重要作用，還可用于制備甲型H1N1病毒感染的快速診斷試劑和疫苗研究。
文檔編號C12R1/93GK101974489SQ201010216388
公開日2011年2月16日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者呂錫宏, 姜慶五, 居麗雯, 蔣露芳 申請人:復(fù)旦大學(xué)