專利名稱：一種新型miRNA和編碼蛋白基因共表達載體的制作方法
一種新型mi RNA和編碼蛋白基因共表達載體本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及一種miRNA和編碼蛋白基因的共表達載體pAAV2mir，該表達載體主要由AAV2的ITR、啟動子、mmvm內(nèi)含子(modified minute virus of mice intron)、以供編碼蛋白基因插入的多克隆位點MCS和BGH poly(A)等元件組成，其中mmvm內(nèi)含子中包含多克隆位點，用于pri_miRNA的插入。使用時將單個或多個pri-miRNA序列插入mmvm內(nèi)含子的多克隆位點之間，同時插入相應(yīng)編碼蛋白基因，實現(xiàn) miRNA和編碼蛋白基因的共表達。并且該載體攜帶AAV2的ITR序列，可進一步包裝成AAV 病毒，依賴于AAV病毒的不同血清型的組織特異性嗜性，實現(xiàn)miRNA和編碼蛋白基因的相對組織特異性表達。本載體可用于miRNA和編碼蛋白基因的共表達以及miRNA功能、miRNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用等研究。背景miRNA (microRNA)是生物體內(nèi)源的長度為18 25個核苷酸的非編碼RNA (Bartel DP. MiRNAs genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell,2004,116(2) 281-297.)。目前，在人類中已發(fā)現(xiàn) 700 多種 miRNA (Griffiths-Jones S. , The mi croRNA Registry, Nucleic Acids Res，2004，32 :D109_D111.)。在體內(nèi)，miRNA 與 AGO 等蛋白形成 RISC(RNA Induced Silencing Complex)，識別并結(jié)合 mRNA 3，UTR 的靶序列，導(dǎo)致mRNA的降解和翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負調(diào)控(Doench JG, Sharp PA. Specificity of microRNA targetselection in translation repression. Genes Dev，2004，18 (5) :504_511.)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與人類大約三分之一基因的表達i周控(Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands ofhuman genes are mi croRNA targets. Cell, 2005，120(1) : 15-20.)，在細胞分裂(Careton Μ, Cleary MA, Linsley PS. MicroRNAs and cell cycle regulation. CellCycle, 2007,6 (17) :2127_2132.)、分化(Iovino N, Pane A, Gaul U. miR-184 hasmultiple roles in Drosophila female germline development. Dev Cell,2009，17(1) 123-133.)、死亡(Ambros V. MicroRNA pathways in flies and worms growth, death, fat, stress, and timing[Erratum Cell,2003,114(2) 269]. Cell,2003,113(6) :673-676.)> _ t (Jovanovic M, Henqartner M0. miRNAs and apoptosis =RNAs todie for. Oncogene,2007,25(46) :6176_6187.)、新陳代謝(Dang CV, Le A, Gao P. MYC—induced cancer cell energy metabolism and therapeutic opportunities. ClinCancer Res, 2009,15(21) :6479_6483.)以及干細胞的分化(Xu N, Papagiannakopoulos Τ, Pan GJ, et al. MicroRNA-145 regulates 0CT4, S0X2, and KLF4 and represses pluripotency in human embryonic stem cells. Cell,2009,137 (4) 647-658.)、月中瘤的發(fā)生(Schichel R, Boyerinas B, Park SM, et al. MicroRNAs :key players in the immune system, differentiation, tumorigenesis andcell death. Oncogene, 2008, 27 (45) :5959_5974.)等諸多生理病理過程中發(fā)揮重要作用。已有的研究表明，miRNA主要通過miRNA表達量的變化和活性改變參與調(diào)節(jié)生理病理過程。多數(shù)癌癥存在miRNA表達異常。如與正常細胞相比較，癌細胞中miR-34a普遍低表達。研究發(fā)現(xiàn)miR-34a啟動子區(qū)存在p53結(jié)合位點，由于癌細胞中p53表達偏低或功能異常，導(dǎo)致miR-34a表達下調(diào)。而miR-34a可抑制細胞周期相關(guān)蛋白的表達，使細胞停滯于 Gl 期(Lin He, Xingyue He, Lee P. Lim, et al. AmicroRNA component of the p53 tumour suppressor network, nature. 2007Jun. 447，1130-1135.)。它還誘導(dǎo)細胞凋亡，并降低SIRTl的表達，阻止p53去乙酰化，誘導(dǎo)p21、PUMA等抑癌基因表達，抑制癌癥的發(fā)生 (MunekazuYamskuchi, Marcella Ferlito, Charles J. Lowenstein. miR-34a repression of SIRTlregulates apoptosis. Proc. Natl. Acad. Scl. USA. 2008. Sep. 105 (36) 13421-13426)。這表明miRNA的表達受到細胞內(nèi)某些蛋白因子的調(diào)節(jié)。而且，在某些癌癥中還發(fā)現(xiàn)miRNA表達基因的缺失或擴增，如慢性淋巴細胞白血病中由于13ql4座位的缺失，miRNA15/miRNA16-l 普遍低表達(Calin GA, Dumitru CD, Shimizu Μ, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 andmiR16 at 13ql4 in chronic lymphocytic leukaemia. Proc Natl Acad Sci USA2002 ；99 15524-15529.) 反由于13q31.3座位的擴增，導(dǎo)致位于該座位的miR17_92 cluster在多種淋巴瘤和實體瘤中高表達(Ota A, Tagawa H, Karnan S, etal. Identification and characterization of a novel gene, C13orf25,as a target for 13q31-q32 amplification in malignant lymphoma. Cancer Res 2004 ；64 :3087_3095· ；Hayashita Y, Osada H, Tatematsu Y, et al. A poIycistronicmicroRNA cluster, miR-17—92, is overexpressed in human lung cancers andenhances cell proliferation. Cancer Res 2005 ;65 :9628_9632.)。同時，越來越多的研究表明，許多細胞中成熟miRNA的數(shù)量與細胞內(nèi)該種miRNA的前體(pre-miRNA) 不成比例(Lee EJ, Baek M, Gusev Y, et al. Systematic evaluationof microRNA processing patterns in tissues, cell lines, and tumors. RNA,2008,14 :35-42.),提示miRNA加工成熟過程中某些因子的缺失或突變可能影響成熟mirRNA的數(shù)量。如miRNA 成熟加工過程中必需的Drosha酶和Dicer酶的功能喪失會影響細胞內(nèi)所有miRNA的加工成熟(Du T, Zamore PD. microPrimer :the biogenesisand function of microRNA. Development 2005,132 4645-4652. He L,Hannon GJ. MicroRNAs small RNAs with a big rolein gene regulation. Nat Rev Genet2004，5 :522_531.)，導(dǎo)致 miRNA 表達的減少。但是，雖然細胞內(nèi)某種miRNA的pri-miRNA并未發(fā)生變化，但隨著外界環(huán)境和細胞生理狀態(tài)的改變，該種miRNA的數(shù)量也會發(fā)生相應(yīng)的變化(Rooij EV, Sutherland LB, Liu N, et al. A signaturepattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy andheart failure. Proc Natl Acad Sci USA,2006，03(48) : 18255—18260.)， 表明細胞內(nèi)每種miRNA可能都存在自己所特有的表達調(diào)控方式。許多表觀遺傳學(xué)因素如 CpG島的甲基化和組蛋白的修飾抑制等也會影響miRNA的表達。Saito Y等研究發(fā)現(xiàn)CpG島甲基化、組蛋白修飾等相關(guān)的表觀遺傳學(xué)藥物會影響膀胱癌細胞中miR127的表達(Saito Y,Liang G,Egger G,et al. Specific activation of microRNA-127 withdownregulation of the proto-oncogene BCL6 by chromatin-modifying drugs inhuman cancer cells. Cancer Cell 2006;9:435-443.)。總之，miRNA的表達異常主要與基因突變、表觀遺傳學(xué)和 miRNA加工過程不正常相關(guān)。因此，利用已知的miRNA表達機制，外源表達miRNA可能會有效補償體內(nèi)或細胞內(nèi)某些miRNA的不足，在某些疾病的治療過程中發(fā)揮作用。Janaiah Kota 等研究發(fā)現(xiàn)在小鼠肝癌模型中表達miR26a可有效地抑制肝癌的發(fā)生(Kota J，ChivukulaRR, 0' Donnell KA, et al. Therapeutic microRNA delivery suppresses tumorigenesis in a murine livercancer model. Cell 2009;137:1005-1017.)。同時，miRNA 的外源表達載體還應(yīng)用于miRNA的功能研究。這些都表明建立一種miRNA的外源表達載體具有重要的研究意義和應(yīng)用前景?，F(xiàn)有的研究表明，miRNA的表達方式存在兩種一種是在RNA Pol II的催化作用下，轉(zhuǎn)錄形成pri-miRNA，經(jīng)Drosha酶加工后得到pre-miRNA，在Exportin5蛋白的協(xié)助下轉(zhuǎn)運進入細胞質(zhì)，再經(jīng)過Dicer酶加工后獲得成熟的miRNA分子；另一種是miRNA位于 hnRNA剪接形成成熟mRNA分子時去除的內(nèi)含子中，剪切下來的內(nèi)含子直接形成pri-miRNA， 進入 miRNA 的成熟加工過程(Lin SL, Miller JD, YingSY. Intronic microRNA (miRNA). J Biomed Biotechnol,2006(4) :1_13.)。因此，常見的miRNA表達載體的構(gòu)建方式也有兩種直接表達和內(nèi)含子表達。在直接表達miRNA時，通常選用RNA Pol II或RNA Pol III 相關(guān)的啟動子。RNA Pol III相關(guān)啟動子的表達強度高，但組織特異性差，不易表達調(diào)控。 相反，RNA Pol II相關(guān)啟動子的表達強度相對較弱，但組織特異性較好，易于表達調(diào)控。因此，人們常根據(jù)不同需要選擇不同類型的表達啟動子。同時，由于只需將pre-miRNA序列之外的兩端大于40bp的側(cè)翼序列克隆入表達載體即可實現(xiàn)miRNA的正常表達(Chen CZ, Li L, Lodish HF, et al. microRNAs modulate hematopoetic lineage differentiation. Science, 2004，83 (303) =83-86.)，因此載體構(gòu)建過程簡單、方便。但表達miRNA的檢測則相對麻煩，且不能持續(xù)檢測其表達情況。我們利用內(nèi)含子表達miRNA時，將miRNA表達相關(guān)序列插入某一基因內(nèi)含子中，直接通過檢測該基因的表達情況來監(jiān)測miRNA的表達情況，而且可實現(xiàn)功能相關(guān)的miRNA和編碼蛋白基因的共同表達。因此，建立一種miRNA和編碼蛋白基因共表達的載體對miRNA 的功能研究以及miRNA和蛋白編碼基因的相互作用研究具有重要意義。目前已報道了幾種利用內(nèi)含子實現(xiàn)miRNA和編碼蛋白基因的共表達的方法。如在美國專利 microRNA vectors (NO. US 2006/0063174 Al)中，Turner DL 等改造 miRNA155 的表達相關(guān)序列BIC并將該序列置于特定的啟動子調(diào)控下，把不同來源的pre-miRNA序列插入該序列，實現(xiàn)了 miRNA和編碼蛋白基因的共表達。在另一份美國專利Novel transgenic methods using (NO. US 2006/0228800 Al)中，Lin SL等利用人工設(shè)計合成的內(nèi)含子，將不同來源的pre-miRNA序列插入該內(nèi)含子中，也實現(xiàn)了 miRNA和編碼蛋白基因的共表達，并用該表達載體過表達某種miRNA，結(jié)果導(dǎo)致了小鼠腫瘤的發(fā)生。p53是一種抑癌基因，P53蛋白為其所編碼表達。文獻報道m(xù)iR34a與P53存在相互作用關(guān)系，首先P53可作為轉(zhuǎn)錄因子，與miR34a啟動子結(jié)合，起始miR34a的表達(He L,He X,Lim L P,et al. A microRNA component of the p53 tumorsuppressor network. Nature, 2007,447(7148) :1130_1134.)；其次，miR34a 能夠調(diào)節(jié) P53 活性，在體內(nèi) miR34a抑制 SIRTl mRNA的翻譯，降低SIRTl的表達，阻止p53去乙酰化使p53保持活性狀態(tài)(Yamskuchi M， Ferlito M, Lowenstein CJ. miR-34a repression of SIRTl regulates apoptosis. Proc Natl Acad Scl USA, 2008,105(36) : 13421-13426.)。在本案中，為了研究 miRNA 與編碼蛋白的相互作用關(guān)系，本案利用了 miR34a能夠調(diào)節(jié)P53活性的機理，構(gòu)建了 miR34a與P53共表達的質(zhì)粒 pAAV2mir34a-CMV-p53。發(fā)明概述
本發(fā)明的技術(shù)特征是構(gòu)建了一種能夠有效實現(xiàn)miRNA和編碼蛋白基因共表達的載體pAAV2mir，利用該載體不僅可以實現(xiàn)功能相關(guān)聯(lián)的miRNA與編碼蛋白基因的協(xié)同表達，還可實現(xiàn)我們感興趣的、特定的miRNA與編碼蛋白基因的組合表達。本發(fā)明的第二個技術(shù)特征是利用內(nèi)含子實現(xiàn)miRNA的表達選擇僅有67nt的mvm內(nèi)含子，在其分子位點BrP前插入多克隆位點，以供外源表達miRNA序列的插入。本發(fā)明的第三個技術(shù)特征是，pAAV2mir 是以本實驗室原來構(gòu)建的重組AAV病毒包裝相關(guān)質(zhì)粒pAAV2ne0 (結(jié)構(gòu)見圖1)為基本骨架， 這樣，pAAV2mir同樣也含有AAV2病毒的ITR序列，因此，由pAAV2mir所構(gòu)建的重組子也可以用于包裝成含有“miRNA與編碼蛋白基因共表達”的“表達單元”的重組AAV病毒。之后，則可以利用AAV病毒的組織特異性實現(xiàn)表達載體的相對靶向性導(dǎo)入。本發(fā)明可應(yīng)用于 miRNA的功能、miRNA與蛋白相互作用研究，也可應(yīng)用于某些疾病的治療。發(fā)明詳述在已有的知識和進展的基礎(chǔ)上，本發(fā)明構(gòu)建了一種能夠有效實現(xiàn)miRNA與編碼蛋白基因共表達的載體pAAV2mir。該表達載體主要由AAV2的ITR、啟動子、mmvm內(nèi)含子、 MCS和BGH poly(A)等元件組成，其中mmvm內(nèi)含子中包含多克隆位點，用于單個或多個 pri-miRNA的插入，同時利用MCS位點插入相應(yīng)編碼蛋白基因，實現(xiàn)miRNA與編碼蛋白基因的共表達。AAV2 ITR序列為一對2型腺相關(guān)病毒的反向末端重復(fù)序列，這一對AAV2的 ITRs可以使該載體實現(xiàn)進一步包裝成AAV病毒，且可以用于包裝各種血清型的AAV，這樣就可以利用依賴于AAV病毒的不同血清型的組織特異性嗜性，實現(xiàn)miRNA的相對組織特異性表達。根據(jù)不同的需求可以選擇不同的Pol II相關(guān)啟動子，例如，需要在體外高效表達miRNA時，則可選用CMV啟動子(cytomegalovirus promoter)；如需在特定的組織(如肝臟)高效持續(xù)表達時，則可選用肝臟特異的CAG啟動子(a combination of chicken beta-actinpromoter and cytomegalovirus immediate-early enhancer)。mmvm 內(nèi)〒以來源于小鼠細小病毒的長度為67nt的mvm內(nèi)含子(minute virus of mice intron)為前體，對mvm內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進行分析后，在其分支點域(Branch-point domain)前插入多克隆位 (MCS) ,I^llmmvm 內(nèi)*〒。BGH poly (A) (bovine growth hormonepolyA signal)
長激素加尾信號序列。在BGH poly(A)和mmvm內(nèi)含子之間設(shè)計了多克隆酶切位點，以供編碼蛋白基因的插入。我們以本實驗室原有的pAAV2ne0 (結(jié)構(gòu)見圖1)和pAAV2ne0-CAG (結(jié)構(gòu)見圖2)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了兩種 pAAV2mir 質(zhì)粒pAAV2mir_CMV 和 pAAV2mir_CAG。pAAV2mir-CMV的構(gòu)建過程詳見實施例2，具體結(jié)構(gòu)如圖6所示，其特征是由AAV2 的ITR、CMV、mmvm、MCS等部分組成，mmvm中含有多克隆位點，便于外源表達miRNA序列的插入，MCS位點則方便于編碼蛋白基因的插入，CMV啟動子可實現(xiàn)miRNA與編碼蛋白基因的高效共表達。pAAV2mir-CAG的構(gòu)建過程詳見實施例3，具體結(jié)構(gòu)如圖7所示，其特征是，與 pAAV2mir-CMV相比，pAAV2mir_CAG主要采用了不同的啟動子CAG，并因此具有了肝臟表達的特異性，可在肝臟特異地持續(xù)表達。其它的基因元件如AAV2的ITR、mmvm、MCS等均與 pAAV2mir-CMV 相同。在此基礎(chǔ)上，本案通過插入不同的pri-miRNA序列和編碼蛋白基因驗證了該表達載體的有效性。
本案首先構(gòu)建了pAAV2mir-CMV-RFP (見實施例 2)、pAAV2mirl42-CMV-RFP 和 pAAV2mirl42/155-CMV-RFP (見實施例4)；然后將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞，24h觀察轉(zhuǎn)染細胞RFP表達情況，并與轉(zhuǎn)染了等量的pAAV2ne0-RFP的細胞比較，發(fā)現(xiàn)RFP表達未見差異(見實施例7)，其中的mmvm內(nèi)含子能夠正常剪接，且加入外源表達的miRNA序列后也未影響mmvm內(nèi)含子的剪接方式和過程。同時，本案也利用miRNA活性檢測載體檢測 了 pAAV2mirl42-CMV-RFP 和 pAAV2mirl42/155_CMV-RFP 所表達的 miR142_3p 和 miR155 的活性(見實施例8)，結(jié)果表明:pAAV2mirl42-CMV-RFP能夠有效地表達miR142_3p， pAAV2mirl42/155-CMV-RFP也能夠有效地表達miR142_3p和miR155。這個結(jié)果表明， pAAV2mir載體可以有效地實現(xiàn)miRNA和編碼蛋白基因的共表達，為miRNA功能研究、miRNA 與蛋白相互作用研究等提供了新的方法和選擇。


圖1 pAAV2ne0質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；Dl 和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨細胞病毒的啟動子；BGH polyA 是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新霉素抗性基因；_pR是氨芐青霉素抗性基因。圖2 pAAV2ne0-CAG質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CAG promoter是由雞β -actin啟動子序列和人巨細胞病毒的早期增強子序列組成的啟動子；BGH polyA是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因。圖3內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖。見實施例1。圖中5' splice site為5'端內(nèi)含子剪接識別位點，通常為GT ；BrP為Branch-point domain的縮寫，即分支位點域；PPT為poly pyrimidine tract的縮寫，即多聚嘧啶序列；3' splice site為3'端內(nèi)含子剪接識別位點，通常為AG。圖4 mmvm內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)示意圖。見實施例1。圖中5' splice site為5'端內(nèi)含子剪接識別位點，通常為GT ；MCS為multiple cloning site的縮寫，即多克隆位點，用于外源表達miRNA相關(guān)序列的插入；BrP為Branch-point domain的縮寫，即分支位點域；PPT 為poly pyrimidine tract的縮寫，即多聚嘧啶序列；3' splice site為3'端內(nèi)含子剪接識別位點，通常為AG。圖5 pAAV2mir結(jié)構(gòu)示意圖。圖中ITR為inverted terminal r印eat的縮寫，即 AAV2病毒基因組的反向末端序列；啟動子通常為CMV或CAG啟動子；mmvm內(nèi)含子含有多克隆位點，以供外源表達miRNA序列的插入；MCS用于編碼蛋白基因的插入，編碼蛋白基因為一些常用報告基因如(EGFP、Glue、RFP、Fluc)和功能基因的編碼區(qū)序列；BGH polyA為牛生長激素加尾信號序列。圖 6 pAAV2mir-CMV 質(zhì)粒圖譜。圖中 ITR 為 inverted terminal r印eat 的縮寫， 即AAV2病毒基因組的反向末端序列；CMV promoter是人巨細胞病毒的啟動子；BGH polyA 是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因； mmvm內(nèi)含子含有多克隆位點，以供外源表達miRNA序列的插入；MCS用于編碼蛋白基因的插入，編碼蛋白基因為一些常用報告基因如(EGFP、Glue, RFP、Fluc)和功能基因的編碼區(qū)序列；BGH polyA為牛生長激素加尾信號序列。
圖 7 pAAV2mir-CAG 質(zhì)粒圖譜。圖中 ITR 為 inverted terminal repeat 的縮寫，即 AAV2病毒基因組的反向末端序列；CAG promoter是由雞β-actin啟動子序列和人巨細胞病毒的早期增強子序列組成的啟動子；BGH polyA是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo 是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；mmvm內(nèi)含子含有多克隆位點，以供外源表達miRNA序列的插入；MCS用于編碼蛋白基因的插入，編碼蛋白基因為一些常用報告基因如(EGFP、Glue、RFP、Fluc)和功能基因的編碼區(qū)序列；BGH polyA為牛生長激素加尾信號序列。圖8 pAAV2mir-CMV-RFP質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨細胞病毒的啟動子； BGH polyA是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；RFP為紅色熒光蛋白基因；mmvm為改造后的mvm內(nèi)含子，含有多克隆位點，以供外源表達miRNA序列的插入。圖9 pAAV2mir-CAG-RFP質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CAG promoter是由雞β -actin啟動子序列和人巨細胞病毒的早期增強子序列組成的啟動子；BGH polyA是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；RFP為紅色熒光蛋白基因；mmvm為改造后的mvm內(nèi)含子，含有多克隆位點，以供外源表達miRNA序列的插入。圖10 pAAV2mir-CMV-Gluc質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨細胞病毒的啟動子；BGH polyA是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；Gluc為Gaussia螢光素酶基因；mmvm為改造后的mvm內(nèi)含子，含有多克隆位點，以供外源表達miRNA序列的插入。圖11 pAAV2mir-CAG-Gluc質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CAG promoter是由雞β -actin啟動子序列和人巨細胞病毒的早期增強子序列組成的啟動子；BGH polyA是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；Gluc為Gaussia螢光素酶基因；mmvm為改造后的mvm內(nèi)含子，含有多克隆位點，以供外源表達miRNA序列的插入。圖12 pAAV2mirl42-CMV-RFP質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨細胞病毒的啟動子；BGH polyA是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；RFP為紅色熒光蛋白基因；mmvm為改造后的mvm內(nèi)含子，并在其中的多克隆位點插入了 pri-miR142序列。圖13 pAAV2mirl42/155-CMV-RFP質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨細胞病毒的啟動子；BGH polyA是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；RFP為紅色熒光蛋白基因；mmvm為改造后的mvm內(nèi)含子，并在其中的多克隆位點插入了 pri-miR142和pri_miR155序列。圖14 pAAV2mirl42-CAG-RFP質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CAG promoter是由雞β -actin啟動子序列和人巨細胞病毒的早期增強子序列組成的啟動子；BGHpolyA是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；RFP為紅色熒光蛋白基因；mmvm為改造后的mvm內(nèi)含子，并在其中的多克隆位點插入了 pri_miR142序列。圖 15 pAAV2mirl42/155-CAG-RFP 質(zhì)粒圖譜。pAAV2mirl42_CAG-RFP 質(zhì)粒圖譜。 圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CAG promoter是由雞β-actin啟動子序列和人巨細胞病毒的早期增強子序列組成的啟動子；BGH polyA是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；RFP為紅色熒光蛋白基因；mmvm為改造后的mvm內(nèi)含子，并在其中的多克隆位點插入了 pri-miR142和pri_miR155序列。圖16 pAAV2mir34a-CMV-P53質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；Dl和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨細胞病毒的啟動子；BGH polyA是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；P53為一種抑癌基因；mmvm為改造后的mvm內(nèi)含子，并在其中的多克隆位點插入了 pri-miR34a序列。圖17 mmvm內(nèi)含子剪接功能驗證。見實施例7。不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞 24h后，熒光倒置顯微鏡觀察RFP表達情況。每種質(zhì)粒均拍攝同一視野的熒光和可見光的照片，均為10 X倍放大。Al和A2為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2ne0-RFP的鏡下所觀察到的，其中1為熒光所見，2為可見光所見，以下B H的1、2均為同樣的順序和含義，且均為10 X倍放大；Bl和B2為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2mir_CMV-RFP的鏡下所觀察到的； C1C2為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2mirl42_CMV-RFP的鏡下所觀察到的；D1D2為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2mirl42/155-CMV-RFP 的鏡下所觀察到的；E1E2 為 HEK293 轉(zhuǎn)染了 pAAV2neo_CAG-RFP 的鏡下所觀察到的；F1F2為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2mir_CAG-RFP的鏡下所觀察到的；G1G2 為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2mirl42-CAG-RFP的鏡下所觀察到的；H1H2為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2mirl42/155-CAG-RFP的鏡下所觀察到的。圖18miRNA表達功能驗證。見實施例8。圖A表示等量的pAAV2neo_Gluc、 pAAV2neo-Gluc 142T 和 pAAV2neo_Gluc 155T 分別轉(zhuǎn)染 HEK293 細胞 48h 后，檢測的 Gluc 活性。 圖 B 表示等量的 pAAV2neo-Gluc+pAAV2mirl42-CMV-RFP 和 pAAV2neo_Glucl42T+pAAV2mirl 42-CMV-RFP分別共轉(zhuǎn)染HEK293細胞48h后，檢測的Gluc活性。圖C表示等量的pAAV2ne0 -Gluc+pAAV2mirl42/155-CMV-RFP, pAAV2neo-Glucl42T+pAAV2mirl42/155-CMV-RFP 和 pAA V2neo-Glucl55T+pAAV2mirl42/155-CMV-RFP 分別共轉(zhuǎn)染 HEK293 細胞 48h 后，檢測的 Gluc 活性。圖 D 表示等量的 pAAV2neo-Gluc+pAAV2mirl42-CAG-RFP 和 pAAV2neo_Glucl42T+pAA V2mirl42-CAG-RFP分別共轉(zhuǎn)染HEK293細胞48h后，檢測的Gluc活性。圖E表示等量的pAAV2neo-Gluc+pAAV2mirl42/155-CAG-RFP,pAAV2neo-Glucl42T+pAAV2mirl42/155-CAG-RFP 禾口pAAV2neo-Glucl55T+pAAV2mirl42/155-CAG-RFP 分別共轉(zhuǎn)染 HEK293 細胞 48h 后， 檢測的Gluc活性。以下實施例對本發(fā)明的miRNA和蛋白編碼基因共表達載體pAAV2mir作了詳細說明，但并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實施例 1 mmvm 內(nèi)含子(modified mvm intron)的設(shè)計
/ΛΜΙ4 psc-TTRmvm-hFIX-BGHpA (ffu ZJ, Sun JJ, Zhang TP, et al. Optimization of self-complementary AAV vectors for liver-directed expressionresults in sustained correction of hemophilia B at low vector dose. Mol Ther,2008,16 (2) 280-290.)獲取mvm內(nèi)含子序列，依據(jù)內(nèi)含子的序列特征分析該序列，分別確定mvm內(nèi)含子的BrP和PPT的位置，具體結(jié)果如下5' - gt aagttggcgccgtttaagggatggttggttggt QQQQtactaat gtttaattacc tttttt ac ag -3'有下劃線標記且字體傾斜處為BrP位點(序列為tactaat)，僅下劃線標記之處為PPT位點(序列為■)。由于外源表達miRNA序列通常位于5'剪接識別位點(即 5'端的兩個開始堿基gt)和BrP位點之間，因此在兩位點之間插入多克隆位點(在實施例2和實施例3中，pAAV2mir-CMV與pAAV2mir_CAG中，所插入的多克隆位點序列不同)， 以供外源miRNA序列的插入，具體位置為序列中傾斜字體和未傾斜字體交界處(序列為 tTfifggSO，從而獲得mmvm內(nèi)含子。符號▼為插入的具體位置。實施例2 pAAV2mir-CMV、pAAV2mir_CMV-RFP 和 pAAV2mir-CMV_Gluc 質(zhì)粒構(gòu)建利用重疊延伸PCR法獲得mmvm內(nèi)含子，并在其兩端引入酶切位點Kpn I和EcoR I，用于將mmvm內(nèi)含子克隆入pAAV2ne0載體。mmvm內(nèi)含子中包含多克隆位點，在本實施例中多克隆位點分別為Not I,Xba I和Mlu I，用于插入外源表達的miRNA序列。具體實驗過程如下首先，設(shè)計并合成以下序列序列1 5 ‘ -ggt gaattc cggcggctagtctgtaaaaaaggtaattaaacattagtacccca cptaatcciacpcQtptaatcpcQacccictp -3 ‘序列 2 5 ‘ -ccg qQtaCC gtaagttggcgccgtttaagggatggttggttgg tctaga agtt capcppcccicpattacacgcptcpattacp -3 ‘在序列1和序列2中，序列的5'端有下劃線標記之處為酶切位點，其中，序列 1中的gaattc為醢切位點EcoR I的序列，序列2中的qqtacc為醢切位點Kpn I的序列；斜體部分為序列1和序列2的互補序列，用于PCR時序列1和序列2的配對，其中，在序列1中的互補序列為cataatcaacacptataatcacgcicccicta^m列2中的互補序列為 caacaaccacaattacacacatcaattaca-.mm 2中有下劃線標記、且字體加粗之處為mmvm中的多克隆位點，其序列為tctaga agtt ca.qc_q_qccqc.qaffacac.qcqf，It構(gòu)成的名克隆位點依次是Not I、Xba I 和 Mlu I。然后，以序列1和序列2為模板及引物進行重疊延伸PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，使用Kpn I和EcoR I雙酶切后，插入到pAAV2ne0的Kpn I和 EcoR I兩位點之間，獲得pAAV2mir-CMV，結(jié)構(gòu)如圖6所示。質(zhì)粒pAAV2mir-CMV可作為一種通用載體，用于miRNA和編碼蛋白基因的共表達，mmvm內(nèi)含子中多克隆位點方便于外源表達miRNA序列的插入，同時mmvm內(nèi)含子和BGH PolyA之間的多克隆位點則可用于編碼蛋白基因的插入。在本實施例中，為了驗證mmvm 內(nèi)含子能否正常剪接，我們選擇了 RFP(紅色熒光蛋白)^P Gluc (Gaussia luciferase)作為示例的編碼蛋白基因，將這兩種報告基因分別插入到pAAV2mir-CMV載體，分別獲得 pAAV2mir-CMV-RFP 和 pAAV2mir_CMV-Gluc。具體過程如下設(shè)計并合成以下引物RFP-f 5' -tgt gaattc accatgagcgagctg-3‘RFP-r 5' -ccc agatct ttactacttgtgccc-3'以RFP-f、RFP-r為引物，質(zhì)粒pH794(由第二軍醫(yī)大學(xué)錢其軍教授惠贈，其中RFP 序列根據(jù)Genbank中EU383029序列合成)為模板，PCR擴增RFP片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得的目的片段經(jīng)Bgl II和EcoR I雙酶切后，插入到pAAV2mir-CMV的 Bgl II 和 EcoR I 兩位點之間，獲得 pAAV2mir-CMV-RFP。按照相同的原理構(gòu)建pAAV2mir-CMV_Gluc。具體過程如下設(shè)計并合成以下引物Gluc-f 5' -tgt gaattc agccaccatgggagt-3‘Gluc-r 5' -tcc dg^tct cgcttagtcaccacc-3 ‘以 Gluc-f、Gluc-r 為引物，質(zhì)粒 pGluc-Basic 為模板(NEB，Cat. No. N8082S)，PCR 擴增Gluc片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得的目的片段經(jīng)Bgl II和EcoR I雙酶切后，插入到pAAV2mir-CMV的Bgl II和EcoR I兩位點之間，獲得pAAV2mir-CMV_Gluc。實施例3 pAAV2mir-CAG、pAAV2mir_CAG-RFP 和 pAAV2mir-CAG_Gluc 質(zhì)粒構(gòu)建利用重疊延伸PCR法獲得mmvm內(nèi)含子，并在其兩端引入酶切位點Kpn I和EcoR I，用于將mmvm內(nèi)含子克隆入pAAV2ne0載體。mmvm內(nèi)含子中包含多克隆位點，在本實施例中多克隆位點分別為Spe I.Sac I和Mlu I，用于插入外源表達的miRNA序列。具體實驗過程如下首先，設(shè)計并合成以下序列序列 3 5 ‘ -gt CiaattG cggcggctagtctgtaaaaaaggtaattaaacattagtaccccacg
taatcpacpcptpptaacactacitaaactt -3 ‘序列 4 5 ‘ -age qgtaco gtaagttggcgccgtttaagggatggttggttggtctag QaQctcaaptccactaqtattacca cgcgtcgatta -3 ‘在序列3和序列4中，序列的5'端有下劃線標記之處為酶切位點，其中，序列 3中的為酶切位點EcoR I的序列，序列4中的qqtacc為酶切位點Kmi I的序列；斜體部分為序列3和序列4的互補序列，用于PCR時序列3和序列4的配對，其中， 在序列3中的互補序列為taatcaacpcptpptaacactacitppactt,^f序列4中的互補序列為 aaatccactaptpttaccacgcptcgatta；序歹11 4中的下劃線標記且字體加粗之處為mmvm中的多克隆位點，其序列為 QaQctcaagtccactaptpttaccacaccitMim^mfr 占依汝縣:sPe I、Sac I 和 Mlu I。然后，以序列3和序列4為模板及引物進行重疊PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得的目的片段經(jīng)Kpn I和EcoR I雙酶切后，插入到質(zhì)粒pAAV2ne0-CAG的 Kpn I和EcoR I兩位點之間，獲得pAAV2mir_CAG，結(jié)構(gòu)如圖7所示。
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相比于pAAV2mir-CMV，pAAV2mir_CAG攜帶了不同的啟動子CAG，該啟動子可使目的基因在肝臟中持續(xù)穩(wěn)定高效地表達；因此，利用該載體有利于實現(xiàn)某種miRNA在肝臟中的高效持續(xù)表達；同時，pAAV2mir-CAG中mmvm內(nèi)含子攜帶的多克隆位點也與pAAV2mir_CMV 不同，其多克隆位點分別為Spe I.Sac I和MluI，用于外源表達miRNA序列的插入。為了驗證mmvm內(nèi)含子能否正常剪接，本實施例選擇了報告基因RFP (紅色熒光蛋白)和Gluc (Gaussia luciferase)作為示例的編碼蛋白基因，將這兩種編碼蛋白基因分別插入 pAAV2mir-CAG 載體，分別獲得了質(zhì)粒 pAAV2mir_CAG-RFP 和 pAAV2mir-CAG_Gluc。其具體過程如下設(shè)計并合成以下引物RFP-f 5' -tgt gaattc accatgagcgagctg-3‘RFP-r 5' -ccc agatct ttactacttgtgccc-3'以RFP-f、RFP-r為引物，質(zhì)粒pH794(由第二軍醫(yī)大學(xué)錢其軍教授惠贈，其中RFP 序列根據(jù)Genbank中EU383029序列合成)為模板，PCR擴增RFP片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得的目的片段經(jīng)Bgl II和EcoR I雙酶切后，插入到pAAV2mir-CAG的 Bgl II 和 EcoR I 兩位點之間，獲得 pAAV2mir-CAG-RFP。按照相同的原理構(gòu)建pAAV2mir-CAG_Gluc。具體過程如下設(shè)計并合成以下引物Gluc-f 5' -tgt gaaiic agccaccatgggagt-3‘Gluc-r 5' -tcc agfaici cgcttagtcaccacc-3 ‘以 Gluc-f、Gluc-r 為引物，質(zhì)粒 pGluc-Basic (NEB，Cat. No. N8082S)為模板，PCR 擴增Gluc片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得的目的片段經(jīng)Bgl II和EcoR I雙酶切后，插入到pAAV2mir-CAG的Bgl II和EcoR I兩位點之間，獲得pAAV2mir-CAG_Gluc。實施例4 pAAV2mirl42-CMV-RFP 和 pAAV2mirl42/155_CMV-RFP 質(zhì)粒構(gòu)建為驗證pAAV2mir-CMV表達載體是否能夠同時高效地表達miRNA和編碼蛋白基因，本實施例首先將miR142的表達序列插入pAAV2mir-CMV-RFP中mmvm內(nèi)含子的多克隆位點之間，獲得pAAV2mirl42-CMV-RFP。在此基礎(chǔ)上，實施例再將miR155的表達序列插入 pAAV2mirl42-CMV-RFP 中 mmvm 內(nèi)含子的多克隆位點之間，獲得 pAAV2mirl42/155_CMV-RFP， 用于驗證pAAV2mir-CMV表達載體能否實現(xiàn)將兩種或兩種以上miRNA與編碼蛋白基因共表達。具體的構(gòu)建過程如下設(shè)計并合成以下引物142-f 5' -Cgg tctaga cttggagcaggagtc-3‘142-r 5' _aat gcggccgc atgccgaggaagatg-3‘以142-f、142-r為引物，HEK293細胞全基因組DNA為模板，PCR擴增包含pri-miR142的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得的目的片段經(jīng)Not I 和Xba I雙酶切后，插入到pAAV2mir-CMV-RFP的Not I和Xba I兩位點之間，獲得 pAAV2mirl42-CMV-RFP。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計并合成以下引物155-f 5' -gtg gcggccgc ctgtggtttaaattc-3‘155-r 5' -att Bcgcgt tctttgtcatcctccc-3‘
以155-f、155-r為引物，HEK293細胞全基因組DNA為模板，PCR擴增包含 pri-miR155的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得的目的片段經(jīng)Not I和 Mlu I雙酶切后，插入到pAAVanirl42-CMV-RFP的Not I和Mlu I兩位點之間，獲得 pAAV2mirl42/155-CMV-RFP。實施例5 pAAV2mirl42-CAG-RFP 和 pAAV2mirl42/155_CAG-RFP 質(zhì)粒構(gòu)建為驗證pAAV2mir-CAG表達載體是否能夠同時高效地表達miRNA和編碼蛋白基因， 本實施例首先將miR142的表達序列插入pAAV2mir-CAG-RFP中mmvm內(nèi)含子的多克隆位點之間，獲得pAAVaiiirl42-CAG-RFP。在此基礎(chǔ)上，本實施例再將miR155的表達序列插入到 pAAV2mirl42-CAG-RFP 中 mmvm 內(nèi)含子的多克隆位點之間，獲得 pAAV2mirl42/155_CAG-RFP， 用于驗證pAAV2mir-CAG表達載體能否實現(xiàn)兩種或兩種以上miRNA與編碼蛋白基因共表達。 具體的構(gòu)建過程如下設(shè)計并合成以下引物142-f ‘ 5' -Cgg gagctc cttggagcaggagtc-3‘142-r' 5' - cgcactagta tgccgaggaagatg-3‘以142-f ‘、142-r ‘為引物，HEK293細胞全基因組DNA為模板，PCR擴增包含pri-miR142的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得的目的片段經(jīng)Mc I 和Spe I雙酶切后，插入到pAAV2mir-CAG-RFP的Mc I和Spe I兩位點之間，獲得 pAAV2mirl42-CAG-RFP。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計并合成以下引物155-f ‘ 5' -gtg aciagff ctgtggtttaaattc-3'155-r‘ 5' -att acgcgt tctttgtcatcctccc-3'以155-f ‘、155-r'為引物，HEK293細胞全基因組DNA為模板，PCR擴增包含pri-miR155的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得的目的片段經(jīng)Spe I 和Mlu I雙酶切后，插入到pAAV2mirl42-CAG-RFP的Spe I和Mlu I兩位點之間，獲得 pAAV2mirl42/155-CAG-RFP。實施例6 pAAV2mir;34a-CMV-p53 質(zhì)粒構(gòu)建為了研究miRNA與編碼蛋白的相互作用關(guān)系，本實施例利用了 miR3^能夠調(diào)節(jié) P53活性的機理，構(gòu)建了 miR3^與P53共表達的質(zhì)粒pAAVanir34a-CMV-p53。具體構(gòu)建過程如下設(shè)計并合成以下引物34a-f 5' -tat gcggccgc ttcttatcaacaggt-3‘34a-r 5' -aag acgcgt tggcgcagaagagct-3 ‘以3^-f、3^-r為引物，HEK293細胞全基因組DNA為模板，PCR擴增包含 pri-miR3^的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得的目的片段經(jīng)Not I和Mlu I 雙酶切后，插入到pAAV2mir-CMV的Not I和Mlu I兩位點之間，獲得pAAV2mir34a_CMV。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計并合成以下引物p53-f 5' -agt gaattc cgtacgtacgacggt-3‘p53-r 5' -cgc agatct atgtcagtctgagtc-3‘以p53-f、p53-r為引物，Ad-p53(本實驗室保存)為模板，PCR擴增p53片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得的目的片段經(jīng)Bgl II和EcoR I雙酶切后，插入 pAAV2mir34a-CMV 的 Bgl II 和 EcoR I 兩位點之間，獲得 pAAV2mir34a_CMV-p53。實施例7 mmvm內(nèi)含子剪接功能驗證HEK293細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板(10000個細胞/孔，10% DMEM)。轉(zhuǎn)染前4h 換新鮮的10% DMEM培養(yǎng)基(100 μ L/孔)，轉(zhuǎn)染過程參見LipofectamineTM2000說明書。 每孔具體轉(zhuǎn)染過程為0. 1 μ g DNA加入25 μ L OPTI-MEM培養(yǎng)液，0. 25 μ L Iipofectamine 2000加入25 μ L OPTI-MEM培養(yǎng)液，分別混勻，于室溫放置5min。然后將兩種液體混勻， 于室溫放置20min后，加入細胞中，并前后搖晃96孔細胞培養(yǎng)板使液體混勻，于37°C的 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。24h用倒置熒光顯微鏡觀察細胞中RFP表達情況，具體見圖17。圖中，Al和A2為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2neo_RFP的鏡下所觀察到的，為IOX倍放大，其中 1為熒光所見，2為同一個視野里的可見光所見，以下B H的1、2均為同樣的順序和含義，且均為IOX倍放大；Bl和B2為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2mir_CMV-RFP的鏡下所觀察到的；Cl和C2為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2mirl42-CMV-RFP的鏡下所觀察到的；Dl和D2為 HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2mirl42/155-CMV-RFP的鏡下所觀察到的；El和E2為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2neo-CAG-RFP 的鏡下所觀察到的；Fl 和 F2 為 HEK293 轉(zhuǎn)染了 pAAV2mir_CAG-RFP 的鏡下所觀察到的；Gl和G2為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAVanirl42-CAG-RFP的鏡下所觀察到的；Hl和 H2為HEK293轉(zhuǎn)染了 pAAV2mirl42/155_CAG-RFP的鏡下所觀察到的。從圖17的結(jié)果可知，相比轉(zhuǎn)染pAAV2ne0-RFP的HEK293細胞，分別轉(zhuǎn)染等量的 pAAV2mir-CMV-RFP,pAAV2mir 142-CMV-RFP 和 pAAV2mirl42/155_CMV-RFP 的 HEK293 細胞的 RFP表達效率并未見差異，表明載體中插入mmvm內(nèi)含子未影響RFP的表達，mmvm內(nèi)含子在表達過程中能夠正常剪接，且在mmvm內(nèi)含子中插入單個和兩個miRNA的表達序列也未影響 mmvm內(nèi)含子的正常剪接。同時，CAG啟動子相關(guān)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞也呈現(xiàn)出相似的規(guī)律。但相比CMV啟動子，CAG啟動子的表達強度較弱。實施例8 miRNA表達功能驗證為了驗證miRNA表達載體功能，本案使用本實驗室已有的miRNA活性檢測質(zhì)粒系統(tǒng)(田文洪，董小巖，王剛，吳小兵。一種利用分泌型熒光素酶基因表達變化監(jiān)測活細胞中miRNA活性的新方法。生物工程學(xué)報，2010，26 (6) =807-814)來測定miRNA 表達載體表達miRNA的活性情況。在本實施例中，所應(yīng)用的miRNA活性檢測質(zhì)粒為 pAAV2neo-Gluc、pAAV2neo_Glucl42T 和 pAAV2neo_Glucl55T。其中，質(zhì)粒 pAAV2neo_Gluc 不攜帶miRNA靶序列，用于顯示不受miRNA調(diào)控時轉(zhuǎn)染細胞的Gluc表達活性水平；質(zhì)粒 pAAV2neo-Glucl42T在Gluc的3' UTR區(qū)攜帶了單個的miR142_3p靶序列，Gluc表達受細胞內(nèi)miR142-3p調(diào)控，相比于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pAAV2neo-Gluc的細胞Gluc表達活性水平，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pAAV2neo-Glucl42T細胞Gluc表達活性的變化，可用于指示細胞內(nèi)的miR142_3p活性； 同理，質(zhì)粒pAAV2neo-Glucl55T在Gluc的3' UTR區(qū)攜帶單個的miR155靶序列，可用于指示細胞內(nèi)的miR155活性水平。HEK293細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板(10000個細胞/孔，10% DMEM)。轉(zhuǎn)染前4h換新鮮的10 % DMEM培養(yǎng)基(100 μ L/孔)，轉(zhuǎn)染過程參見Lipofectamine 2000說明書。每孔具體轉(zhuǎn)染過程為0. 1 μ g miRNA表達質(zhì)粒+0. 1 μ g miRNA活性檢測質(zhì)?；?. 1 μ gmiRNA活性檢測質(zhì)粒加入 25yL OPTI-MEM 培養(yǎng)液，0. 50 μ Llipofectamine 2000 加入 25yL OPTI-MEM培養(yǎng)液，分別混勻，于室溫放置5min。然后將兩種液體混勻，于室溫放置20min后，加入細胞中，并前后搖晃96孔細胞培養(yǎng)板使液體混勻，于37°C的5% CO2孵箱中培養(yǎng)。4 后，用 Gaussia luciferaseassay kit (NEB)檢測細胞培養(yǎng)上清中Gluc活性。具體過程為每孔取20yL細胞培養(yǎng)上清液，加入50yL Gaussia luciferase assay kit中底物，混勻后， 用發(fā)光檢測儀(Modulus Luminometer)測定其相對光強度單位(Relative light unit, RLU)，每次測定收集光子10s。具體結(jié)果見圖18。從圖18的結(jié)果可知，當miRNA活性檢測質(zhì)粒(pAAV2neo-Glucl42T或 pAAV2neo-Glucl55T)單獨轉(zhuǎn)染HEK293細胞時，細胞中Gluc表達活性與轉(zhuǎn)染等量的pAAV2neo-Gluc的HEK293細胞間未見差異(圖18A)。這是因為HEK293細胞中 miRNA142-3p和miRNA155表達量極低，活性弱。同時，也表明miRNA靶序列插入miRNA活性檢測載體中并未影響Gluc的表達。為了檢測pAAV2mirl42-CMV-RFP的miRNA142_3p 表達活性，將 pAAMneo-Gluc 或 pAAMneo_Glucl42T 與 pAAV2mirl42_CMV-RFP 共轉(zhuǎn)染 HEK293細胞，轉(zhuǎn)染4 后檢測細胞培養(yǎng)上清中的Gluc活性(圖18B)。可見相比共轉(zhuǎn)染 pAAV2neo-Gluc的細胞，共轉(zhuǎn)染pAAV2neo-Glucl42T的細胞的Gluc表達活性明顯降低，這表明 pAAV2mirl42-CMV-RFP 可以有效的表達 miRNA142-3p。為了進一步驗證pAAVaiiir是否具有同時表達兩種miRNA的能力，將 pAAV2neo-Gluc、pAAV2neo_Glucl42T 或 pAAV2neo_Glucl55T 與 pAAV2mirl42/155_CMV-RFP 共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，轉(zhuǎn)染4 后檢測細胞培養(yǎng)上清中Gluc活性(圖18C)。結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染 pAAVaieo-Gluc 的細胞相比，共轉(zhuǎn)染 pAAVaieo_Glucl42T 或 pAAVaieo_Glucl55T 的細胞的Gluc表達活性有一定程度的降低，但不如共轉(zhuǎn)染pAAV2ne0-Glucl42T和 pAAV2mirl42-CMV-RFP的減低的程度明顯，這表明pAAV^iir雖然能同時表達兩種miRNA但表達效率有所下降。在此基礎(chǔ)上，本案進一步探索了不同啟動子對miRNA表達載體的影響。通過構(gòu)建 CAG啟動子控制的、miR142-3p調(diào)節(jié)的RFP表達質(zhì)粒pAAVanirl42-CAG-RFP，并構(gòu)建由CAG啟動子控制的、由miR142-3p與miR155共調(diào)節(jié)的RFP表達質(zhì)粒pAAV2mirl42/155_CAG-RFP，將表達質(zhì)粒和miRNA活性檢測質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，轉(zhuǎn)染4 后檢測細胞培養(yǎng)上清中Gluc 活性。結(jié)果顯示，對于表達載體質(zhì)粒pAAVanirl42-CAG-RFP，共轉(zhuǎn)染pAAVaieo-Glucl42T細胞的Gluc表達活性有所下降(圖18D)，但沒有CMV啟動子介導(dǎo)的pAAVanirl42-CMV-RFP表達載體導(dǎo)致的Gluc表達活性下降明顯。分析可能是活性檢測載體的CMV啟動子的活性比 CAG啟動子的活性要強而導(dǎo)致的。但此結(jié)果仍足以表明pAAVanirl42-CAG-RFP表達載體也可有效地表達miR142-3p。miRNA142-3p 和 miR155 的共表達載體pAAV2mirl42/155-CAG-RFP 也呈現(xiàn)相似的規(guī)律(圖18E)。但由于這兩種miRNA共表達時表達效率的下降，導(dǎo)致Gluc表達活性的下降更加不明顯。名詞及縮寫詞解釋1、AAV :adeno_associated virus,腺相關(guān)病毒。2> ITR :inverted terminal repeat，^iJ$^@;gS；。3、AAV2 病毒2 型 AAV 病毒(adeno-associated virus serotype 2)。4、pAAV2neo質(zhì)粒是一種攜帶了 AAV2病毒ITR的質(zhì)粒DNA。所述的AAV載體質(zhì)粒一般由AAV2 ITR、啟動子、目的基因或阻斷序列、ployA、AAV2 ITR以及Ε. coli質(zhì)粒骨架組成。質(zhì)粒骨架上攜帶了 neo基因的表達單位。5、Dl和D2 :AAV2病毒ITR中的部分序列。6, CMV promoter 人巨細胞病毒的啟動子。7、CAG promoter 由雞β -actin啟動子序列和人巨細胞病毒的早期增強子序列組成的啟動子。8, BGH polyA 牛生長激素基因的加尾信號序列。9、Neo 新霉素抗性基因。10、ampR:氨芐青霉素抗性基因。ll、mmvm 內(nèi)含子modified minute virus of mice intron,為改造后的 mvm 內(nèi)含子。該內(nèi)含子含有多克隆位點，以供外源表達miRNA序列的插入。12、MCS 多克隆位點，用于編碼蛋白基因的插入。13, EGFP 為增強型綠色熒光蛋白基因，常用報告基因。14, RFP 為紅色熒光蛋白基因，常用報告基因。15, Gluc 為Gaussia螢光素酶基因，為常用報告基因。16, Fluc 螢火蟲螢光素酶基因，為常用報告基因。17,pAAV2mir :miRNA和編碼蛋白基因的共表達載體。18、BrP 為 Branch-point domain 的縮寫，即分支位點域。19、PPT 為 poly pyrimidine tract 的縮寫，即多聚嘧啶序列。20、p53 :p53 基因。21、pri-miR142 :miRNA 142 序列的前體。22、miRNA :microRNA,微小 RNA。23U42T :miR142_3p 的靶序列(Target)，與 miR142_3p 序列完全互補。24U55T :miR155 的靶序列(Target)，與 miR155 序列完全互補。
權(quán)利要求
1.一種新型miRNA和編碼蛋白基因共表達載體，其技術(shù)特征在于主要由AAV2 ITR、啟動子、mmvm內(nèi)含子、編碼蛋白基因和BGH poly (A)等元件組成；miRNA和報告基因或功能蛋白基因的共表達。
2.如權(quán)利要求1所述的共表達載體，其特征在于，攜帶AAV2ITR序列，可進一步包裝成 AAV病毒，依賴于AAV病毒的不同血清型的組織特異性嗜性，實現(xiàn)miRNA和編碼蛋白基因的相對組織特異性表達。
3.如權(quán)利要求2所述的共表達載體，其特征在于，所述的AAV病毒的血清型包括AAVl、 AAV2、AAV5、AAV8、AAV9以及AAV病毒包括ssAAV病毒和scAAV病毒兩種類型。
4.如權(quán)利要求1所述的共表達載體，其特征在于，所述的啟動子包括CMV啟動子、CAG 啟動子、PGK啟動子。
5.如權(quán)利要求1所述的共表達載體，其特征在于，所述的mmvm內(nèi)含子來源于mvm內(nèi)含子，在其5' splice site和分支位點(Branch-point domain)之間插入多克隆位點(MCS)， 以供單個或多個pri-miRNA序列的插入。
6.如權(quán)利要求1所述的共表達載體，其特征在于，所述的編碼蛋白基因包括如螢火蟲螢光素酶基因(Flue)、Gaussia螢光素酶基因(Gluc)、紅色熒光蛋白基因(RFP)、綠色熒光蛋白基因(EGFP)的報告基因；如MYC、c-MYC的原癌基因和如P53的抑癌基因。
7.如權(quán)利要求1所述的共表達載體，其特征在于，可實現(xiàn)單個或多個miRNA與報告基因的共表達，也可實現(xiàn)單個或多個miRNA與功能蛋白基因的共表達，如miR34a與P53、miR21 和miR155與MYC，包括這些組合但不限于這些組合。
8.如權(quán)利要求1所述的共表達載體，其特征在于，表達的miRNA、報告基因和功能蛋白基因既可以是天然的，又可以是經(jīng)過人工改造過的或人工合成的。
9.如權(quán)利要求1所述的共表達載體，其特征在于，可用于miRNA的功能和miRNA與蛋白相互作用關(guān)系研究，并可用于疾病的治療和動物模型的構(gòu)建。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及一種miRNA和編碼蛋白基因的共表達載體pAAV2mir。該表達載體主要由AAV2 ITR、啟動子、mmvm內(nèi)含子(modified minute virus of mice intron)、編碼蛋白基因和BGH poly(A)等元件組成，其中mmvm內(nèi)含子中包含多克隆位點，用于pri-miRNA的插入。使用時將單個或多個pri-miRNA序列插入mmvm內(nèi)含子的多克隆位點之間，同時插入相應(yīng)編碼蛋白基因，實現(xiàn)miRNA和編碼蛋白基因的共表達。并且該載體攜帶AAV2ITR序列，可進一步包裝成AAV病毒，依賴于AAV病毒的不同血清型的組織特異性嗜性，實現(xiàn)miRNA和編碼蛋白基因的相對組織特異性表達。該載體可用于miRNA功能以及miRNA和蛋白相互作用研究。
文檔編號C12N15/86GK102311973SQ20101021679
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月5日
發(fā)明者吳小兵, 田文洪, 董哲岳, 董小巖 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司