專利名稱：人源胰凝乳蛋白酶的表達(dá)及純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人源胰凝乳蛋白酶的分離 純化方法，其包括以下步驟(a)采用含有細(xì)胞質(zhì)二硫化物還原系統(tǒng)兩個突變的大腸桿菌 Rosetta-gami (DE3) ； (b)促進(jìn)二硫鍵形成的載體pET_32a，得到trx標(biāo)簽融合的重組人源胰 凝乳蛋白酶原蛋白和(c)使用胰蛋白酶激活重組的酶原，并且在激活酶原的同時將trx標(biāo) 簽去除。該發(fā)明在酶原激活的同時完成了增溶標(biāo)簽的去除，避免了昂貴的腸激酶的使用， 同時可獲得幾乎不含多余氨基酸的重組蛋白。生產(chǎn)成本的降低無疑給該工作帶來了廣闊的 工業(yè)應(yīng)用前景。本發(fā)明純化所得的胰凝乳蛋白酶表達(dá)量高，純度好，成本低，可以有效地用 于治療及化學(xué)領(lǐng)域。相關(guān)背景胰凝乳蛋白酶最初被發(fā)現(xiàn)存在于牛的胰臟中，目前已從牛的胰臟中純化出兩種無 活性的酶原蛋白——胰凝乳蛋白酶原A和胰凝乳蛋白酶原B;之后從豬的胰臟中又純化出 另一種酶原，胰凝乳蛋白酶原C[l]。胰凝乳蛋白酶原A可通過不同的活化方式產(chǎn)生多種形 式的有活性的酶(如α、β、Υ、π、δ等)，其中α為主要形式；而胰凝乳蛋白酶原B使 用大量胰酶激活后即產(chǎn)生最終的活性形式胰凝乳蛋白酶Bn [2]。胰凝乳蛋白酶原A和B具 有相似的沉降及擴散常數(shù)，并且具有相同的分子量。胰凝乳蛋白酶α在溶液中具有單體和 二聚體兩種分子形式，胰凝乳蛋白酶B雖然在大多數(shù)ρΗ也顯示相似的行為，但在ρΗ 4時它 們只是以單體形式存在[3]。胰凝乳蛋白酶A和B雖然具有相同的分子量，但是二者具有不 同的電泳遷移率。此外二者在離子交換樹脂的滯留率不同，且它們對天然的胰蛋白酶抑制 劑的敏感性也不同。故可通過準(zhǔn)備方法、溶解度、電泳遷移率和等電點將二者區(qū)分。一些底 物特異性研究結(jié)果顯示，胰凝乳蛋白酶B水解?；彼狨サ乃俾室人饫野滨ｕズ捅?丙胺酰酯的速率慢得多。目前定義胰凝乳蛋白酶A及胰凝乳蛋白酶B的依據(jù)就是將不同種屬蛋白的氨基酸 序列分別與牛的A型或B型進(jìn)行全序列比對。人源胰凝乳蛋白酶與牛胰凝乳蛋白酶A和B 的氨基酸序列同源性分別為82%和86%。按此規(guī)則，人源胰凝乳蛋白酶被命名為胰凝乳蛋 白酶B。同理，大鼠的胰凝乳蛋白酶也屬于胰凝乳蛋白酶B(圖1、表1)。然而根據(jù)Hudaky 等人的研究發(fā)現(xiàn)，牛胰凝乳蛋白酶B水解色氨酰酯的速率比水解苯丙胺酰或酪氨酰酯底物 的速率慢了兩個數(shù)量級，而胰凝乳蛋白酶A水解三者具有相似的速率，這是由于Ala226空 間位阻大于Gly226空間位阻造成的。因此如果按照酶反應(yīng)的底物特異性規(guī)律來分類，則大 鼠的胰凝乳蛋白酶仍屬于B型，而人的胰凝乳蛋白酶則屬于A型[4]。為了避免不同命名方 法帶來的混淆，克服酶與底物間特異性差異對實驗可能造成的影響，進(jìn)行人源胰凝乳蛋白 酶的表達(dá)純化工作是非常必要的。此外，人源胰凝乳蛋白酶還具有一定的藥用價值。β-chymotrypsin已被臨床用 于化疲及抗炎癥藥物(oral mucolytic and anti-inflammatory agent) [5—9],目前□月空 復(fù)合酶治療主要采用Wobenzym N和WobeMugos的方法，成分包括絲氨酸蛋白酶(胰酶、胰
3凝乳蛋白酶)以及植物金屬蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶)。除此之外，胰凝乳蛋白酶 還可以針劑或噴劑的形式用于創(chuàng)傷或手術(shù)后傷口愈合、抗炎及防止局部水腫、積血、扭傷血 腫、乳房手術(shù)后浮腫、中耳炎及鼻炎等，而且可用于白內(nèi)障摘除。目前為止，使用的胰凝乳 蛋白酶全部來自動物胰臟，因此該藥物的生產(chǎn)受限于可獲得的?；蜇i的來源。更為重要地 是，部分病人在使用異種(性)胰凝乳蛋白酶后會發(fā)生過敏反應(yīng)，嚴(yán)重的甚至?xí)＜吧?而使用基因工程表達(dá)人源胰凝乳蛋白酶可以獲得不受限制的重組蛋白，從而滿足治療需要 [10]。表1.各種屬胰凝乳蛋白酶與牛胰凝乳蛋白酶A和B的序列相似性比較。等電點(PI)與 Bovine A 的 與 Bovine B 的同源度同源度
Bovine A8. 2610079. 18
Bovine B4. 7679. 18100
Human B7. 1981.6386.12
Rat B4. 6675.5284.58
Mouse B4. 6876.6785.48
Dog 27. 2782.5780.42胰凝乳蛋白酶是絲氨酸蛋白酶家族的內(nèi)肽酶，其在胰臟內(nèi)以無活性的酶原形式合 成，并隨胰液運送至小腸后被剪切激活。人胰凝乳蛋白酶原共有245個氨基酸，并包含五對 二硫鍵。其被胰蛋白酶剪切激活后成為三段肽鏈，并仍由兩對鏈間二硫鍵連接，此外還含 有三對鏈內(nèi)二硫鍵。為了以正確構(gòu)象表達(dá)胰凝乳蛋白酶原，必須在表達(dá)過程中形成正確的 二硫鍵。然而，在大腸桿菌胞漿中的還原態(tài)妨礙了蛋白質(zhì)中二硫鍵的形成，導(dǎo)致包涵體的形 成，嚴(yán)重影響目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量和活性。實驗證明采用包涵體變性復(fù)性的方法，只能獲得銀染級別的目標(biāo)蛋白。顯然如此 少量的蛋白無論是在功能研究還是后續(xù)的抗體制備方面都是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求的。因此尋 找一種有效的用于人胰凝乳蛋白酶原的表達(dá)純化體系是非常重要的。大鼠胰凝乳蛋白酶原的表達(dá)已經(jīng)在啤酒酵母中得以實現(xiàn)[11]。然而，使用酵母的 表達(dá)體系非常耗時，在靶蛋白富集前需要針對不同培養(yǎng)基進(jìn)行多種選擇步驟，因此在開始 純化前即需要花費約九天時間，并且在純化過程中需要多次不同的層析步驟。由于屬于絲 氨酸蛋白酶家族的胰凝乳蛋白酶具有自催化活性，使得在長時間的純化過程中產(chǎn)物的活性 和產(chǎn)量有很大程度的損失。為了克服長時間孵育帶來的這些問題，并且得到更快速經(jīng)濟的 表達(dá)純化步驟，我們選擇了大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述本發(fā)明提供下列1. 一種人源胰凝乳蛋白酶的分離純化方法，其特征在于所述人源胰凝乳蛋白酶原 的激活和標(biāo)簽的去除在一步完成，不引入腸激酶，而是只使用胰蛋白酶，其包括以下步驟a)獲得人源胰凝乳蛋白酶原編碼序列；b)將上述獲得的人源胰凝乳蛋白酶原編碼序列引入原核表達(dá)系統(tǒng)中，得到重組質(zhì)粒；c)將上述得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞質(zhì)二硫化物還原系統(tǒng)的兩個突變的宿主菌株 進(jìn)行人源重組胰凝乳蛋白酶原的表達(dá)純化；d)將上述純化的胰凝乳蛋白酶原與胰蛋白酶混合以激活酶原。2. 1所述的方法，所述方法還包括下列步驟e)利用SBTI-Si^pharose親和柱純化得到激活后的胰凝乳蛋白酶。3. 1或2所述的方法，其中所述人源胰凝乳蛋白酶原編碼序列如SEQID NO :1所顯
7J\ ο4. 1或2所述的方法，其中所述原核表達(dá)系統(tǒng)為促進(jìn)二硫鍵形成的載體。5. 4所述的方法，其中所述促進(jìn)二硫鍵形成的載體為pET32a載體。6. 1或2所述的方法，其中具有細(xì)胞質(zhì)二硫化物還原系統(tǒng)的兩個突變的宿主菌株 是 E.coli Rosetta-gami (DE3)菌株。7. 1或2所述的方法，其中在步驟d)中，將純化的胰凝乳蛋白酶原與胰蛋白酶按照 質(zhì)量比100 1-1000 1混合。8. 7所述的方法，其中純化的胰凝乳蛋白酶原與胰蛋白酶按照質(zhì)量比400 1混
I=I O9. 1-8任一項所述的方法，其中在步驟d)中，將純化的胰凝乳蛋白酶原與胰蛋白 酶混合后，在16-37°C反應(yīng)30-120分鐘。10. 9所述的方法，其中在步驟d)中，將純化的胰凝乳蛋白酶原與胰蛋白酶混合 后，在30°C反應(yīng)90分鐘。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種簡便經(jīng)濟的人源胰凝乳蛋白酶的分離純化方法，采取了下列實施方案。1.從HEK-293細(xì)胞中提取RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。2.以經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到所需的cDNA為模板，擴增人源胰凝乳蛋白酶原的⑶S從第 19位氨基酸至終止密碼子之間的序列(即不包含前18個信號肽)，并分別在此編碼序列的 5，端和3，端引入Nco I和Xho I位點。所述人源胰凝乳蛋白酶原的序列如SEQ ID NO=I 所示。3.向回收的PCR產(chǎn)物和提取的原核表達(dá)系統(tǒng)(優(yōu)選地，促進(jìn)二硫鍵形成的載體，更 優(yōu)選地pET32a載體)，分別加入限制性核酸內(nèi)切酶(優(yōu)選地Nco I和Xho I )，回收目的片 段。將回收后的兩種產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到人源胰凝乳蛋白酶原的表達(dá)載體，在本發(fā)明一個實 施方案中，所述得到的表達(dá)載體為pET32a-chymotrypsinogen質(zhì)粒。 在本發(fā)明的一個實施方案中，使用pET32a載體作為表達(dá)載體，pET32a具有以下幾 個優(yōu)點(1)該載體可以在目標(biāo)蛋白的N端引入trx-tag，該標(biāo)簽可以促進(jìn)二硫鍵在細(xì)菌胞 質(zhì)中的形成，對富含二硫鍵蛋白的表達(dá)至關(guān)重要。(2)該載體的組氨酸標(biāo)簽可以選擇性地融 合表達(dá)于目標(biāo)蛋白的兩端。如將該標(biāo)簽表達(dá)于目標(biāo)蛋白的N端，之后可以通過腸激酶剪切 位點將所有標(biāo)簽去除，得到接近天然構(gòu)象的目標(biāo)蛋白。 4.將所得表達(dá)載體，例如pET32a-chymotrypsinogen質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞質(zhì)二硫化物還 原系統(tǒng)的兩個突變的宿主菌株，如E.coli Rosetta-gami (DE3)菌株，收集細(xì)菌，破碎，檢測
5后合并蛋白含量最高的收集管內(nèi)的收集液。5.將純化的胰凝乳蛋白酶原與胰蛋白酶按照質(zhì)量比100 1-1000 1，優(yōu)選地 400 1混合，于16-37°C，優(yōu)選地30°C，反應(yīng)30-120分鐘，優(yōu)選地90分鐘，以激活酶原。在一個實施方案中，加入TLCK中和胰酶活性后，利用SBTI-S印harose親和柱純化 得到激活后的胰凝乳蛋白酶。具體步驟如下用平衡緩沖液平衡親和柱后，將含有已活化的 胰凝乳蛋白酶的樣品上柱，平衡緩沖液淋洗兩個柱體積后，用ImM HCl洗脫，每Iml收集。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)勢利用胰蛋白酶的自激活特性，成功地去除了融合 蛋白上的標(biāo)簽，并同時將酶原激活，從而獲得了接近天然序列的酶。該實驗在酶原激活的同 時完成了標(biāo)簽的去除，避免了昂貴的腸激酶的使用。同時配合促進(jìn)二硫鍵形成的載體和菌 株，得到了大量的可溶性蛋白。生產(chǎn)成本的降低無疑給該工作帶來了廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。


圖1.不同生物體中胰凝乳蛋白酶原的多序列比對。圖2.人胰凝乳蛋白酶原的DNA序列。圖3. pET-32a-hctrb的質(zhì)粒圖譜。在質(zhì)粒的trxA標(biāo)簽序列后插入人胰凝乳蛋白 酶原的基因編碼序列，使得表達(dá)的trx-chymotrypsinogen融合蛋白能形成正確的二硫鍵。圖4.在大腸桿菌R0Setta-gami(DE3)中表達(dá)純化人源胰凝乳蛋白酶原。(A) Trx-chymotrypsinogen融合蛋白使用還原型SDS-PAGE進(jìn)行分離后使用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染 色。(B)使用anti-His的抗體對trx-chymotrypsinogen融合蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測。圖5.人源胰凝乳蛋白酶的純化及酶活性檢測。(A)使用SBTI柱純化已激活的胰 凝乳蛋白酶。向融合蛋白中加入胰蛋白酶，按照酶底物(W/V)為1 400的比率于30°C 反應(yīng)90分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物上樣至SBTI柱并使用ImMHCl洗脫。使用還原型SDS-PAGE對洗脫 后的有活性的胰凝乳蛋白酶進(jìn)行檢測。(B)抑制劑對胰凝乳蛋白酶剪切底物Bid的活性的 影響。在5或0. 5μΜ TLCK，1或0. ΙμΜ TPCK存在下，對胰凝乳蛋白酶于37 °C預(yù)孵育30分 鐘。將Bid加入每一組反應(yīng)體系中，于37°C孵育1小時后終止反應(yīng)。使用SDS-PAGE對剪切 后的Bid蛋白進(jìn)行檢測。圖6.胰凝乳蛋白酶激活示意圖。圖7.純化后的胰凝乳蛋白酶為π型胰凝乳蛋白酶。㈧使用胰蛋白酶酶解純 化的胰凝乳蛋白酶后進(jìn)行肽指紋圖譜檢測。純化后的26kD人源胰凝乳蛋白酶進(jìn)行還原型 SDS-PAGE分離后使用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解后的肽段進(jìn)行LC-MS/MS檢測。(B)對純化的 胰凝乳蛋白酶進(jìn)行蛋白N端測序。將洗脫產(chǎn)物于15% SDS-PAGE進(jìn)行分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜 上，使用考馬斯亮藍(lán)染色。切下正確的條帶，于ABI-491氨基酸測序儀進(jìn)行檢測，得到N端 五個氨基酸序列為IVNGE。圖8. π型胰凝乳蛋白酶的自激活。將π型胰凝乳蛋白酶在pH 3.0(A)或ρΗ 8.0(B)的緩沖液中，于37°C孵育1小時。反應(yīng)產(chǎn)物分別進(jìn)行非還原或還原型SDS-PAGE分罔。圖9人胰凝乳蛋白酶原編碼序列。(SEQ ID NO :1)具體實施方式
實施例(1)實驗材料
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RNeasy RNA提取試劑盒、Omniscript反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自QIAGEN公司；Yeast extract、Tryptone 購自 OXOID 公司；pET_32a、pET_22b 禾口 E. coliRosetta-gami (DE3)購自 novagen 公司；Random Hexamers 購自 Fermentas 公司；pfu DNA 聚合酶、dNTP、DNA ladder、 Ε. coli ToplO感受態(tài)菌株、質(zhì)粒小提試劑盒、核酸凝膠回收試劑盒、抗his-tag的單克隆抗 體等購自Tiangen公司；引物合成、DNA測序由Invitrogen公司完成；Nde I ,BamH I、Nco I、Xho I等核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；T4DNA連接酶購自Promega公司；Ni Sepharose 6 Fast FlowftXNBr-activated Sepharose GE Healthcare ^w] ；SBTI (Trypsin inhibitor from soybean)、Trypsin、TLCK (L-l-chloro-3-(4-tosylamido)-7-amino-2_he ptanone)、TPCK (L-l-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone)購自 Sigma公司； 其它試劑均為國產(chǎn)分析純。2實驗方法2. 1 從 HEK-293 細(xì)胞中提取 RNA采用QIAGEN RNeasy試劑盒從細(xì)胞中提取RNA，實驗方法參照試劑盒說明。簡要 步驟如下(以下步驟如無特殊說明，所用試劑、容器、器械等均需無RNA酶，所有步驟均應(yīng)在 20-25°C進(jìn)行)將細(xì)胞種于六孔板中，待細(xì)胞長至融合度為70% -80%時，將孔中培養(yǎng)基吸 去，加入適量生理鹽水，輕柔漂洗后棄去生理鹽水。向六孔板中加入350μ1 RLT溶液，輕輕 搖動至細(xì)胞完全裂解。用槍將細(xì)胞裂解物吸入1. 5ml EP管，向樣品中加入350μ 170%乙 醇，吹打混勻(此步驟中可能產(chǎn)生沉淀，但不影響實驗結(jié)果)。將混合液(包含沉淀)吸入 RNeasy mini column中，于IOOOOg離心15秒，棄去穿柱液。向柱中加入700 μ 1 RWl溶液, 于IOOOOg離心15秒，棄去穿柱液和收集管。將RNeasy mini column放入新的收集管中， 加入500 μ 1 RPE溶液，于IOOOOg離心15秒，棄去穿柱液。再次加入500 μ 1 RPE溶液，于 IOOOOg離心2分鐘，棄去穿柱液和收集管。將RNeasy mini column放入新的1. 5ml的收 集管中，加入50μ 1無RNase的水，于12000g離心1分鐘，將穿柱液重新加入管中，再次于 12000g離心1分鐘。得到的穿柱液即為RNA，利用Gene Quant Pro儀(Amersham公司)測 定濃度，立即使用。2. 2RT-PCR2. 2. 1 反轉(zhuǎn)錄用QIAGEN Omniscript反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，實驗方法參照試劑盒說明。簡 單步驟如下(以下步驟如無特殊說明所用試劑、容器、器械等均需無RNA酶)吸取新 鮮提取的 RNA 2· 5μ g，加入 5μ 110X 反應(yīng)緩沖液、5μ 1 dNTP(5mM each) ,5μ 1 Random Hexamers (10 μ Μ)、2 μ 1反轉(zhuǎn)錄酶(4unit/μ 1)，用水補齊體積至50μ 1，輕微振蕩混勻。 37°C孵育90min，得到的cDNA于_20°C保存。2. 2. 2PCR從HEK-293細(xì)胞中提取的RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到所需的cDNA。以其為模板，以下面 一對引物，按照表2方案，在PTC-200梯度熱循環(huán)儀(GMI)上進(jìn)行PCR，擴增人源胰凝乳蛋白 酶原的⑶S從第19位氨基酸至終止密碼子之間的序列(即不包含前18個信號肽)，并分別 在此編碼序列的5’端和3’端引入Nco I和Xho I位點。用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 產(chǎn)物，切下分子量為759bp的條帶，回收并測序(圖2)。Sense :5’ -CATGCCATGGGGTGCGGGGTCCCCGCCATCC-3，
Nco IAntisense :5’ -CCGCTCGAGTCAGTTGGCAGCCAGGATC-3‘Xho I表2使用HEK_293cDNA進(jìn)行PCR的操作步驟。 2. 3構(gòu)建pET32a_胰凝乳蛋白酶原質(zhì)粒向回收的PCR產(chǎn)物和提取的pET32a質(zhì)粒中分別加入Nco I和Xho I限制性核酸 內(nèi)切酶，37°C保溫過夜進(jìn)行雙酶切。用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物并回收目的片段。 將回收后的兩種產(chǎn)物按照10 1(PCR產(chǎn)物質(zhì)粒)的比例加入同一反應(yīng)管中，加入連接酶 緩沖液、T4DNA連接酶(TaKaRa)，16°C連接過夜，得到人源胰凝乳蛋白酶原的表達(dá)載體。2. 4人源重組胰凝乳蛋白酶原的表達(dá)純化將所得pET32a-chymotrypsinogen質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta-gami (DE3)菌株，挑 取單克隆于37°C擴大培養(yǎng)至OD為0.6左右，用ImM IPTG于16°C誘導(dǎo)過夜，收集細(xì)菌。將 細(xì)菌重懸于1/10菌液體積的重懸緩沖液中(20mM Tris-HCl, pH 8. O ；0. 5M NaCl ；20mM咪 唑；ImM PMSF)，超聲破碎細(xì)菌(6s，6s，300W，300次)。于4°C，20000g離心30分鐘收集上 清。用平衡緩沖液(20mM Tris-HCl, pH 8.0 ；0. 5M NaCl ；20mM 咪唑)平衡 Ni Sepharose 6Fast Flow(GE)柱后，將之前得到的上清上樣后，用平衡緩沖液淋洗。最后用洗脫緩沖液 (20mM Tris-HCl，pH 8. O ；0. 5M NaCl ；500mM 咪唑)洗脫，每 Iml 收集。15% SDS-PAGE 檢測 后合并蛋白含量最高的收集管內(nèi)的收集液。2. 5SBT I-Sepharose 親和柱的偶聯(lián)稱取Ig凍干的CNBr激活的S印harose 4B (GE)，用ImM HCl懸浮，使其膨脹。將溶 脹的基質(zhì)倒入層析柱中，用大約200ml ImM HCl分多次淋洗，將其中的添加劑完全去除。將 35mg SBTI (Sigma)溶于 5ml 偶聯(lián)緩沖液(0. IM NaHCO3, pH 8. 3 ；0. 5M NaCl)中。將膨脹好 的CNBr激活的S印harose 4B與SBTI溶液混合后顛倒搖晃，4°C過夜偶聯(lián)。將偶聯(lián)好的基 質(zhì)倒入層析柱，用偶聯(lián)緩沖液至少洗5個柱體積以除去過量的游離態(tài)SBTI。向基質(zhì)中加入 0. IM Tris-HCl,pH 8. O室溫?fù)u晃2小時，以屏蔽剩余的活性基團(tuán)。用buffer Α(0· IM乙酸 / 乙酸鈉，pH 4. O ；0. 5Μ NaCl) ,buffer Β(0· IM Tris-HCl,pH 8. O ；0. 5Μ NaCl)反復(fù)淋洗基 質(zhì)至少3遍，每遍至少5個柱體積。將偶聯(lián)好的基質(zhì)裝柱備用。2. 6酶原的激活以及有活性的胰凝乳蛋白酶的純化將純化的胰凝乳蛋白酶原與胰蛋白酶按照質(zhì)量比400 1混合，于30°C水浴孵育 90分鐘激活酶原。加入TLCK(終濃度100 μ Μ)中和胰酶活性后，利用SBTI-S印harose親 和柱純化得到激活后的胰凝乳蛋白酶。具體步驟如下用平衡緩沖液(20mM Tris-HCl, pH 8. 0 ；0. 25M NaCl)平衡親和柱后，將含有已活化的胰凝乳蛋白酶的樣品上柱，平衡緩沖液淋 洗兩個柱體積后，用ImM HCl洗脫，每Iml收集。2. 7 π -chymotrypsin 的自激 舌
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將純化的胰凝乳蛋白酶置換至20mM Tris-HCl, pH 8. 0的緩沖液中，于37°C孵育 Ih0馬上使用。2. 8肽指紋圖譜鑒定將鹽酸洗脫的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色。將目標(biāo)蛋白條帶從膠 上切下，切成Imm3的小塊，利用脫色緩沖液(50%甲醇；25mM碳酸氫銨，pH 8. 0)脫色。用 洗膠緩沖液(50%甲醇，10%乙酸)洗滌膠塊，然后用HPLC級的水洗滌膠塊。將膠塊轉(zhuǎn)移 至0. 5ml的EP管中，加入乙腈真空干燥脫水。利用含有測序級別的胰酶(lOng/μ 1)的碳 酸氫銨將干燥的膠塊再水合，在37°C酶解18小時。利用抽提緩沖液1(50%乙腈，5%三氟 乙酸)和抽提緩沖液2(75%乙腈，0. 三氟乙酸)先后兩次抽提酶解得到的肽段，合并兩 次抽提得到的上清，將上清真空干燥，并于_20°C保存。利用線性串聯(lián)的納米級C18反相柱 和離子阱型質(zhì)譜儀對樣品進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。2. 9N-末端氨基酸序列分析人源胰凝乳蛋白酶(20mM Tris-HCl, pH 8. 0)經(jīng)15% SDS-PAGE后，通過電轉(zhuǎn)移 技術(shù)，轉(zhuǎn)移至固相載體-聚偏二氟乙烯(polyvinylidinedifluoride membrane, PVDF)膜 上。用考馬斯亮藍(lán)染膜2分鐘后用50%的甲醇脫色。將含有26kD蛋白片段的膜切下，于 ABI-491A蛋白測序儀(Applied Biosystems)上檢測該胰凝乳蛋白酶片段末端的氨基酸組 成。2. 10抑制劑對胰凝乳蛋白酶活性的影響檢測胰蛋白酶特異性抑制劑TLCK、胰凝乳蛋白酶特異性抑制劑TPCK對純化的胰 凝乳蛋白酶活性的抑制作用。采用的蛋白酶抑制劑終濃度分別為ΤΙΧΚ(5μΜ，0.5μΜ)； TPCKd μ M，0. 1 μ Μ)。取一定量胰凝乳蛋白酶分別加入兩種蛋白酶抑制劑在37°C孵育30分 鐘，然后加入10 μ gBid (終體積20 μ 1)混合均勻，于37°C反應(yīng)1小時。利用15 %的SDS-PAGE 檢測胰凝乳蛋白酶對Bid的剪切情況。3實驗結(jié)果3. 1人源胰凝乳蛋白酶原表達(dá)載體的構(gòu)建按照表2條件進(jìn)行PCR，得到一條特異的分子量正確的明亮條帶。將此條帶進(jìn)行測 序(圖2)，結(jié)果顯示此條帶的序列與人的胰凝乳蛋白酶原的序列完全吻合。將此片段連入 pET32a中，即獲得了人源胰凝乳蛋白酶原的表達(dá)載體。3. 2人源胰凝乳蛋白酶原的表達(dá)我們在表達(dá)過程中選用了 Rosetta-gami (DE3)這種trxB/gor雙突變的表達(dá)宿 主菌，該菌具有細(xì)胞質(zhì)二硫化物還原系統(tǒng)的兩個突變，可以增加E. coli細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵 的形成。同時為了進(jìn)一步增加蛋白可溶性，我們使用pET32a載體進(jìn)行表達(dá)。pET32a具有 以下幾個優(yōu)點(1)該載體可以在目標(biāo)蛋白的N端引入trx-tag，該標(biāo)簽可以進(jìn)一步促進(jìn) 二硫鍵在細(xì)菌胞質(zhì)中的形成，對富含二硫鍵蛋白的表達(dá)至關(guān)重要。(2)該載體的組氨酸 標(biāo)簽可以選擇性地融合表達(dá)于目標(biāo)蛋白的兩端。如將該標(biāo)簽表達(dá)于目標(biāo)蛋白的N端，之 后可以通過腸激酶剪切位點將所有標(biāo)簽去除，得到接近天然構(gòu)象的目標(biāo)蛋白。在構(gòu)建了 pET32a-chymotrypsinogen的表達(dá)載體之后(圖3)，按照前述實驗方法，我們成功純化出了 大量可溶性的人源胰凝乳蛋白酶原(圖4)。3. 3胰凝乳蛋白酶原的激活
人胰凝乳蛋白酶原的理論分子量為26kD，而表達(dá)的酶原由于含有三個標(biāo)簽，分子 量在43kD左右。在酶原被激活之前，理論上需要用腸激酶將位于融合蛋白N端的trx-tag、 His-tag.S-tag三個標(biāo)簽除去，以得到接近天然序列的胰凝乳蛋白酶原，從而用于后續(xù)有活 性的酶的制備。然而由于腸激酶價格及其昂貴，要完全切割純化得到的融合酶原需較大用 量，這樣無疑會給實驗室純化增加成本，而且不適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。因此我們對該融 合酶原的活化進(jìn)行了研究。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，載體上腸激酶的識別位點DDDDK同樣存在 于胰蛋白酶的前肽(prop印tide)上。胰蛋白酶同樣也是由胰臟腺細(xì)胞以酶原形式分泌，之 后在小腸中被腸激酶激活，進(jìn)而可活化胰凝乳蛋白酶。激活后的胰酶可進(jìn)一步自激活，自激 活的剪切位點同樣位于DDDDK后面的肽鍵。因此我們思考是否可首先利用胰酶自激活的特 性，直接向43kD的含有標(biāo)簽的融合酶原中加入一定量的胰酶，使其在腸激酶位點后對該融 合酶原進(jìn)行剪切從而將標(biāo)簽去除，得到接近天然序列的胰凝乳蛋白酶原，然后再利用胰酶 可激活胰凝乳蛋白酶原而不是非特異性將其降解的特性，進(jìn)一步得到有活性的胰凝乳蛋白 酶？在該實驗中，胰酶用量有嚴(yán)格要求。幸運的是，按照實驗方法2. 6中提到的激活及純 化方式，發(fā)現(xiàn)用文中所述用量的胰蛋白酶激活胰凝乳蛋白酶原的同時，也可以將融合蛋白N 端的標(biāo)簽完全去除，得到分子量為26kD的目標(biāo)蛋白(圖5A)。此外采用SBTI-S印harose作為親和層析介質(zhì)，只能結(jié)合那些被激活的、有活性的 且正確折疊的人源胰凝乳蛋白酶，而那些折疊錯誤或被錯誤激活的重組蛋白則被從純化產(chǎn) 物中去除，因此可進(jìn)一步提高該方法的純化效率。3. 4 激 舌后得至Ij π -chymotrypsin從前面的實驗結(jié)果可見，通過還原型SDS-PAGE，可得到分子量為26kD的單一條 帶。然而根據(jù)經(jīng)典的激活理論(圖6)，有活性的胰凝乳蛋白酶應(yīng)由三條肽鏈組成，它們之間 靠二硫鍵連接，在進(jìn)行還原型SDS-PAGE時，應(yīng)該得到三條電泳條帶(其中一條由于分子量 只有不到2kD，因此不易檢測)。這與我們的實驗結(jié)果不符，造成這種差異的原因究竟是什 么呢？純化產(chǎn)物可對底物Bid進(jìn)行剪切，證明我們得到的胰凝乳蛋白酶確實是有活性的， 且該活性可被胰凝乳蛋白酶的特異性抑制劑TPCK所抑制(圖5B)，因此我們猜測激活得到 的酶為π-chymotrypsin。胰凝乳蛋白酶原經(jīng)胰酶激活后首先形成π-chymotrypsin，剪切 后的前肽仍然通過二硫鍵連接到有活性的酶上。經(jīng)還原型SDS-PAGE后理論上形成兩條肽 鏈，但由于前肽較小而不易檢測。將還原型SDS-PAGE得到的單一條帶進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜 檢測及N端蛋白測序(圖7)，結(jié)果驗證了我們的猜測。在肽指紋圖譜中，我們沒有看到覆蓋 前肽部分的肽段，而N端測序結(jié)果顯示的正是從34位開始的五個氨基酸序列。實驗中得到 的π -chymotrypsin沒有被繼續(xù)自激活形成α -chymotrypsin,是因為我們控制激活條件 的結(jié)果。有活性的π-chymotrypsin洗脫后保存在ImM HCl中，低pH可抑制chymotrypsin 的自激活，因為在此pH時催化三聯(lián)體中的His75被質(zhì)子化導(dǎo)致chymotrypsin失活[12]。如將得到的π -chymotrypsin置于pH 8. 0的緩沖液中孵育一段時間，可以看到其 被自激活成為α-chymotrypsin。如圖8A所示，+/-DTT的π-chymotrypsin樣品分子量有 少許差別，可能是由于前肽分子量造成的差異，也可能是由于還原劑對蛋白構(gòu)象造成的差 異在SDS-PAGE上的體現(xiàn)。而對于含有DTT的自激活樣品(圖8B)，可以看到其包含26kD、 14kD和IlkD三條電泳條帶。其中26kD是沒有被自激活的π -chymotrypsin,而14kD和 IlkD分別對應(yīng)α -chymotrypsin的B鏈及C鏈。對于不含有DTT的自激活樣品，只能在26kD看到兩條分子量接近的蛋白條帶，分別對應(yīng)π -chymotrypsin和α -chymotrypsin。由于Ji -chymotrypsin自激活成為α -chymotrypsin后，會進(jìn)一步發(fā)生自降解，造 成酶活性及含量降低，因此在本實驗中純化的蛋白通常以π-chymotrypsin的形式保存于 HCl中，使用前根據(jù)需要進(jìn)行自激活。4 小結(jié)本發(fā)明通過RT-PCR從HEK-293細(xì)胞cDNA中獲得全長人源胰凝乳蛋白酶原基因， 并構(gòu)建了其表達(dá)載體。通過與pET32a的trx-tag形成融合蛋白，并配合使用含有細(xì)胞質(zhì)二 硫化物還原系統(tǒng)兩個突變的菌株Rosetta-gami (DE3)，得到了毫克級的人源胰凝乳蛋白酶 原可溶性蛋白。之后巧妙地利用胰蛋白酶的自激活特性，成功地去除了融合蛋白上的標(biāo)簽， 并同時將酶原激活，從而獲得了接近天然序列的酶。該實驗在酶原激活的同時完成了標(biāo)簽 的去除，避免了昂貴的腸激酶的使用。生產(chǎn)成本的降低無疑給該工作帶來了廣闊的工業(yè)應(yīng) 用前景。1. Folk JE, Schirmer EW(1965) Chymotrypsin C. I. Isolation of the Zymogen and the Active Enzyme !Preliminary Structure and Specificity Studies. J Biol Chem 240 181-1922. Appel W(1986)Chymotrypsin :molecular and catalytic properties. Clin Biochem 19 :317_3223. Smith EL, Brown DM， Laskowski M (195 1) Mo 1 ecular weights of chymotrypsinogen and chymotrypsin alpha and B. J Biol Chem 191 :639_6504. Hudaky P，Kaslik G，Venekei LGraf L(1999) The diffrential specificity of chymotrypsin A and B is determined by amino acid 226. Eur J Biochem 259 528-5335. Avakian S (1964)Further Studies on the Absorption of Chymotrypsin. Clin Pharmacol Ther 5 :712-7156.Brakenbury PH, Kotowski J(1983)A comparative study of the management of ankle sprains. Br J Clin Pract 37 181-1857.Glozman VG, Anchupane IS (1982)[Use of chymotrypsin in inflammatory diseases of the scrotal organs]. Urol Nefrol(Mosk) :44_468.Kobayashi T， Ozone H, Kamei H, Ishimaru K (1984) [Chymoral for inflammatory diseases in the orodental area]. Shikai Tenbo 64 813-8189. Roberts AD，Hart DM(1983)Polyglycolic acid and catgut sutures, with and without oral proteolytic enzymes,in the healing of episiotomies. Br J Obstet Gynaecol 90 :650_65310.Curvers S，Brixius P，Klauser T，Thommes J，Weuster-Botz D，TakorsR， Wandrey C(2001)Human chymotrypsinogen B production with Pichia pastoris by integrated development of fermentation anddownstream processing.Part 1. Fermentation. Biotechnol Prog 17 :495_50211.Venekei I，Graf L，Rutter WJ (1996)Expression of rat chymotrypsinogen in yeast :a study on the structural and functional significance of thechymotrypsinogen propeptide. FEBS Lett 379:139-142 12. Hess GP, McConn J, Ku Ε, McConkey G(1970)Studies of the activity ofchymotrypsin. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 257 :89_10權(quán)利要求
一種人源胰凝乳蛋白酶的分離純化方法，其特征在于所述人源胰凝乳蛋白酶原的激活和標(biāo)簽的去除在一步完成，不引入腸激酶，而是只使用胰蛋白酶，其包括以下步驟a)獲得人源胰凝乳蛋白酶原編碼序列；b)將上述獲得的人源胰凝乳蛋白酶原編碼序列引入原核表達(dá)系統(tǒng)中，得到重組質(zhì)粒；c)將上述得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞質(zhì)二硫化物還原系統(tǒng)的兩個突變的宿主菌株進(jìn)行人源重組胰凝乳蛋白酶原的表達(dá)純化；d)將上述純化的胰凝乳蛋白酶原與胰蛋白酶混合以激活酶原。
2.權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括下列步驟e)利用SBTI-Sepharose親和柱純化得到激活后的胰凝乳蛋白酶。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述人源胰凝乳蛋白酶原編碼序列如SEQID NO 1所顯示。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述原核表達(dá)系統(tǒng)為促進(jìn)二硫鍵形成的載體。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述促進(jìn)二硫鍵形成的載體為pET32a載體。
6.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中具有細(xì)胞質(zhì)二硫化物還原系統(tǒng)的兩個突變的宿主 菌株是 E.coli Rosetta-gami (DE3)菌株。
7.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中在步驟d)中，將純化的胰凝乳蛋白酶原與胰蛋白 酶按照質(zhì)量比100 1-1000 1混合。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中純化的胰凝乳蛋白酶原與胰蛋白酶按照質(zhì)量比 400 1混合。
9.權(quán)利要求1-8任一項所述的方法，其中在步驟d)中，將純化的胰凝乳蛋白酶原與胰 蛋白酶混合后，在16-37°C反應(yīng)30-120分鐘。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中在步驟d)中，將純化的胰凝乳蛋白酶原與胰蛋白酶混 合后，在30°C反應(yīng)90分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人源胰凝乳蛋白酶的分離純化方法，其特征在于所述人源胰凝乳蛋白酶原的激活和標(biāo)簽的去除在一步完成，不引入腸激酶，而是只使用胰蛋白酶，其包括以下步驟a)獲得人源胰凝乳蛋白酶原編碼序列；b)將上述獲得的人源胰凝乳蛋白酶原編碼序列引入原核表達(dá)系統(tǒng)中，得到重組質(zhì)粒；c)將上述得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞質(zhì)二硫化物還原系統(tǒng)的兩個突變的宿主菌株進(jìn)行人源重組胰凝乳蛋白酶原的表達(dá)純化；d)將上述純化的胰凝乳蛋白酶原與胰蛋白酶混合以激活酶原。該發(fā)明在酶原激活的同時完成了增溶標(biāo)簽的去除，避免了昂貴的腸激酶的使用，同時可獲得幾乎不含多余氨基酸的重組蛋白。生產(chǎn)成本的降低無疑給該工作帶來了廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。本發(fā)明純化所得的胰凝乳蛋白酶表達(dá)量高，純度好，成本低，可以有效地用于治療及化學(xué)領(lǐng)域。
文檔編號C12N9/76GK101914557SQ20101023126
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者衛(wèi)濤濤, 楊福愉, 趙凱 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所