專利名稱：重組角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(scce)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組多肽和編碼所述多肽的核苷酸序列，能夠表達所述多肽的表達系統(tǒng)以及含有所述多肽的藥物和化妝品組合物和所述多肽用于各種化妝品或治療目的的用途。本發(fā)明簡述皮膚作為一種器官從生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和美容學(xué)的角度來說，均是令人感興趣的。目前存在大量器官特異性(如牛皮癬和濕疹)或者全身性疾病表現(xiàn)(如一般的過敏反應(yīng))的皮膚病?？梢哉J為存在皮膚特異性疾病的事實是存在皮膚所特有的分子機制的證據(jù)。類似地，對于皮膚特異性分子過程的研究對于理解和治療皮膚病是非常重要的。似乎可以合理地推測幾種這類過程以這樣或那樣的方式與皮膚最特殊化的功能相關(guān)，這種功能即在人體外部和內(nèi)部之間形成物理-化學(xué)屏障。該物理-化學(xué)皮膚屏障位于皮膚的最外層，即角質(zhì)層。
角質(zhì)層是皮膚最特殊化的結(jié)構(gòu)。它是表皮分化過程的最終產(chǎn)物，即為構(gòu)成皮膚最外層部分的復(fù)層扁平上皮。大部分表皮細胞由處于各種分化狀態(tài)的角化細胞組成。最下層的角化細胞即基底細胞位于與真皮接觸的基底膜(即皮膚的結(jié)締組織)上，而且它是唯一有分化能力的角化細胞。不斷有部分基底細胞離開基底膜，進行最終使細胞變成組成角質(zhì)層構(gòu)成單元的分化過程。在該過程中，角化細胞要經(jīng)過大量的適應(yīng)性改變。其中之一是增加由表皮特異性細胞角蛋白組成的細胞骨架的含量。通過增加橋粒的數(shù)目而使鄰接細胞的中間絲與功能單位相連。最顯著的變化發(fā)生于從最上面的活細胞層，即顆粒層到死亡的角質(zhì)層的轉(zhuǎn)變期間(該過程通常稱為角質(zhì)化)。在靠近質(zhì)膜內(nèi)面，沉淀有共價交聯(lián)的蛋白質(zhì)，形成了很堅固的細胞被膜。此外，在角化細胞特異性細胞器中產(chǎn)生的富脂物質(zhì)被分泌到細胞外間隙，并通過形成環(huán)繞角質(zhì)層細胞的脂質(zhì)薄層而組成對親水物質(zhì)有通透性的屏障。最后，除致密包裝的細胞角蛋白絲外，所有的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)均消失。
因此，角質(zhì)層的細胞(角質(zhì)細胞)是不具活力的。這意味著調(diào)整角質(zhì)層內(nèi)的各種過程一定是在角質(zhì)化細胞仍存活時“演變進程(programming)”的結(jié)果。在脫屑過程中，細胞從皮膚表面脫落從而結(jié)束了表皮的循環(huán)，循環(huán)過程通常需要約4個星期，在此期間，約有2周的時間細胞作為角質(zhì)層的部分，該過程就是角質(zhì)層“演變進程”的一個實例。角質(zhì)層起物理-化學(xué)屏障功能的先決條件是它的單個細胞要由機械性抗性結(jié)構(gòu)，即橋粒固定在一起。必須要調(diào)節(jié)橋粒的降解作用(即脫屑的先決條件)以便使細胞從皮膚表面脫落，這樣即可平衡角質(zhì)層的重新產(chǎn)生而不會影響該組織的屏障功能。角質(zhì)化疾病在許多嚴重程度不同的皮膚病理狀態(tài)下，均有角質(zhì)化過程失調(diào)。對于牛皮癬來說，除典型的慢性炎癥外，還有未成熟角質(zhì)層的過度產(chǎn)生，導(dǎo)致這種疾病典型的起鱗屑的癥狀。有一組遺傳性皮膚病，其特征在于角質(zhì)層增厚，從而導(dǎo)致形成“魚鱗”，被稱為魚鱗病。在幾種魚鱗病中，均存在脫屑速度降低。盡管嚴重程度低于魚鱗病，但“干皮”(干皮病)的特征也是角質(zhì)細胞從角質(zhì)層脫落，但與正常情況下，脫落單個細胞或小的細胞聚集物不同，而是脫落大的肉眼可見的鱗片。在老人和特應(yīng)性者，即對皮膚刺激的抗性降低和有可能發(fā)展成內(nèi)生性濕疹的特征形式之個體中間，這種紊亂很常見。在痤瘡病中，在皮脂腺的導(dǎo)管中存在失調(diào)的角質(zhì)化，從而導(dǎo)致了粉刺和堵塞的形成，粉刺的形成先于并被認為誘發(fā)了炎性痤瘡損傷。與角質(zhì)化有關(guān)的蛋白水解酶在蛋白水解酶似乎起重要作用的角質(zhì)化過程和角質(zhì)層循環(huán)期間存在幾個階段。可以肯定的是，除存在于在有活力的和角質(zhì)化的表皮層之間轉(zhuǎn)變過程中的細胞角蛋白絲外，所有細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)均消失，這一定涉及蛋白水解作用。profilaggrin向filaggrin(據(jù)認為是在角質(zhì)化過程中，對特殊類型的細胞角蛋白絲的聚集起作用的蛋白質(zhì))的轉(zhuǎn)化可能由特異性蛋白酶催化。在角質(zhì)層中，filaggrin被進一步降解成低分子量組分，這種組分作為“天然濕潤劑”可能是很重要的。另外，在角質(zhì)化過程中，存在細胞角蛋白多肽的蛋白水解修飾作用。最后，在最終導(dǎo)致脫屑的過程中，蛋白水解過程對于角質(zhì)層內(nèi)細胞間粘連結(jié)構(gòu)的降解可能起重要作用。角質(zhì)層細胞粘連和脫屑。橋粒的作用在角質(zhì)層和表皮有活力部分內(nèi)的細胞間粘連中，橋粒的介導(dǎo)程度非常明顯。橋粒由2個對稱的部分組成，每一半均由兩個鄰接的細胞形成。每一半橋粒均有一個與細胞角蛋白絲相連的細胞內(nèi)部分和由固定于細胞內(nèi)并帶有跨膜和細胞外部分的糖蛋白組成的部分。這些蛋白質(zhì)的細胞外部分(desmogleins)是粘連分子，并通過在細胞外間隙中它們彼此間的相互作用而形成粘連結(jié)構(gòu)。在手掌和足底的角質(zhì)層中，橋粒的降解似乎沿與非手掌-足底的角質(zhì)層不同的途徑進行。在后者的組織中，在細胞完全角質(zhì)化后不久，約85％的橋粒就會消失。剩下的橋粒(優(yōu)先地位于極扁平細胞的長軟毛的邊緣)直到脫屑時仍會保持完整。在手掌-足底角質(zhì)層中，角質(zhì)細胞不太平坦，在該組織的較深層內(nèi)，沒有大范圍的降解。在這兩種組織中，脫屑均與橋粒降解有關(guān)。在魚鱗皮膚和“干性皮膚”中，已經(jīng)表明角質(zhì)層表層中的橋粒數(shù)目增加。角質(zhì)層細胞間的脂質(zhì)手掌-足底和非手掌-足底角質(zhì)層間橋粒降解的不同，可能與這兩類組織中細胞外脂質(zhì)數(shù)量的不同有關(guān)。在非手掌-足底角質(zhì)層中，脂質(zhì)含量相當高。作為對水和其它親水物質(zhì)的通透性屏障，該組織的效率必然優(yōu)于手掌和足底的角質(zhì)層。由于橋粒占相當?shù)捏w積并且由于完整的橋粒防止細胞外間隙的擴展，橋粒的降解可能是一種使脂質(zhì)得到更大的細胞外間隙的機制。角質(zhì)層的細胞外脂質(zhì)還以其它幾種方式與脫屑相關(guān)。由于它們是細胞外間隙的主要組分，所以認為它們對在該位置具有功能之酶(如引起橋粒降解的酶)的活性可能有重要的影響。的確，已表明脂質(zhì)代謝的各種失調(diào)可能是幾種魚鱗病的原因。還有可能是，脂質(zhì)本身造成了不同程度的角質(zhì)細胞粘連。此外，脂質(zhì)分泌到角質(zhì)層細胞外間隙可能也與分泌的大量酶有關(guān)。脂質(zhì)的前體貯存于特定細胞器內(nèi)的上層有活力的角質(zhì)化細胞中。已證明這些所謂的片層體還含有大量的水解酶。因此設(shè)想角質(zhì)化細胞可能以失活的酶原形式合成使角質(zhì)層中之橋粒降解的酶，該酶貯存于片層體中，然后在角質(zhì)化過程中活化并被分泌到角質(zhì)層細胞外間隙，而且由其他因素中的細胞外脂質(zhì)之組合物進一步調(diào)節(jié)其活性。在有活力的表皮中之細胞粘連的紊亂有許多皮膚病，其中在非角質(zhì)化的有活力表皮層中的角質(zhì)化細胞間存在粘連受損。這些疾病以所謂皮膚棘層松解現(xiàn)象為特征，皮膚棘層松解即其它明顯正常的角質(zhì)細胞間之橋粒接觸斷裂。該過程可能是由迄今尚未完全鑒定的蛋白酶介導(dǎo)的。皮膚棘層松解(在廣泛導(dǎo)致水瘡形成時)是自身免疫疾病尋常天皰瘡和落葉狀天皰瘡、遺傳性良性家族天皰瘡(Hayley-Hayley’s病)和遺傳性異常角化濾泡癥(follicularis)(毛囊角化病)的特征。表皮在免疫和炎癥反應(yīng)中起積極作用除其作為機體內(nèi)部和外部之間物理-化學(xué)屏障之產(chǎn)生者的功能外，表皮還作為活性免疫屏障而起作用、通過與免疫和炎癥系統(tǒng)之細胞聯(lián)系和相互作用，角質(zhì)化細胞具有產(chǎn)生大量細胞因子和其它炎性介質(zhì)并對其作出反應(yīng)的能力。在宿主抗微生物感染的防御和損傷愈合中，這是最重要的?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明在許多炎癥性皮膚病如牛皮癬和濕疹中，角質(zhì)化細胞可能起積極作用。在炎癥中表皮蛋白酶可能是重要的由角質(zhì)化細胞產(chǎn)生的細胞因子之一是白細胞介素1(Il-1)。Il-1以兩種形式即Il-1α和Il-1β存在，兩者均存在于表皮中。合成的Il-1α有完全的活性，而Il-1β以無活性的31KD原形式(pro-form)被合成。由例如在單核細胞中但迄今在正常表皮中尚未檢測到的特異性蛋白酶，將Il-1β原轉(zhuǎn)變成有活性的17KD形式，但許多具有胰凝乳蛋白酶樣底物特異性的絲氨酸蛋白酶(嗜中性粒細胞的胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)和組織蛋白酶G)也可作為Il-1β原激活劑。
正如Norris(1990)所說明的，角質(zhì)層細胞內(nèi)空間中的蛋白水解酶可在特定條件下將無活性形式的細胞因子轉(zhuǎn)變成活化形式。在該文中，特別研究了已表明由角質(zhì)化細胞產(chǎn)生的(Mizutani et al.，1991)沒有生物學(xué)活性的白細胞介素-1β原。迄今，尚未發(fā)現(xiàn)能將白細胞介素-1β原轉(zhuǎn)變成活性白細胞介素-1β的表皮酶。但由于胰凝乳蛋白酶和組織蛋白酶G(一種胰凝乳蛋白酶樣酶)有能力催化無活性的31KD重組白細胞介素1β原轉(zhuǎn)變?yōu)橛型耆钚缘?7KD形式，因此，表皮胰凝乳蛋白酶樣酶也可能催化這種轉(zhuǎn)變。本發(fā)明詳述本發(fā)明涉及已定義為角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(stratum corneumchymotryptic enzyme，SCCE)的酶，認為所述SCCE引起角質(zhì)層中橋粒的降解。實施例1提供的證據(jù)表明細胞從皮膚角質(zhì)化之表層的表面脫落涉及橋粒蛋白的降解，而且有關(guān)酶似乎是可由鋅離子抑制的胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。
實施例2描述角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(SCCE)的發(fā)現(xiàn)；所述蛋白酶滿足引起體外而且可能也是體內(nèi)降解角質(zhì)層細胞內(nèi)粘連結(jié)構(gòu)的要求。實施例3用產(chǎn)色素的底物描述角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(SCCE)活性的部分特征。
結(jié)果說明SCCE在酶學(xué)上不同于其它胰凝乳蛋白酶。與牛胰凝乳蛋白酶和人組織蛋白酶G相比，SCCE的抑制劑圖譜和降解兩種不同胰凝乳蛋白酶樣酶之底物的能力顯著不同。SCCE似乎也不同于人肥大細胞胃促胰酶。后者有效地催化Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA的降解(參見Schwartz et al.，1987和Schechter et al.，1989)，而SCCE不能；且胃促胰酶不受抑肽酶或SBTI的抑制(Schechter etal.，1983和Wintroub et al.，1986)，但SCCE會受到這種抑制。
實施例4描述了通過對不溶性大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)進行親和層析而從角質(zhì)細胞的KCl-提取物中部分純化SCCE并確定SCCE的N端氨基酸序列。用未還原的樣品，在1-6步中產(chǎn)率較好，但在7和9步，產(chǎn)率降至零，而且在隨后的步驟中，產(chǎn)率明顯降低。再用還原樣品，在步驟7和9中檢測不到氨基酸衍生物，但在可檢測到衍生物的隨后步驟中，產(chǎn)率沒有急劇的降低。這些結(jié)果說明，在7和9位有Cys。但在用碘乙酸(100mM)還原和處理后，在步驟7和9中不可能檢測到羧甲基化的Cys。由還原和未還原樣品得到的序列(圖13，SEQ ID NO3)相同。
實施例5描述了制備SCCE特異性單克隆抗體和多克隆的SCCE特異性雞和兔抗體以及用單克隆抗體進行的免疫組織化學(xué)研究。
實施例6描述了編碼人SCCE之cDNA的克隆和測序。首先，用抗SCCE的兔多克隆抗體篩選由得自成人表皮源之角質(zhì)化細胞的mRNA制備的cDNA文庫。一種抗體產(chǎn)生了高本底信號，將其排除于早期的廣泛篩選研究之外。用另一多克隆抗體(D-5)，按預(yù)計為得到真正陽性噬菌斑而富集大量的免疫反應(yīng)性噬菌斑。但對于任何噬菌斑，用單克隆抗體moAb4和moAb9均未觀察到反應(yīng)性。11個分離的噬菌斑的廣泛限制酶特征和PCR特征表明，在不同噬菌斑之間沒有檢測到相似性。基于這種未能定義可能的SCCE cDNA序列的“指紋”，不得不對策略進行修改。
除優(yōu)先檢測上基底角化細胞中的SCCE免疫反應(yīng)性物質(zhì)外，還用從培養(yǎng)的人角化細胞制備的cDNA文庫篩選SCCE cDNA。期望所述文庫含有僅來自基底角化細胞的cDNA。這種嘗試是以用基底角化細胞的SCCE單克隆抗體而觀察到的弱但可能明顯的免疫著色為基礎(chǔ)的。
用合成的17-聚體寡核苷酸探針篩選噬菌斑，所述探針是以實施例4中所述之實驗確定的天然SCCE酶之N端序列的最可靠部分的氨基酸序列，Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro(SEQ ID NO10，aa1-aa6)為基礎(chǔ)設(shè)計的。由于實驗確定的氨基酸序列內(nèi)的不確定性，所以判斷該六肽為代表最可靠的部分之一。另外，編碼該六肽的可能密碼子會使DNA探針的簡并性最低。排除了較長的實驗確定的序列(Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Ser-Gly-Asn-Gln-Leu(SEQ IDNO3，aa15-aa24)，原因在于編碼該肽序列的序列有高度的簡并性。在初次篩選中鑒定了14個陽性噬菌斑。用相同的探針和上述方法，再篩選這些陽性噬菌斑。再篩選過程后，鑒定了2個陽性噬菌斑。將所選的2個噬菌斑再純化一次，然后用SYM 1600和SYN 1601(與兩個噬菌體臂互補)作為引物和分離的噬菌體作為模板通過PCR確定插入片段的大小。將該克隆片段進行部分序列分析。
翻譯所得的DNA序列得到與實驗確定的蛋白質(zhì)序列同源的氨基酸序列。但該序列缺乏翻譯的起始密碼子。為了分離全長cDNA，在瓊脂糖凝膠上分離所得的DNA片段，然后作為在嚴格條件下可進行雜交的探針。為了得到全長cDNA，用與上述相同的方法，除于65℃在嚴格條件下雜交外，用該探針將cDNA文庫再篩選2次。這些實驗使得最終鑒定并分離了45個陽性噬菌斑，所述噬菌斑最初是通過使用SYM1600或SYN 1601與SYM 3208組合作為引物的PCR分析法篩選的，所述引物是為了鑒別含完整5’開放閱讀框架的噬菌斑。
進一步篩選并進行序列分析后，按實施例6中的詳述克隆得自這些噬菌體的所述PCR擴增片段，結(jié)果表明其中的一個噬菌體205.2.1含有全長插入片段。確定cDNA片段的完整核苷酸序列。核苷酸序列(SEQ ID NO1)含有足以編碼SCCE前體蛋白之完整氨基酸序列的開放閱讀框架，所述前體蛋白由包括信號肽和前多肽(SEQ ID NO2)的253個氨基酸組成。
實施例7描述了在人表皮中檢測兩種SCCE mRNA，所述的mRNA能與在SCCE cDNA序列基礎(chǔ)上制備的cDNA探針雜交。
實施例8描述了在E.coli中表達重組SCCE。結(jié)果表明在細菌中有可能生產(chǎn)重組SCCE。
實施例9描述了在哺乳動物細胞中表達重組人SCCE。得到了三種蛋白質(zhì)，它們能與所有可得到的多克隆兔和雞SCCE抗體以及保藏的單克隆抗體反應(yīng)。與抗天然SCCE的抗體反應(yīng)的重組蛋白質(zhì)的表觀分子量，比純化的天然人SCCE大約1KDa。重組蛋白質(zhì)沒有任何蛋白水解活性。
實施例10中描述了重組SCCE的純化、活化及進一步的特征描述。用胰蛋白酶或內(nèi)肽酶Lys-C可經(jīng)蛋白水解裂解而激活無活性的重組SCCE的原形式。已考慮到大量在堿性氨基酸后能裂解肽的其它蛋白酶，如內(nèi)蛋白酶Lys-C、木瓜蛋白酶和血纖維蛋白溶酶能將SCCE原激活成有活性的SCCE。已發(fā)現(xiàn)信號肽由22個氨基酸組成并以天然活性SCCE的N端氨基酸序列為基礎(chǔ)，多肽由7個氨基酸組成。此外，還表明產(chǎn)生的重組SCCE存在兩種N-糖基化形式和一種非糖基化形式，這與用有活性的天然SCCE得到的結(jié)果類似。
術(shù)語“角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(SCCE)”或者“有SCCE活性的多肽”在最廣泛的意義上指絲氨酸蛋白酶或其原形式，如可經(jīng)蛋白水解裂解而激活的酶原(SCCE原)或融合蛋白，通過與自發(fā)的細胞解離相同的抑制劑和相似的方法可抑制所述酶的活性形式，所述解離可以在含有皮膚角化層之樣品的模型系統(tǒng)中誘導(dǎo)，所述樣品于生理溫度在中性或近似中性的pH中溫育。
具體地說，術(shù)語“具有SCCE活性的多肽”因此指一種多肽，它不同于胰凝乳蛋白酶和組織蛋白酶G而且其活性形式能降解底物MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA(S-25-86)，按實施例3和13以及圖9和表5中的說明，由所述多肽進行降解可由抑肽酶、抑糜朊酶素和硫酸鋅抑制。
更進一步說，術(shù)語“具有SCCE活性的多肽”是指一種多肽，它能夠在足底角質(zhì)層體外培養(yǎng)期，經(jīng)蛋白水解降解橋粒蛋白desmoglein I。
所述多肽通常還與抗天然SCCE的抗體反應(yīng)，所述SCCE是從分離的足底角質(zhì)層細胞之提取物中純化的。所述抗體的實例是按5.2中描述產(chǎn)生的多克隆抗體和按實施例5.1中所述產(chǎn)生的單克隆抗體TE4b和TE9b。所述單克隆抗體由根據(jù)布達佩斯條約分別以保藏號ECACC 93061817和ECACC 93061816保藏于歐洲動物細胞培養(yǎng)物收集中心(Porton，Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，UnitedKingdom)的雜交瘤TE4b和TE9b產(chǎn)生。
實施例6中描述了編碼人SCCE之cDNA的克隆和測序。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了含有足以編碼SCCE前體蛋白之完整氨基酸序列的開放閱讀框架的核苷酸序列，所述前體蛋白由包括信號肽和前多肽的253個氨基酸組成。核苷酸序列列于SEQ ID NO1，推測的“角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(SCCE)”之氨基酸序列列于SEQ ID NO2。
術(shù)語“SCCE原或其類似物或變異體”指含有氨基酸序列SEQ IDNO2或所述序列之類似物或變異體多肽，所述序列是在適當?shù)谋磉_系統(tǒng)中表達本發(fā)明的核苷酸序列時產(chǎn)生的，并且經(jīng)蛋白水解活化后產(chǎn)生可由與自發(fā)性細胞解離過程中相同的抑制劑抑制的絲氨酸蛋白酶，在含有皮膚角質(zhì)層之樣品的模型系統(tǒng)中可誘導(dǎo)所述的細胞解離，而所述樣品是在生理溫度，即約37℃，于中性或近似中性pH上培養(yǎng)的。通常，所述蛋白質(zhì)與抗純化的天然或重組SCCE的抗體反應(yīng)。
術(shù)語“SCCE或其類似物或變異體”指具有氨基酸序列SEQ IDNO2或所述序列之類似物或變異體的多肽，所述序列是在適當?shù)谋磉_系統(tǒng)中表達本發(fā)明的核苷酸序列時產(chǎn)生的，而且是一種可經(jīng)與自發(fā)性細胞解離過程中相同的抑制劑抑制的絲氨酸蛋白酶，可以在含皮膚角質(zhì)層之樣品的模型系統(tǒng)中誘導(dǎo)所述的細胞解離，所述樣品是在生理溫度，即約37℃，于中性或近似中性pH下培養(yǎng)的。通常，所述蛋白質(zhì)將會與抗純化的天然或重組SCCE抗體反應(yīng)。
因此，術(shù)語“其類似物或變異體”指并不具有精確的SEQ IDNO2所示的氨基酸序列，但仍具有如上所定義之“SCCE活性”的多肽。通常，與實施例中所述的SCCE蛋白質(zhì)相比，所述多肽是例如在氨基酸組成，或翻譯后修飾如糖基化或磷酸化方面，在一定范圍內(nèi)變化的多肽。
因此，本發(fā)明說明書中所用的術(shù)語“類似物或變異體”是指具有與來自實施例6所述的SCCE蛋白的特征性的氨基酸序列SEQ ID NO2有相似的氨基酸組成或序列的蛋白質(zhì)或多肽，允許改變氨基酸序列的微小改變，如，氨基酸的缺失，定點誘變，額外氨基酸的插入，或其組成，以得到SCCE蛋白質(zhì)類似物。這些修飾使得可以得到類似物的所需和有用的新特性。類似物多肽或蛋白質(zhì)可以得自動物或人或者可以是部分或完全來自合成。使用重組DNA技術(shù)，也可以得到所述的類似物。
因此，本發(fā)明的一個重要的實施方案涉及一種多肽，其中，已用不同的氨基酸殘基取代了至少一個氨基酸殘基，和/或其中已至少缺失或增加了一個氨基酸殘基以便得到含有不同于SEQ ID NO2所示氨基酸序列或如下文所定義的所述氨基酸序列之亞序列的氨基酸序列，但基本具有上述SCCE活性的多肽。
本發(fā)明的一個有價值的實施方案涉及一種多肽，它是本發(fā)明多肽的類似物或亞序列，含有50-250個氨基酸，例如，至少70個氨基酸，至少100個氨基酸，至少150個氨基酸或至少200個氨基酸。
本發(fā)明特別重要的實施方案是具有SEQ ID NO2中氨基酸序列-7-224(前-SCCE)的多肽和具有SEQ ID NO2中氨基酸序列1-224(SCCE)的多肽。
術(shù)語“酶活性的亞序列”指含有部分SEQ ID NO2所示之多肽序列并且具有酶活性的多肽序列。還包括由本文所解釋的修飾而類似化的多肽亞序列。認為具有酶活性位點的一種或多種特異性多肽是特別有用的。
以預(yù)測的氨基酸序列SEQ ID NO2與人胰凝乳蛋白酶(Toultaet al.，1989)，人組織蛋白酶G(Salvesen et al.，1987)和人肥大細胞胃促胰酶(Caughey et al.，1991)的氨基酸序列進行了比較。盡管推測的氨基酸序列含有絲氨酸蛋白酶的保守活性區(qū)，但同源性程度很低約33-38％。由此可見，SCCE與以前已知的絲氨酸蛋白酶相比只有中度的相似性。另一方面，從活性位點的His，Asp，Ser殘基和靠近這些位點的保守區(qū)看，SCCE是一種典型的絲氨酸蛋白酶。這對于絲氨酸蛋白酶的大多數(shù)Cys殘基和其它高度保守區(qū)來說也是成立的。在一級特異性囊(在胰凝乳蛋白酶的殘基189)的底部，在人胰凝乳蛋白酶，肥大細胞胃促胰酶中有一個絲氨酸殘基，在人組織蛋白酶G中有一個前列腺特異性抗原和一個Ala殘基。另一方面，在SCCE中，該位置是由一個Asn殘基占據(jù)。這可以解釋盡管SCCE毫無疑問具有胰凝乳蛋白酶活性，但其對各種產(chǎn)色肽底物的相對活性卻不同于胰凝乳蛋白酶和組織蛋白酶G，象抑糜朊酶素(一種低分子量的胰凝乳蛋白酶樣酶的抑制劑)的抑制效率。
在下列的序列排列中列出了人胰凝乳蛋白酶、人組織蛋白酶G和人肥大細胞胃促胰酶序列和SCCE序列之間的比較。SCCE IIDGAPCARGSHPWQVALLSGNQLHH...CGGVLVNERWVLTAAHCKMNHUMCTRP IVNGEDAVPGSWPWQVSLQDKTGFHF...CGGSLISEDWVVTAAHCGVRHUMCHTG IIGGRESRPHSRPYMAYLQIQSPAGQS.RCGGFLVREDFVLTAAHCWGSHUMCHYM IIGGTECKPHSRPYMAYLEIVTSNGPSKFCGGFLIRRNFVLTAAHCAGR* *20 50SCCE EYTV..HLGSDTLGDRRA..QRIKASKSFR.HPGYSTQTHVNDLMLVKLNHUMCTRP TSDVVVAGEFDQGSDEENI.QVLKIAKVFK.NPKFSILTVNNDITLLKLAHUMCHTG NINV..TLGAHNIQRRENT.QQHITARRAIRHPQYNQRTIQNDIMLLQLSHUMCHYM SITV..TLGAHNITEEEDTWQKLEVIKQF.RHPKYNTSTLHHDIMLLKLK*80SCCE SQARLSSMVKKVRLPSRC..E..PPGTTCTVSGWGTTTSPDVTFPSDLMCHUMCTRP TPARFSQTVSAVCLPSADDDF..PAGTLCATTGWGKTKYNANKTPDKLQQHUMCHTG RRVRRNRNVNPVALPRAQ..EGLRPGTLCTVAGWGRVSMRRGTDTLREVQHUMCHYM EKASLTLAVGT..LPFPSQFNFVPPGRMCRVAGWGRTGVLKPGSDTLQEV* *110140SCCE VDVKLISPQDCTEVYKDLLENSMLCAGIPDSKKNA.CNGDSGGPLVCRGTHUMCTRP AALPLLSNAECKKSWGRRITDVMICAGA...GVSS.CMGDSGGPLVCQKDHUMCHTG LRVQRDRQ..CLRIFGSYDPRRQICVGDRRERKAAFK.GDSGGPLLCNNVHUMCHYM KLRLMDPQA.CSHFRDFDHNL.QLCVGNPRKIKSAFK.GDSGGPLLCAGV**170 ↑ 200SCCE LQ....GLVSWGTFPCGQ.PNDPGVYTQVCKFTKWINDTMKKHRHUMCTRP GAWTLVGIVSWGSDTCST.SS.PGVYARVTKLIPWVQKILAANHUMCHTG AH....GIVSYGKSSGVP....PEVFTRVSSFLPWIRTTMRSFKLDQMETPLHUMCHYM AQ....GIVSYGRSDAKP....PAVFTRISHYRPWINQILQAN*230用人工進行排列HUMCTRP ＝人胰凝乳蛋白酶(Touita et al.，BBRC158569-575，1989)HUMCHTG＝人組織蛋白酶G(Salvesen et al.，Biochemistry262289-2293，1987)HUMCHYM＝人肥大細胞胃促胰酶(Caughey et al.，J.Biol.
Chem.26612956-12963，1991)HomologiesHUMCTRP/SCCE85/224＝38％HUMCHTG/SCCE74/224＝33％HUMCHYM/SCCE74/224＝33％HUMCHTG/HUMCHYM109/226＝48％計數(shù)指胰凝乳蛋白酶原劃下線部分靠近活性位點(胰凝乳蛋白酶中的Ile 15，His 57，Asp 102，Ser 195)和胰凝乳蛋白酶一級特異性囊(胰凝乳蛋白酶中的Ser 189，Ser 213-Trp 215，Gly 226)的保守區(qū)。
星號SCCE中可能的N-糖基化位點本發(fā)明的一個重要的實施方案涉及含有氨基酸序列的多肽，在所述氨基酸序列中其連續(xù)排列的20個氨基酸與選自SEQ ID NO2所示氨基酸序列之相同長度的一串氨基酸有至少80％的同源性。與SEQ ID NO2所示的多肽有至少80％，如至少85％(如90％)同源性的本發(fā)明的多肽序列構(gòu)成了重要的實施方案。由于SEQ ID NO2所示的序列似乎非常獨特，因此，本發(fā)明范圍包括與選自SEQ IDNO2所示氨基酸序列的相似連續(xù)排列的20個氨基酸的同源性程度可不超過55％的同源性的多肽，盡管優(yōu)選的不超過70％，所述序列可以得自其它種，例如其它哺乳動物，如小鼠，大鼠，兔，豚鼠，豬或牛的相似蛋白質(zhì)。由于小部分的序列可以與其它絲氨酸蛋白酶有相當?shù)南嗨菩裕虼?，本發(fā)明的范圍還包括與相似連續(xù)排列的20個氨基酸有至少95％，且最佳為至少99％同源性的肽，所述的20個氨基酸選自SEQ ID NO2所示之氨基酸序列。
術(shù)語“序列同源性”指就多肽中氨基酸的一致性和位置而言，在相比較的兩個或多個氨基酸長的片段中，氨基酸序列的一致性。
因此本文所用術(shù)語“同源性”說明了所給多肽的氨基酸序列和SEQ ID NO2所示之氨基酸序列之間的一致性程度。由如，按下文所定義的雜交而得到的核苷酸序列如DNA或RNA序列可以推斷得到與SEQ ID NO2所示之核苷酸序列相比較的氨基酸序列，或者用常規(guī)的氨基酸測序方法也可以得到所述序列。優(yōu)選的是以成熟多肽的氨基酸序列為基礎(chǔ)，即不考慮前導(dǎo)序列，來確定同源性的程度。通常，在比較核苷酸序列時只用編碼區(qū)以便確定其內(nèi)部同源性。
在本發(fā)明說明書中，術(shù)語“由至少一種保藏的抗體識別的多肽”包括一種氨基酸序列，就SEQ ID NO2所示多肽之任何亞序列的線性或空間構(gòu)型而言，它含有基本上連續(xù)排列的氨基酸，所述SEQ IDNO2由至少一種保藏的抗體識別。正如本領(lǐng)域熟知的，二級或三級構(gòu)型也可以具有所需和有用的特性并可以構(gòu)成表位。保藏的抗體TE4b和TE9b似乎識別SCCE的構(gòu)型表位。
已經(jīng)表明按實施例5.2.2中所述制備的多克隆兔抗體在免疫熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，在顆粒層產(chǎn)生顆粒染色和在較低的角質(zhì)層產(chǎn)生相當分散的染色。
抗純化的天然或重組SCCE的抗體通常與角質(zhì)化的人鱗狀上皮中的前基底細胞而不是非角質(zhì)化的鱗狀上皮中的上皮細胞結(jié)合。這些抗體還與人皮膚角質(zhì)層的細胞間空間結(jié)合。
與本發(fā)明多肽反應(yīng)的抗體適用于下文所列的各種目的用于純化蛋白質(zhì)用親和層析或免疫沉淀技術(shù)從生物樣品中可以純化多肽或其類似物。
用于診斷和治療在動物和人的疾病的診斷和治療中可以使用抗多肽或其類似物的單克隆抗體。診斷試劑可以是具有本發(fā)明多肽特異性的抗體?？梢詫⒖贵w與另一種蛋白質(zhì)或固體支持物結(jié)合和/或?qū)⑵溆糜谀囼灮蝻@色試驗。用標準的組織化學(xué)或免疫化學(xué)技術(shù)，用所述的抗體可以確定生物樣品中SCCE多肽或其類似物的數(shù)量。
一方面，本發(fā)明涉及編碼上述本發(fā)明多肽的核苷酸序列。具體的是，本發(fā)明涉及基本上含有SEQ ID NO1所示之序列的核苷酸序列。重要的實施方案涉及編碼含有氨基酸序列SEQ ID NO2之多肽的核苷酸序列，如，編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列-7-224之多肽或含有SEQ ID NO2的氨基酸序列1-224之多肽的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及在實施例7和實施例9所述的高度嚴格條件下與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
另一方面，本發(fā)明涉及含有SEQ ID NO1所示之核苷酸序列或其類似物或其亞序列的核苷酸序列，所述的核苷酸序列
(1)與SEQ ID NO1所示的序列有至少90％的同源性，和/或(2)編碼一種多肽，其氨基酸序列與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列有至少80％的同源性，和/或(3)編碼由在1993年6月18日保藏于ECACC保藏號為ECACC93061817的雜交瘤細胞系TE4b生產(chǎn)的單克隆抗體和在1993年6月18日保藏于ECACC保藏號為ECACC 93061816的雜交瘤細胞系TE9b生產(chǎn)的單克隆抗體結(jié)合的多肽，和/或(4)編碼由抗天然SCCE的多克隆抗血清結(jié)合的多肽，所述天然SCCE已從分離的足底角質(zhì)層的提取物中被純化。
在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括不同于上述核苷酸序列的經(jīng)修飾的核苷酸序列，即其中至少一個核苷酸被缺失，取代或修飾或者至少一個附加的核苷酸被插入以便得到編碼具有SCCE活性之多肽的核苷酸序列。
在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語“亞序列”指優(yōu)選的大小為至少15個核苷酸，更優(yōu)選的為至少18個核苷酸，最佳為至少21個核苷酸的序列。在本發(fā)明的大量實施方案中，本發(fā)明核苷酸序列的亞序列或類似物含有至少48個核苷酸，如，至少75個氨基酸或至少99個核苷酸。所述“亞序列”應(yīng)符合上述標準1)-4)中的至少一個或者應(yīng)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列雜交。
正如本文所述的，已經(jīng)熟知小片段在PCR技術(shù)中也是有用的。按實施例7所述，在鑒定本發(fā)明核苷酸序列的mRNA片段時，可以用所述片段和亞序列連同其它功用一起作為探針。
就本發(fā)明的DNA片段來說，術(shù)語“類似物”用于說明編碼等同于或基本等同于本發(fā)明DNA片段所編碼的多肽之多肽的核苷酸序列。已經(jīng)熟知，相同的氨基酸可以由不同的密碼子編碼，此外，密碼子的使用還與將要表達核苷酸序列的生物的偏好有關(guān)。因此，在表達時，本發(fā)明DNA片段的一個或多個核苷酸或密碼子可以由其它核苷酸或密碼子替換，表達時會得到與由所述DNA片段編碼的多肽相同或基本相同的多肽。
另外，本文用術(shù)語“類似物”說明特征性的DNA序列SEQ ID NO1有相似的核苷酸組成或序列的DNA片段或DNA序列，SEQ ID NO1編碼構(gòu)成SCCE多肽的氨基酸序列，從而如實施例3所述允許與天然SCCE蛋白質(zhì)的活性相比，對類似物的酶活性沒有顯著不利影響的微小改變。術(shù)語“顯著不利影響”指例如，在按實施例3所述測定時，類似物的酶活性應(yīng)至少是天然SCCE活性的50％，優(yōu)選的至少是60％，最佳至少是70％如至少75％。類似的DNA片段或DNA序列可以得自生物例如動物或人，或者部分或全部來自合成。也可以通過重組DNA技術(shù)得到類似物。
此外，術(shù)語“類似物”和“亞序列”用于說明序列中的改變例如，一個或多個核苷酸的取代，插入(包括內(nèi)含子)，增加和重排，所述改變對DNA片段或其亞序列編碼的多肽沒有任何實質(zhì)性的不利影響。
術(shù)語“取代”指用一個或多個不同的核苷酸代替全長核苷酸序列中的一個或多個核苷酸，“增加”指在全長核苷酸序列的任一末端加入一個或多個核苷酸，“插入”指在全長核苷酸序列中摻入一個或多個核苷酸，“缺失”指在序列的任一末端或其內(nèi)的任何適宜的位點，從全長核苷酸序列中缺失一個或多個核苷酸，“重排”指在DNA或多肽序列內(nèi)分別交換兩個或多個核苷酸殘基，但在將DNA片段插入生物之前或之后也可以經(jīng)誘變對其進行修飾。
就本發(fā)明的片段，序列，亞序列和類似物來說，當然應(yīng)當將本發(fā)明說明書和權(quán)利要求中所用的術(shù)語“片段”、“序列”、“亞序列”和“類似物”理解為在其天然環(huán)境中不含有這些現(xiàn)象，但以分離的、純化的、體外或重組形式存在。
在本發(fā)明的實施方案中，通過從細胞或組織中提取RNA并將其轉(zhuǎn)變成cDNA隨后用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)而完成SCCE多肽mRNA的檢測和/或定量。以本發(fā)明的DNA片段例如SEQ ID NO1所示的DNA片段為基礎(chǔ)可以合成PCR引物。可以將檢測和/或定量的方法用作診斷疾病的診斷方法，在所述的疾病中，SCCE以比正常高或低的量被表達。
在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括含有能檢測本發(fā)明之核苷酸序列的核苷酸探針的診斷試劑和診斷其中SCCE表達失調(diào)的疾病和/或SCCE基因發(fā)生突變的疾病之方法，包括使來自懷疑有病的患者(其中SCCE的量比正常值高或有突變形式的SCCE)的樣品經(jīng)PCR分析，其中，使樣品與上述診斷試劑接觸，以擴增任何核苷酸序列并檢測樣品中是否存在任何相同的或同源核苷酸序列。
用重組DNA技術(shù)可以生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的重要實施方案涉及含有本發(fā)明核苷酸序列的表達系統(tǒng)。
用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽的生物可以是高等生物，例如動物，或者低等生物，例如E.coli.這樣的微生物。不考慮所用的生物類型，將本發(fā)明的DNA片段直接或利用適當?shù)妮d體導(dǎo)入生物中。另外，通過直接或利用表達載體，導(dǎo)入本發(fā)明的DNA片段或其類似物或亞序列，從而可以在哺乳動物細胞系中生產(chǎn)多肽。
在適當?shù)姆€(wěn)定表達載體中克隆DNA片段或其類似物或亞序列，然后放到適當?shù)募毎抵?。在適于所用載體和細胞系的條件下，以生產(chǎn)率的水平為基礎(chǔ)篩選生產(chǎn)所需多肽的細胞。進一步培養(yǎng)所篩選的細胞并形成所需多肽的重要和連續(xù)的來源。
本發(fā)明DNA序列具體類似物的實例是含有SEQ ID NO1所示之DNA序列或其一部分并特別適于在E.coli.中表達的DNA序列。將所述DNA序列與適宜的調(diào)節(jié)序列插入E.coli.后，可以表達基本具有SEQ ID NO2所示之氨基酸序列或其一部分的多肽。因此，該DNA序列含有由E.coli.識別的特異性密碼子。在實施例8中描述了該上述方案的一個實例。
在本發(fā)明說明書中，用術(shù)語“基因”說明與生產(chǎn)多肽鏈有關(guān)的DNA序列并包括編碼區(qū)前和后區(qū)(5’上游和3’下游序列)以及置于單個編碼片段、外顯子之間、5’上游或3’下游區(qū)內(nèi)的插入序列內(nèi)含子。5’上游區(qū)含有控制基團表達的調(diào)節(jié)序列，特別是啟動子。3’下游區(qū)含有與終止基團轉(zhuǎn)錄有關(guān)的序列和可選擇性地包括與轉(zhuǎn)錄物的多腺甘酸化和3’非翻譯區(qū)有關(guān)的序列。
與上述一致，本發(fā)明涉及含有編碼本發(fā)明之多肽的上述核苷酸序列的表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有能夠調(diào)節(jié)所述核苷酸序列之表達的5’側(cè)翼序列。
具體地說，本發(fā)明涉及攜帶并能調(diào)節(jié)本發(fā)明核苷酸序列之表達的可復(fù)制性表達載體。本發(fā)明的具體實施方案涉及稱為pS507(根據(jù)布達佩斯條約，以保藏號DSM8282于1993年5月11日保藏于thecollection of Deutsche Sammlurg Von Milroorganismen undZellkulturen GmbH(DSM)的可復(fù)制性表達載體和表達不同于所述保藏表達載體的核苷酸序列的表達載體，但其編碼具有SCCE活性的相同多肽或其類似物或變異體。
換句話說，本發(fā)明的范圍還包括上述的可復(fù)制性表達載體，其中，被表達的核苷酸序列與被保藏載體的核苷酸序列的不同在于缺失，取代，或修飾了至少一個核苷酸或已插入了至少一個額外的核苷酸以產(chǎn)生編碼具有SCCE活性的多肽之核苷酸。
此外，本發(fā)明涉及稱為pS500的質(zhì)粒(根據(jù)布達佩斯條約，該質(zhì)粒以保藏號DSM 8281于1993年5月11日保藏于the collectionof Deutsche Sammlung von Milroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSM))和含有一段核苷酸序列的質(zhì)粒，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，但其編碼SEQ ID NO2所示的多肽或其具有SCCE活性的類似物或變異體或在嚴格雜交條件下與SEQID NO1所示的核苷酸序列或其部分雜交。
在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括攜帶本發(fā)明表達系統(tǒng)的非人生物體。在本發(fā)明的該方面可以用的生物體包括微生物例如，桿菌屬，埃希氏桿菌屬，沙門氏菌屬的細菌，如啤酒酵母屬，畢赤氏酵母屬的酵母，原生動物或得自多細胞生物如真菌的細胞，昆蟲細胞，植物細胞，哺乳動物細胞或細胞系。如果所述生物體是細菌，則優(yōu)選的是埃希氏桿菌屬細菌，如，E.coli.。
本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明之多肽或本文所定義的融合蛋白的DNA序列的質(zhì)粒載體。在一個重要的實施方案中，可以由能在宿主生物體或細胞系中復(fù)制的可復(fù)制性表達載體攜帶本發(fā)明的DNA片段或其類似物或其亞序列或本文所定義的本發(fā)明融合DNA片段。
本發(fā)明的載體具體的可以是質(zhì)粒，噬菌體，粘粒，小染色體或病毒。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，在導(dǎo)入宿主細胞時，載體可以是整合到宿主細胞基因組中的載體。
如果使用高等生物，可以用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)多肽。適宜動物的實例是羊，牛，豬，等。在所需的組織中于組織特異性調(diào)節(jié)元件的控制下，表達編碼本發(fā)明多肽的DNA片段。然后，使所得的蛋白質(zhì)經(jīng)轉(zhuǎn)譯后修飾以得到本發(fā)明的多肽。
通過將“轉(zhuǎn)基因”導(dǎo)入所選動物的胚胎靶細胞而生產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基團非人哺乳動物。在本發(fā)明的一方面，轉(zhuǎn)基團是DNA序列，當該DNA序列被包含在轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物細胞的基因組中時，能夠生產(chǎn)所需的表型。在具體的實施方案中，轉(zhuǎn)基因含有編碼本發(fā)明多肽的DNA序列，轉(zhuǎn)基因能夠被表達以便生產(chǎn)所需的多肽。
用任何適宜的技術(shù)，例如按Hogan et al.，1986或WO93/04172中所述，均可以將表達系統(tǒng)摻入哺乳動物的種系。
在本發(fā)明的一個具體的方面，本發(fā)明的核苷酸序列含有編碼多肽的另一核苷酸序列，所述多肽不同于或等同于本發(fā)明的多肽，所述的另一核苷酸序列在閱讀框架中與編碼SCCE多肽的SEQ ID NO1所示之序列或其類似物的核苷酸序列相融合，以生產(chǎn)構(gòu)成本發(fā)明另一目的的融合多肽，參見例如，實施例8。若使用重組DNA技術(shù)，可以將融合的DNA序列摻入適宜的載體或基因組中。另外，將核苷酸序列之一插入已含有另一核苷酸序列的載體或基因組中。通過插入兩個分別的核苷酸序列并使其表達也可以生產(chǎn)融合多肽。在確保表達融合序列的條件下，使宿主生物生長(可以是真核或原核源)。然后純化融合多肽并用適宜的方法從其融合同伴中將其分離出來。
因此，本發(fā)明的一方面涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括下列步驟(a)將本發(fā)明的核苷酸序列插入表達載體中，(b)用步驟(a)中生產(chǎn)的載體轉(zhuǎn)化適宜的宿主生物，(c)在表達多肽的適宜條件下，培養(yǎng)步驟(b)中生產(chǎn)的宿主生物，(d)收集所述的多肽，和(e)選擇性的使多肽可進行轉(zhuǎn)譯后修飾。
在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括上述方法，其中，通過一個或多個親和層析步驟和/或其它層析和電泳方法，分離所生產(chǎn)的多肽，所述的親和層析使用固定的天然或重組SCCE多肽或與所述多肽有反應(yīng)性的抗體。
通過熱處理，化學(xué)處理(甲醛，戊二醛等)或酶處理(肽酶，蛋白酶和蛋白質(zhì)修飾酶)可以使上述生產(chǎn)的多肽進行轉(zhuǎn)譯后修飾。與其天然生產(chǎn)環(huán)境相比，當在生物中生產(chǎn)時，可以以不同的方式加工所述的多肽。作為一個實例，當由高等生物例如，酵母或優(yōu)選的哺乳動物的細胞表達所述的多肽時，常常要進行糖基化。糖基化常常與氨基酸殘基Asn，Ser，Thr或羥賴氨酸有關(guān)。除去或改變因所用的宿主生物引起的加工特性不一定是有利的。
在生物或細胞系中表達本發(fā)明的多肽后，可以這樣使用所述多肽或首先從生物或細胞系中將其純化。如果作為分泌產(chǎn)物表達多肽，則可以直接純化。如果多肽被表達為聯(lián)合產(chǎn)物，則在純化前要求部分或完全破碎宿主。用于純化多肽的方法的實例是(i)用抗體免疫沉淀或親和層析，(ii)用適宜的配體親和層析，(iii)其它層析方法例如，凝膠層析，離子交換或高效液相色譜或上述方法的衍生方法，(iv)電泳方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳，變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳和等電聚焦，(v)任何其它特異性的溶解和/或純化技術(shù)。
本發(fā)明還涉及基本上純的SCCE多肽。在本文中術(shù)語“基本上純的”指所需的多肽基本上沒有其它組分，例如其它肽或碳水化合物，所述的其它組分是因多肽的生產(chǎn)和/或回收或以其它方式所述的多肽在一起。按實施例3中所述，用SDS凝膠電泳可以評估蛋白質(zhì)的純度。
根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法，用SBTI親和層析或在固定抗體例如，抗體TE4b上的親和層析，按實施例4所述可以純化所述多肽。當在藥物或化妝品組合物中使用所述多肽時，高純度的本發(fā)明多肽是有益的。還因其具有高純度，對于大多數(shù)目的來說，可以以比傳統(tǒng)低純度多肽低的數(shù)量使用基本上純化的多肽。
在本發(fā)明的一方面，從按實施例9所述表達本發(fā)明多肽的適宜細胞系中可以得到純化的多肽。通過利用熟知的連續(xù)結(jié)合多肽序列之單個氨基酸的液相或固相肽合成法，也可以合成本發(fā)明的多肽。另外，通過偶聯(lián)單個氨基酸形成多肽序列的片段，然后偶聯(lián)在一起以得到所需的多肽，也可以合成多肽。這些方法因此構(gòu)成了本發(fā)明的另一個方面。
本發(fā)明的一個重要方面涉及藥物組合物，化妝品組合物或皮膚護理組合物，它們含有具有SCCE活性的多肽和藥物學(xué)和/或美容可接受的賦形劑。所述組合物可以含有本發(fā)明的純化天然蛋白或重組多肽，或通過蛋白水解裂解可以活化的本發(fā)明之多肽的酶原或融合蛋白形式。可以將本發(fā)明多肽的酶原形式看成“前藥”，即，一旦經(jīng)適當?shù)牡鞍姿饬呀夂?，將轉(zhuǎn)化成活性形式的化合物。
具體地說，但不排除其它情況，本發(fā)明涉及適宜于局部應(yīng)用例如，應(yīng)用于皮膚的組合物。
本發(fā)明適宜于局部施用的藥物組合物可以是乳膏，油膏，洗劑，擦劑，凝膠，溶液，膏藥，帖劑，噴霧劑，香波，皂，頭發(fā)調(diào)理劑或粉末。局部施用可以是施用于靠近于呈現(xiàn)所述病理改變的身體部分，例如，施用到身體的外表部分如皮膚表面上。應(yīng)用可以是簡單的涂抹所述的組合物，或可以用適于加強所述組合物與病理損傷之間的接觸的裝置，例如，使用封閉的敷裹，如配有本發(fā)明組合物的封閉石膏?？梢詫⑺鼋M合物浸透或分散到墊，石膏帶，紗布，海綿材料，棉毛片等?？蛇x擇地使用將本發(fā)明的組合物注射入或注射到損傷附近的形式。
本發(fā)明的局部組合物可以含有1-80％w/w的活性化合物(以制品的全部重量計)，例如，0.001-25％w/w的活性化合物，如，0.1-10％，0.5-5％或2-5％?？梢詫⒁环N以上的活性化合物摻入所述的組合物中，即含有SCCE，SCCE原或SCCE抑制劑與其它藥物學(xué)和/或化妝品化合物的組合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)損傷的類型，嚴重程度和位置，所述組合物可以方便地一天用1-10次。
為了局部的應(yīng)用，根據(jù)常規(guī)的藥物學(xué)實踐，可以用常用于局部應(yīng)用的藥物學(xué)賦形劑配制所述制品。制備任何具體組合物所用的載體的性質(zhì)取決于施用所述組合物時的方法。除水外，在組合物中可以使用的載體包括露體或液體，例如，軟化劑，溶劑，濕潤劑，增稠劑或粉末。這些載體的實例(可以單獨或作為一種或多種載體的混合物使用)如下軟化劑，如，十八烷醇，單蓖麻醇酸甘油酯，單硬脂酸甘油酯，1，2-丙二醇，1，3-丁二醇，鯨蠟醇，異硬脂酸異丙酯，硬脂酸，棕櫚酸異丁酯，硬脂酸異鯨蠟酯，油醇，月桂酸異丙酯，月桂酸己酯，油酸癸酯，2-十八醇，異鯨蠟醇，棕櫚酸鯨蠟酯，二甲基聚硅氧烷，癸二酸二正丁酯，肉豆蔻酸異丙酯，棕櫚酸異丙酯，硬脂酸異丙酯，硬脂酸丁酯，聚乙二醇，三甘醇，羊毛脂，蓖麻油，乙?；难蛎?，石油，礦物油，肉豆蔻酸丁酯，異硬脂酸，棕櫚酸，亞油酸異丙酯，乳酸月桂酯，乳酸肉豆蔻酯，油酸癸酯，肉豆蔻酸肉豆蔻酯；溶劑，例如，水，二氯甲烷，異丙醇，蓖麻油，乙二醇單乙基醚，二甘醇單丁基醚，二甘醇單乙基醚，二甲亞砜，四氫呋喃，植物油和動物油，甘油，乙醇，丙醇，丙二醇，和其它甘油或醇，固定油；濕潤劑或潤濕劑例如，甘油，山梨醇，2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉，可溶性膠原，鄰苯二甲酸二丁酯，明膠；粉末，如，白堊，滑石，高嶺土，淀粉和其衍生物，膠，膠體狀的二氧化硅，聚丙烯酸鈉，化學(xué)改變的硅酸鎂鋁，水合硅酸鋁，羧乙烯基聚合物，羧甲基纖維素鈉，單硬脂酸乙二醇酯；膠凝劑或溶脹劑，如，果膠，明膠和其衍生物，纖維素衍生物如，甲基纖維素，羧甲基纖維素或氧化的纖維素，纖維素膠，耳膠，阿拉伯膠，刺梧桐樹膠，黃蓍膠，膨潤土，瓊脂，藻酸鹽，carbomer，明膠，墨角藻，峨眉藻，葡聚糖和其衍生物，茄替膠，水輝石，卵葉車前子殼，黃原膠；聚合物，例如，聚乳酸或聚乙醇酸聚合物或其共聚物，石蠟，聚乙二烯，聚環(huán)氧乙烷，聚乙二醇，聚丙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，表面活性劑，例如，非離子表面活性劑，如，1，2-亞乙基二醇和甘油酯，macrogol酯和醚，糖醚和酯，例如，脫水山梨醇酯，離子表面活性劑，例如，胺皂，金屬皂，硫酸化的脂肪醇，烷基醚硫酸鹽，硫酸化的油和兩性的表面活性劑和lecithins；緩沖劑例如，鈉，鉀，鋁，鎂或鈣鹽(例如氯化物，碳酸鹽，碳酸氫鹽，檸檬酸鹽，葡糖酸鹽，乳酸鹽，葡庚糖酸鹽，或酒石酸鹽)。
為了局部應(yīng)用，組合物的pH原則上可以有很寬的范圍例如，3-9。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，適宜多肽水解活性的pH優(yōu)選的是4-8。也可以使用上述的常規(guī)緩沖劑以得到所需的pH。
本發(fā)明的制劑還可以含有其它附加成分，例如，穩(wěn)定劑，防腐劑，增溶劑，增色劑，螯合劑，凝膠成型劑，軟膏基，pH調(diào)節(jié)劑，抗氧化劑，香料和皮膚保護劑等。如果組合物是香波或皂的形式，則組合物還可以含有起泡劑，珠光劑和/或調(diào)理劑。
典型的防腐劑包括對羥基苯甲酸酯，甲醛，Kathon CG，Bronidox，Bronopol，對-氯-間-甲酚，chlorhexidine，殺藻銨等。
在本發(fā)明的組合物為香波或皂的形式時，可以使用常規(guī)組分，而且典型的皂和香波基包括甜菜堿，月桂基硫酸鈉，壬基醇，咪唑，硫代琥珀酸鹽，refattening agents，濕潤劑和調(diào)理劑。
此外，還可以提供改進的釋放制劑，其中，將活性化合物摻入聚合物基質(zhì)或纖顆?；蛑|(zhì)體，或微團中或吸附在離子交換樹脂上，或由聚合物攜帶。
按常規(guī)的藥物學(xué)實踐可以配制組合物并可以是半固體配方凝膠，糊，混合物。
液體配方溶液，懸浮液，浸潤液，乳液。
正如所述的，本發(fā)明的藥物組合物可以含有本發(fā)明本身的多肽或其功能衍生物，或所述化合物的組合。適宜的功能衍生物的實例包括藥物學(xué)可接受的鹽，特別是適于皮膚環(huán)境中的那些。實例包括藥物學(xué)可接受的氨基功能的鹽，例如，特別是在皮膚環(huán)境中，具有產(chǎn)生藥物學(xué)可接受之陰離子的酸的鹽。實例包括磷酸鹽，硫酸鹽，硝酸鹽，碘化物，溴化物，氯化物，硼酸鹽以及得自包括乙酸鹽，苯甲酸鹽，硬脂酸鹽等的羧酸的陰離子。
氨基功能的其它衍生物包括酰胺，酰亞胺，脲，氨基甲酸酯(或鹽)，等。
其它適宜的衍生物包括本發(fā)明多肽之羧基的衍生物，包括鹽，酯和酰胺。實例包括具有藥物學(xué)可接受的陽離子，例如鋰，鈉，鉀，鎂，鈣，鋅，鋁，鐵，亞鐵，銨和低(C1-6)烷基銨鹽。酯包括低烷基酯。
實施例11中組合物的實例說明本發(fā)明的藥用化妝品和皮膚護理配方，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
已考慮到含有天然或重組SCCE的化妝品組合物或皮膚護理組合物對痤瘡、干皮病或其它角化過度現(xiàn)象例如，胼胝和毛發(fā)角化病是有活性的。在尋常性痤瘡中有不同的階段?？紤]到在皮脂腺的導(dǎo)管中有角質(zhì)化障礙的階段施用SCCE是有益的，所述的角質(zhì)化障礙會導(dǎo)致形成粉刺和堵塞，而它可能有利于在以炎性痤瘡損傷為明顯特征的階段施用抑制SCCE的物質(zhì)。
因此，本發(fā)明的一方面涉及多肽治療或預(yù)防痤瘡，干皮病或其它角化過度疾病例如，胼胝和毛發(fā)角化病的用途。
以上述的科學(xué)研究為基礎(chǔ)，認為特別是局部施用時，含有天然或重組SCCE的藥物組合物可用于治療或預(yù)防帶有角化過度，微生物感染的各種鱗癬，痤瘡，牛皮癬，或其它炎性皮膚病如，濕疹，并使傷口愈合。
本發(fā)明的另一方面涉及具有SCCE活性的多肽用于制備藥物組合物，所述的藥物組合物用于治療或預(yù)防各種鱗癬，痤瘡，牛皮癬，或其它具有角化過度的炎性皮膚病，例如濕疹。
本發(fā)明的另一方面涉及治療和/或預(yù)防各種鱗癬、痤瘡、牛皮癬或具有角化過度的其它炎性皮膚病，例如，濕疹的方法，該方法包括給患者按需要施用治療或預(yù)防有效量的具有SCCE活性的多肽。治療可以是預(yù)防性的，緩解性的或治愈性的。
認為蛋白水解酶的“級聯(lián)系統(tǒng)”存在于皮膚環(huán)境中，與纖溶酶原活化系統(tǒng)相似。假設(shè)SCCE是該系統(tǒng)的終級產(chǎn)物之一。認為SCCE的活性可以由“SCCE抑制劑”抑制。
在大量的皮膚病中，例如自身免疫性天皰瘡病或皮膚棘層松解病，如家族性天皰瘡和毛囊角化病中，在非角質(zhì)化的活表皮層內(nèi)的角質(zhì)細胞間的粘連受損(參見活表皮中的細胞粘連紊亂)。認為該過程是蛋白酶介導(dǎo)的，因此，通過施用能夠抑制SCCE酶活性的化合物可以使其得到治療。也可以施用SCCE抑制劑以治療炎性組分為明顯特征的牛皮癬和其它炎性皮膚病。
因此，本發(fā)明另一方面涉及SCCE抑制劑在制備藥物組合物中的用途，所述SCCE抑制劑對天然SCCE的酶活性有抑制作用，所述藥物組合物用于治療和預(yù)防自身免疫性天皰瘡病或皮膚棘層松解病，例如，家族性天皰瘡和囊角化病。
在本文中，術(shù)語“SCCE抑制劑”指能夠與本發(fā)明的酶活性多肽序列或亞序列或其類似物相互作用，以降低SCCE活性的現(xiàn)存或新化合物，例如通過實施例3.2中描述的使用潛在的SCCE抑制劑為抑制劑的試驗，可以測量活性降低的程度。所述的化合物可以是有機分子，小肽或大多肽或上述各種的衍生物。在鑒定SCCE抑制劑的藥物篩選程序中，可發(fā)現(xiàn)所述方法的用途。
因此，本發(fā)明的另一實施方案涉及對天然SCCE的酶活性有作用的化合物的鑒別方法，包括利用本發(fā)明重組多肽。
具體地說，本發(fā)明涉及鑒別化合物的方法，所述化合物對天然SCCE的酶活性有抑制作用。
另一方面，本發(fā)明涉及鑒別化合物的方法，所述化合物能夠增強天然或重組SCCE的酶活性。
本發(fā)明之重組多肽的重要用途是用于藥物篩選檢測中。本發(fā)明的多肽可用于藥物篩選系統(tǒng)。因此本發(fā)明涉及包括利用本發(fā)明的多肽鑒別能夠?qū)CCE的酶原形式轉(zhuǎn)化成活性SCCE之化合物的方法。
本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括使用以上之定義的氨基酸序列推導(dǎo)的SCCE多肽的三維空間結(jié)構(gòu)來設(shè)計能夠與SCCE多肽結(jié)合的物質(zhì)，特別是用于設(shè)計與酶之活性位點結(jié)合的藥物。
最后，本發(fā)明的重要方面是各種調(diào)節(jié)SCCE多肽之活性的方法。該活性與上述的各種疾病有重要的聯(lián)系。
與對應(yīng)于本發(fā)明多肽或其類似物的至少部分mRNA互補的DNA或RNA在人細胞中可以有效的抑制SCCE mRNA的翻譯并由此抑制多肽的合成。在發(fā)現(xiàn)有高于正常SCCE表達的所研究的疾病中，例如，自身免疫性天皰瘡或皮膚棘層松解病如家族性天皰瘡和毛囊角化病中，這種方法是熟知的反義寡核苷酸治療方法，因此本發(fā)明包括所述的方法。


圖1表示離體的從足底角質(zhì)層脫落的單極細胞。在體時朝外的組織表面在圖中朝上。注意到在溫育過程中該表面存在漸進性細胞分離，但在其它表面無此現(xiàn)象。
圖2表示時間過程和有(▲)和無(●)抑肽酶一起溫育時抑肽酶對足底角質(zhì)層細胞釋放的影響。圖中給出了均數(shù)(4個組織片的累加值)和范圍。
圖3表示粘連的足底角質(zhì)層和分離的細胞中的抗desmoglein(抗-DGI)反應(yīng)性成分。A.考馬斯蘭染的SDS-PAGE。B.免疫印跡。1-3粘連組織，未稀釋的(1)，1/3稀釋的(2)，1/9稀釋的(3)。4-5分離的細胞，未稀釋的(4)，1/3稀釋的(5)。注意到在粘連的組織中只有分子量為160KD的外觀完整的DGI，在分離的細胞中只有分子量為95KD和80KD的DGI降解產(chǎn)物。
圖4表示時間過程和抑肽酶對經(jīng)歷細胞脫落的離體足底角質(zhì)層中DGI之降解的影響。顯示了缺乏(A)和存在(B)抑肽酶(15μM)一起溫育的足底角質(zhì)層之提取物的免疫印跡的光密度計掃描圖。160KD的峰對應(yīng)于完整的DGI。95KD和80KD的峰相當于該蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物(參考圖3)。注意到抑肽酶對DGI降解的有效抑制作用。
圖5表示Zn2+(A)、抑糜朊酶素和亮肽素(B)對離體細胞脫落過程中的足底角質(zhì)層的DGI降解的影響。注意到Zn2+和抑糜朊酶素對抗-DGI陽性成分從160KD轉(zhuǎn)變成95KD和80KD的抑制作用，但亮肽素?zé)o此作用。
圖6表示與足底角質(zhì)層細胞有關(guān)的肽水解活性。通過檢測在405nm吸光度的變化來跟蹤兩種底物的水解。給出的是溫育混合物重復(fù)三次的均數(shù)?！霰硎維-2586；●表示S-2288。
圖7表示角質(zhì)細胞相關(guān)的S-2586水解活性之pH值依賴性。給出的是溫育混合物重復(fù)三次的均數(shù)?！霰硎疽宜徕c，●表示磷酸鈉，▲表示Tris-HCl。
圖8表示反映分離的足底角質(zhì)層細胞提取物中酪蛋白水解活性的酶圖。還可以參考下文實施例2.2的詳細實驗說明。
A對用無還原劑(sc/s)的Laemmli樣品緩沖液和含牛胰凝乳蛋白酶0.125ng(c)及牛胰蛋白酶0.5ng(t)的KCl(sc/k)抽提的足底角質(zhì)細胞中的酶進行比較。電泳前先將KCl提取物對5mMTris-HCl pH6.8透析，加入SDS和甘油得到如樣品緩沖液中一樣的終濃度，所有泳道加10μl。分子量標記加到左邊。
B溫育緩沖液中pH的依賴性。酶源為分離的足底角質(zhì)細胞的SDS提取物。含Triton X-100進行預(yù)處理和進行溫育的緩沖液包括0.1M乙酸鈉(pH4.0和pH5.5)和0.1M Tris-HCl(pH7.0和pH8.0)。其它條件同A。
C抑制劑的作用。sc為足底角質(zhì)細胞的SDS提取物；c為牛胰凝乳蛋白酶；t為牛胰蛋白酶。抑制劑存在于用Triton X-100進行預(yù)處理和后續(xù)的溫育過程中。各抑制劑的終濃度分別為亮肽素160μM、抑肽酶15μM、抑糜朊酶素40μM和Zn2+(如ZnSO4)100μM。亮肽素和抑糜朊酶素作為二甲亞砜(DMSO)的溶液加入。預(yù)處理和溫育的緩沖液為含終濃度1％(v/v)DMSO的0.1M Tris-HCl pH8。其它條件同A。
圖9對于SCCE、牛胰凝乳蛋白酶和人組織蛋白酶的抑制劑(A抑肽酶，B抑糜朊酶素，CZnSO4)的作用和底物特異性(D)進行比較。在A-C中，不存在抑制劑的酶活性標化為100％。在D中，有MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA的酶活性標化為1個任意單位(arbitrary Unit)。
圖10表示共價連接的大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)的親和層析。……280nm的吸光度，反映洗脫物的蛋白質(zhì)濃度。----以S-2586作底物的肽水解活性。以405nm吸光度的變化給出。-0-O-O-以S-2288作底物的肽水解活性，以405nm處吸光度的變化乘10倍給出。
圖11表示圖10所示層析的級分2、6和10的SDS-PAGE和考馬斯蘭染色(A)以及有共聚的酪蛋白的SDS-PAGE后的酶圖(B)。左邊為分子量標記。B中1，能被亮肽素(160μM)抑制的酪蛋白水解成分組。C，能被抑糜朊酶素(40μM)抑制的酪蛋白水解成分組。
圖12表示用在SBTI-Affigel15上親和層析純化的SCCE的SDS-PAGE，12.5％的凝膠。1未還原的樣品，2還原樣品。左邊為分子量標記。
圖13表示SCCE的N端氨基酸序列。*表示7位和9位上被推定的Cys的不確定性。？表示檢測不到氨基酸衍生物但其在后續(xù)步驟的產(chǎn)率中沒有降低的位置。
圖14表示借助免疫沉淀法和免疫印跡法描述的單克隆抗體TE4b和TE9b的特征。
a考馬斯蘭染色的12.5％SDS-PAGE，非還原條件。
泳道1分子量標記泳道2如實施例3.1所述制備的分離的足底角質(zhì)細胞之KCl提取物。
泳道3如實施例4.1所述通過對不溶的大豆胰蛋白酶抑制劑進行親和層析純化的SCCE。
b在具有0.1％共聚的熱變性酪蛋白之12.5％ SDS-PAGE中的免疫沉淀物的酶圖，用考馬斯蘭染色的凝膠。
泳道1分子量標記。
泳道2KCl提取物，如a所述透析。
泳道3-6(從左→右)具有moab TE4b(20μg)、moabTE9b(10μg)、moab PZ(10μg)和磷酸鹽緩沖的鹽水的溶解的免疫沉淀物。Moab PZ是抗妊娠區(qū)帶蛋白質(zhì)的IgG1-Kappa型單克隆抗體，用作不相關(guān)的陰性對照。
c來自12.5％ SDS-PAGE的免疫印跡(非還原條件)。
泳道1用堿性磷酸酶結(jié)合的親合素(BioRad)檢測的生物素化的分子量標記，在泳道2、4和6中電泳的樣品同a中的泳道2，在泳道3、5和7中電泳的樣品同a中的泳道3。
泳道2和3第一抗體為moab TE4b，0.2μg/ml。
泳道4和5第一抗體為moab TE9b，0.1μg/ml。
泳道6和7第一抗體為moab PZ，0.1μg/ml。
a-c中的箭頭表示相對分子量分別為(從上至下)93、66、45、31、22和14KD。
圖15表示質(zhì)粒pS500。該質(zhì)粒含有克隆到pUC19中的全長人SCCE cDNA。詳細說明可參見實施例6。
圖16表示從人表皮制備的mRNA的Northern印跡。每泳道使用相當于約100g總RNA經(jīng)Poly-T純化的RNA。1與從SCCE-cDNA的1070bp Hinc2/Hinc2片段制備的探針雜交。2與從SCCE-cDNA的655bp Hinc2/Bgl2片段制備的探針雜交。
圖17a.考馬斯蘭染色的SDS-PAGE，12.5％的凝膠。 1和2超聲處理TG2細胞的PBS-Triton X-100不溶性細胞沉淀物，該TG2細胞是分別經(jīng)pS510和pS511轉(zhuǎn)化并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的。3從人足底角質(zhì)層純化的SCCE。
b.用雞免疫前血清(1-3)和雞抗-SCCE(4-6)進行的免疫印跡。1和4用pS510轉(zhuǎn)化并用IPTG誘導(dǎo)的TG2細胞。2和5用pS511轉(zhuǎn)化并用IPTG誘導(dǎo)的TG2細胞。3和6從人足底角質(zhì)層純化的SCCE。
通過在含巰基乙醇的樣品緩沖液中煮沸來制備樣品。
圖18表示表達載體pS507的環(huán)形圖。該載體如實施例9所述構(gòu)建。它介導(dǎo)重組人SCCE在哺乳動物細胞中的表達。
圖19表示對pS507中的重組人SCCE基因在哺乳動物細胞中表達的分析。
泳道1得自C127細胞的RNA。
泳道2從用pS507轉(zhuǎn)染的C127細胞的分離克隆(1∶24)中得到的RNA。
泳道3從用pS507轉(zhuǎn)染的C127克隆的群體混合物中得到的RNA。
泳道4和5用表達載體pS147轉(zhuǎn)染的C127細胞的RNA，pS147除了映乏SCCE cDNA序列外與pS507相同。分子量標記在左側(cè)指示。
圖20表示在C127細胞中表達的SCCE在SDS-PAGE后進行免疫印跡。
泳道1和6預(yù)染的分子量標記(Bio-Rad，106，80，49.5，32.5，27.5和18.5KDa)。
泳道2pS507/C127，混合，T-燒瓶。
泳道3pS507/C127，混合，roller A。
泳道4pS507/C127，混合，roller B。
泳道5陰性對照pS522/C127。
泳道7由角質(zhì)層制備的天然SCCE。
泳道8pS507/C 127，克隆24，T-燒瓶。
泳道9pS507/C127，克隆24，roller A。
泳道10pS507/C127，克隆24，roller B。
圖21表示從含有攜帶質(zhì)粒pS507的細胞之C127細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基中純化的重組SCCE的SDS-PAGE(A)和免疫印跡(B)。
泳道1和5預(yù)染的分子量標記(Bio-Rad，106，80，49.5，32.5，27.5和18.5KDa)。
泳道2純化前的細胞培養(yǎng)基。
泳道3從層析法中收集的未結(jié)合物。
泳道4用低pH緩沖液洗脫的結(jié)合物。
圖22表示在酪蛋白聚丙烯酰胺凝膠上測定天然SCCE和活化的活性重組SCCE的活性。
泳道1和10分子量標記(Pharmacia 14-94KDa)。
泳道2天然SCCE。
泳道3天然SCCE。
泳道4-6分別裂解1小時、3小時及過夜的重組SCCE(460ng/孔)。
泳道7與泳道4-6的樣品中相同量的胰蛋白酶，但不含APMSF。
泳道8與泳道4-6的樣品中相同量的胰蛋白酶，也含有所述樣品中相同量的APMSF。
泳道9同泳道3。
圖23表示用N-糖苷酶F處理的天然和重組SCCE的免疫印跡。如上所述，樣品在8-18％ SDS-PAGE中分離，然后進行免疫印跡分析。
泳道1分子量標記。自上而下分子量分別為106，80，49.5，32.5，27.5和18.5KDa。
泳道2和3重組SCCE，含量分別為0.3μg和3μg。
泳道4和5天然SCCE，含量分別為1.5μg和1.8μg。泳道3和5中的樣品都用N-糖苷酶F處理過。實施例1細胞從皮膚的角化表層的表面脫落之證據(jù)包括橋粒蛋白質(zhì)降解并且起此作用的酶(responsible enzyme)似為能被Zn2+抑制的胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。1.1.角質(zhì)層脫屑本研究的目的是闡明負責(zé)細胞粘連和皮膚角化層(角質(zhì)層)表層細胞分離(脫屑)的機理的性質(zhì)。從具有正常皮膚的志愿者足跟下與皮膚表面平行地切取一片0.3-0.6mm厚的角質(zhì)層。該組織片被置于含0.1％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖的鹽水中，于室溫下浸泡3小時，然后從在體時朝外的表面刮除疏松附著的細胞。再與組織表面垂直地切取1mm厚的切片，正好在培養(yǎng)基膠化之前(因為該培養(yǎng)基含瓊脂糖)將切片放入含0.1M tris-HCl pH8、含0.1％疊氮化鈉的5mM EDTA和0.45％瓊脂糖的培養(yǎng)基中。于37℃溫育0、5和15小時后，將含組織的凝膠片置于干冰上冷凍。在低溫控制器中與皮膚表面垂直地切取20μm的低溫控制器切片，將其固定于載片上，用相差顯微鏡檢查。觀察到體外溫育的足底角質(zhì)層片的連續(xù)單極細胞脫落(圖1)。細胞只從在體時朝外的組織表面脫落。因此所觀察到的過程模擬了脫屑。1.2.溫度、pH和酶抑制劑的作用于是開發(fā)了定量細胞脫落的方法，以使對各種參數(shù)如溫度、pH和酶抑制劑的作用進行研究。用活組織檢查鉆取器從得自如上文1.1所述并不含疏松附著的表層細胞的組織片制備直徑為3mm的足底角質(zhì)層圓柱體。所得的圓柱體(具有所限定大小的、在體時朝外的表面)在裝有0.5ml培養(yǎng)基的1.5ml Eppendorf微型離心管中于37℃溫育5、10和20小時，所說的培養(yǎng)基含有0.1M tris-HCl pH8，5mM EDTA、0.1％疊氮化鈉和含或不含抑肽酶(4×6-6mol/l)(Boehringer Mannhem，Germany)，然后在渦旋混合器中振蕩10秒鐘以釋放分離的表層細胞。移出剩余組織，置于新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)溫育。裝有釋放細胞的離心管以5000 g離心2分鐘以收集細胞。用0.5ml磷酸鹽緩沖液洗滌細胞沉淀物一次，然后再用0.6ml 1M NaOH于60℃處理1.5小時。堿性可溶性蛋白用Lowry等人的方法(1951)定量，并作為對被釋放細胞量的檢測。檢測結(jié)果如圖2所示。
以類似方式研究了各種可能性抑制劑(抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制劑、胃蛋白酶抑制素(Boehringer Mannheim，Germany))和碘乙酰胺(Sigma，St.Louis，MO)的作用。制備單個的2mm組織圓柱體，與含或不含如下表1所示濃度的各種可能性抑制劑的培養(yǎng)基一起在37℃溫育16小時，用如上所述方法對被釋放的細胞定量。應(yīng)注意到，作為金屬蛋白酶抑制劑的EDTA也包括在溫育培養(yǎng)基中，以產(chǎn)生最理想的細胞釋放率。
表1蛋白酶抑制劑對離體的足底角質(zhì)層細胞釋放的影響。5片溫育組織片的均值和SD。抑制劑濃度(mol/l) 抑制作用(％)無 -0±8抑肽酶(Trasylol) 1.5×10-718±8抑肽酶(Trasylol) 4×10-753±13抑肽酶(Trasylol) 1.5×10-690±5抑肽酶(Trasylol) 4×10-698±2大豆胰蛋白酶抑制劑5×10-881±9胃蛋白酶抑制素1×10-48±4碘乙酰胺 1×10-36±13
發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶抑制劑抑肽酶和大豆胰蛋白酶抑制劑能有效地抑制細胞脫落(圖2和表1)。因為這兩種物質(zhì)有抑制作用，但金屬蛋白酶抑制劑(EDTA)、硫醇蛋白酶(碘乙酰胺)和天冬氨酸蛋白酶(胃蛋白酶抑制素)卻沒有這種抑制作用，所以得出結(jié)論，絲氨酸蛋白酶參予了所觀察到的過程。由此還可以認為角質(zhì)層的細胞粘連依賴于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且類似于離體觀察到的機理一定也在在體脫屑過程中起作用(Kundstrm and Egelrud 1988)。
在對足底角質(zhì)層的離體細胞脫落過程的進一步研究中發(fā)現(xiàn)，該過程可分為兩個不同的步驟。第一步的發(fā)生無論溫育培養(yǎng)基中是否存在EDTA。第二步僅發(fā)生于有EDTA存在的情況下。第一步除受抑肽酶的抑制外，還可被抑糜朊酶素和Zn2+抑制。第二步能被抑肽酶和抑糜朊酶素的抑制(Kundstrm and Egelrud 1990a)。抑糜朊酶素是一種具有胰凝乳蛋白酶樣底物特異性的低分子量蛋白酶抑制劑。而且已發(fā)現(xiàn)(Kundstrm and Egelrud 1990a)具有胰蛋白酶樣底物特異性的低分子量蛋白酶抑制劑亮肽素對離體的細胞脫落沒有影響。
極可能負責(zé)角質(zhì)層的細胞粘連的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，和因此而成為在上述脫屑樣細胞脫落中退化的可能的考慮成分即為橋粒。橋粒由位于鄰接細胞上的兩個對稱部分組成。這兩半部分由稱為desmoglein的跨膜蛋白在胞外間隙相連。1.3.離體細胞脫落過程中desmoglein I(DG I)的命運研究了離體足底角質(zhì)層細胞脫落過程中DG I的命運。如上文1.1所述培養(yǎng)足底角質(zhì)層，將仍然粘連的組織與分離的細胞分開，在含有0.1M Tris-HCl pH9，9M尿素、 2％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1％巰基乙醇的緩沖液中于37℃抽提細胞和組織15小時(1ml緩沖液/20mg組織)。所制備的提取物根據(jù)Laemmli的方法(Laemmli，1970)在存在SDS的7.5％凝膠中進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，隨后電轉(zhuǎn)移(Towbin et al.，1979)至硝化纖維素膜(Bio-Rad，Richmond，.CA)，該膜用抗自牛鼻口部純化的DGI的兔多克隆抗血清探針標記(Gorbsky et al.，1985)。用堿性磷酸酶結(jié)合的羊抗兔免疫球蛋白(Bio-Rad，Richmond，CA)檢測被結(jié)合的抗體(Blake etal.，1984)。
實驗結(jié)果如圖3所示。將加至免疫印跡中的樣品量調(diào)節(jié)到對于粘連組織和分離的細胞產(chǎn)生大約相同的蛋白質(zhì)濃度(如通過肉眼觀測考馬斯蘭染色的SDS-PAGE凝膠來估計)。將提取物的幾種稀釋液進行電泳，以可能對粘連的角質(zhì)層和分離細胞中不同的抗DG I反應(yīng)性成分的量進行半定量性比較。
在分別提取粘連組織和分離細胞時發(fā)現(xiàn)，仍然粘連的組織只含有外觀完整的DG I，而分離的表面細胞只含有推測的該蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物(圖3)。
圖4和圖5顯示了在離體的足底角質(zhì)層細胞脫落過程中抑肽酶、Zn2+、抑糜朊酶素(Baehringer，Mannheim，Germany)和亮肽素(Baehringer，Mannheim Germany)對DGI降解的影響。
首先，研究了時間過程和抑肽酶對進行離體細胞脫落的足底角質(zhì)層中DG I降解的影響。如上文1.2中所述在缺乏或存在抑肽酶(15μM)的條件下培養(yǎng)足底角質(zhì)層的提取物(抽提前先不把粘連組織與分離細胞分開)并分別在0、6、12或24小時后進行提取。如上所述進行SDS-PAGE和免疫印跡。在Shimadzu CS-9000掃描點掃描儀(Shimadzu，kyoto，Japan)用560nm處的反射光以Z形方式進行免疫印跡物的光密度體掃描。結(jié)果如圖4所示。注意到抑肽酶對DG I降解的有效抑制作用。
然后，研究了Zn2+、抑糜朊酶素和亮肽素對離體細胞脫落過程中足底角質(zhì)層的DG I降解的影響。上文已概述了實驗設(shè)計。與濃度為0、1或5mM的ZnSO4及330μM的抑糜朊酶素或亮肽素一起培養(yǎng)24小時。其結(jié)果表明了Zn2+和抑糜朊酶素對抗DG I陽性成分從160KD轉(zhuǎn)變成95和80KD的抑制作用，而亮肽素則無此作用。
這些結(jié)果表明抑肽酶、Zn2+和抑糜朊酶素都有抑制作用，而亮肽素則無。因此，DG I降解的抑制圖譜與離體足底角質(zhì)層細胞脫落的相同(Kundstriǒm and Egelrud 1990b)。
據(jù)認為，證明類似于負責(zé)足底手掌(palmo-plantar)角質(zhì)層細胞脫落的機理也存在于除了 及足底外的身體其它部位的皮膚角質(zhì)層中是很重要的。Takahashi等人(Takahashi et al.，1987)已報道去污劑N，N-二甲基十二烷胺氧化物(Sigma，St．Louis，MO)和十二烷基硫酸鈉(Bio-Rad，Richmond，CA)之8∶2(摩爾比)混合物在導(dǎo)致經(jīng)胰蛋白酶消化整個表皮所制備的非手掌足底(non-palmo-plantar)角質(zhì)層中的細胞分離。為了避免外源性胰蛋白酶的污染，將得自正常人臀部皮膚的鉆取活組織檢查物于pH8與上述去污劑混合物和EDTA一起溫育(Egelrud and Lundstriǒm，1990)。發(fā)現(xiàn)在上述條件下，角質(zhì)層分離為單個細胞。向溫育培養(yǎng)基中加入抑肽酶能防止這一分離過程。由此得出結(jié)論，在非足掌足底角質(zhì)層細胞粘連中也依賴于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，該組織中的脫屑依賴于蛋白質(zhì)水解，并且該組織含有能催化該蛋白質(zhì)水解的蛋白酶。因為細胞分離僅涉及到角質(zhì)層而不涉及較深的非角化表皮層，所以可以得出這樣的結(jié)論，有關(guān)的責(zé)任蛋白酶以非活化或被抑制狀態(tài)存在于深層。實施例2角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(SCCE)的發(fā)現(xiàn)該酶是一種蛋白酶，所符合的標準是負責(zé)降解離體并且也可能是在體的角質(zhì)層中細胞間的粘連結(jié)構(gòu)。
從實施例1中所述的實驗可以得出結(jié)論，負責(zé)足底角質(zhì)層脫屑離體模型中單極表面細胞分離的蛋白酶應(yīng)該具有下列特性1.必須存在于角質(zhì)層。
2.必須是絲氨酸蛋白酶。
3.應(yīng)該具有胰凝乳蛋白酶樣底物特異性和類似于在離體的細胞脫落和相關(guān)的DG I降解中所觀察到的抑制劑圖譜。
4.必須定位在角質(zhì)層的細胞外。
5.必須具有使其在生理條件下有活性的pH值依賴性，角質(zhì)層的pH值大約為4.5-6。
6.因為即使溫育培養(yǎng)基的體積與被溫育的組織片相比很大，或者即使在溫育過程中反復(fù)地更換溫育培養(yǎng)基，離體足底角質(zhì)層的細胞脫落過程仍然不斷進行，因此似乎有理由假設(shè)有關(guān)的責(zé)任酶在溫育過程中以不使之被抽提至溫育培養(yǎng)基中的方式與所說的組織結(jié)合。
下面的兩個實驗導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)了SCCE(Egelrud and Lundstrom 1991)2.1.與分離的足底角質(zhì)細胞相關(guān)的酶活性借助如實施例1所述的培養(yǎng)足底角質(zhì)層的方法制備分離的足底角質(zhì)層細胞(角質(zhì)細胞)。所說細胞經(jīng)篩孔大小為100μm的尼龍網(wǎng)過濾，然后用10體積的0.1M Tris-HCl pH8、5mM EDTA洗3次，用0.1M Tris-HCl pH8洗3次。再將細胞與下列兩類產(chǎn)色素的蛋白酶底物S-2288或S-2586(Kabi Diagnostica，Stockholm，Sweden)一起溫育Ile-Pro-Arg-對硝基苯胺(S-2288)被具有精氨酸特異性的廣譜絲氨酸蛋白酶裂解(例如胰蛋白酶)；Arg-Pro-Tyr-對硝基苯胺(S-2586)是胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶的底物。
在120μl總體積中，每一反應(yīng)混合物含0.07M Tris-HCl pH8，0.1％疊氮化鈉，1、2.5、5或10μl被洗過的足底角質(zhì)細胞之25％懸液和1.04mM(S-2586)或1.25mM(S-2288)底物。在微量滴定板中于37℃溫育5小時后，加入125μl 10％乙酸中止反應(yīng)。沉積細胞，取每一上清液200μl轉(zhuǎn)移至新孔中。在Behring ElisaProcessor(Behringwerke，Marburg，Germany)中除去細胞后水解兩種底物，隨后檢測405nm處吸光率的改變。
如圖6所示，存在與分離的足底角質(zhì)細胞相關(guān)的酶活性，能催化S-2586水解。相比之下，其對S-2288的催化活化要低一些。
其后研究了S-2586水解活性的pH依賴性。如上所述的實驗設(shè)計，應(yīng)用了10μl洗過的足底角質(zhì)細胞的25％懸液和具有不同pH的緩沖液(乙酸鈉、磷酸鈉或Tris-HCl)。最終的緩沖液濃度為0.07M。結(jié)果如圖7所示。從中可以看到，pH7-8時的活性很理想，但在pH5.5時也有效。
在進一步的實驗中，研究了EDTA、金屬離子和蛋白酶抑制劑對與懸浮的足底角質(zhì)層細胞相關(guān)的蛋白酶在pH8時水解S-2586的影響。上文及表2概述了實驗設(shè)計。
表2EDTA、金屬離子和蛋白酶抑制劑對與足底角質(zhì)層細胞有關(guān)的蛋白酶水解S-2586的影響(酶源懸浮細胞)抑制劑濃度 活性(％)(±SD，n＝3)無 - 100EDTAa4.2 mM109±1PMSFb1mM 8±3抑肽酶a3 μM 10±l大豆胰蛋白酶抑制劑a0.16μM 6±1抑糜朊酶素a.c11 μM 66±955 μM 32±0275 μM 15±3亮肽素a.c325 μM 93±3ZnSO4a100 μM 10±3HgCl2a100 μM 84±2CuSO4a100 μM 85±2a存在于測定混合物中的物質(zhì)。b如上文所述制備的足底角質(zhì)層細胞之25％懸液在溶于2-丙醇(2-丙醇終濃度為4％v/v)中的1mM PMSF(Sigma，St.Louis，MO)存在的條件下于室溫預(yù)溫育1小時。對照只與4％ 2-丙醇預(yù)溫育。c抑制劑溶解于二甲亞砜(DNSO)。所有的培養(yǎng)(包括對照)含5％(v/v)DMSO如表2所示，除了亮肽素(一種胰蛋白酶抑制劑外)，苯基甲基磺?；?PMSF，一種通用的絲氨酸蛋白酶抑制劑)、抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制劑、抑糜朊酶素(一種胰凝乳蛋白酶抑制劑)和Zn2+都抑制S-2586的水解活性。因此，其抑制劑圖譜非常類似于在離體細胞脫落和DG I的有關(guān)降解過程中所觀察到的。2.2.分離的足底角質(zhì)層的酶圖已經(jīng)了解到，在用溶于0.1M Tris-HCl pH8中的1M KCl抽提角化細胞時，上文2.1中所發(fā)現(xiàn)的負責(zé)S-2586水解活性的酶可溶。因此，進行了有關(guān)酶圖的實驗。為此，除了樣品緩沖液中不含還原劑并且不加熱樣品外，根據(jù)Laemmli(Laemmli 1970)的方法制備用于電泳的角化細胞之KCl提取物。還借助用不含還原劑的Laemmli樣品緩沖液于室溫抽提分離的足底角質(zhì)細胞的方法制備樣品。為了得到酶圖，采用改良的Horie等人的方法(Horie et al.，1984)。根據(jù)Laemmli的方法在含1％共聚的熱變性酪蛋白的12.5％凝膠中進行SDS-PAGE。電泳后，凝膠在含2％Triton X-100的緩沖液中于室溫浸泡1小時以除去SDS，然后于37℃溫育15小時。再用考馬斯蘭將凝膠染色。分離的酪蛋白水解酶在蘭色背景下顯出了清晰的條帶。實驗詳細的過程也可參見圖8之

。
實驗結(jié)果如圖8所示。足底角化細胞的提取物含有一個表觀分子量大約25KD的主要酪蛋白水解酶。還存在一個分子量約30KD的次要酪蛋白水解酶(在圖中不能清楚地看到這些次要成分。但后來發(fā)現(xiàn)它們能被亮肽素而不能被抑糜朊酶素抑制)。25KD酶在pH5.5-8有顯著的活性。除了亮肽素外，它能被抑肽酶、Zn2+和抑糜朊酶素抑制。它因此而具有與上述S-2586水解活性相同的抑制劑圖譜。在凝膠排阻層析實驗中(未顯示)發(fā)現(xiàn)25KD酪蛋白水解酶與S-2586水解活性共層析。
在運用上述2.2相同技術(shù)的進一步實驗中(未顯示)發(fā)現(xiàn)非手掌足底角質(zhì)層含有與足底角化細胞相關(guān)的25KD蛋白酶特性明顯一致的酶，從現(xiàn)在起，該酶被稱為角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(SCCE)(Lundstrom and Egelrud 1991)。
還有可能得到SCCE以使其在角質(zhì)層細胞外空間具有活性的方式與足底角質(zhì)細胞相關(guān)的證據(jù)。為此，首先證實分離的角化細胞不可滲透辣根過氧化物酶(分子量44KD)。然后證明人纖維蛋白原(分子量340KD)能被角質(zhì)細胞懸液降解，并且該降解過程能被與SCCE一樣的抑制劑抑制?？梢耘懦w維蛋白原的降解是因為可溶性酶的可能性(Egelrud 1992)。實施例3部分純化角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(SCCE)和用產(chǎn)色素的底物進行蛋白酶測定3.1.制備足底角質(zhì)細胞的KCl提取物按比例擴大如實施例1所述的分離的足底角質(zhì)細胞的產(chǎn)量，并制備如實施例2所述含SCCE的洗滌過的足底角質(zhì)細胞的KCl提取物。
下列表3用圖解方式概述了足底角質(zhì)細胞KCl提取物的制備過程。通過與Society for Swedish Pedicyrists合作收集增生的人足底角質(zhì)層。只使用經(jīng)剪切得到的材料。不從脫落紊亂的足收集材料。在加袋之前先在空氣中干燥角質(zhì)層，并裝入塑料袋中。在實驗室里，將其貯存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 表3圖示說明分離的足底角化細胞之含SCCE的KCl提取物的制備過程足底角質(zhì)層50g 為了每一個后續(xù)的親和層析步驟，合并得自兩種制備物的提取物1和提取物2。所說的制備物來自50克的各種足底角質(zhì)層。3.2.用產(chǎn)色的底物進行蛋白酶測定比較SCCE、牛胰凝乳蛋白酶和人組織蛋白酶G有關(guān)抑制劑抑肽酶、抑糜朊酶素、ZnSO4和底物特異性的影響。
MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA(S-2586)的貯液用蒸餾水制備，Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(Boehringer，Mannkeim，Germany)的貯液用1-甲基-2-吡咯烷酮(溫育混合物中溶劑的終濃度為4％)制備，抑糜朊酶素的貯液以二甲亞砜(溫育混合物中溶劑的終濃度為1％)制備。從E.Lotti，Geneva，Snitzerland得到人膿痰中的組織蛋白酶G。SCCE的來源是如上所述制備的分離的足底角質(zhì)細胞之KCl提取物。抑制劑抑肽酶、抑糜朊酶素和ZnSO4的來源如上所述。
溫育過程在微量滴定板中于37℃進行?？倻赜w積是135μl。每一溫育混合物含Tris-HCl pH8.0(終濃度0.08M)、KCl(終濃度0.2M)、100μl底物溶液、25μl酶源(在0.1M Tris-HCl pH8.0，1.0M KCl中適當稀釋)和10μl抑制劑溶液。
圖9中，A-C，MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA(S-2586，起始濃度1.2mM)用作底物。D，兩種底物的起始濃度為1.2mM。
在溫育過程結(jié)束時(1.5小時)，向每孔中加入125μl 10％乙酸，以不加酶的溫育混合物作空白讀取405nm處的吸光率。調(diào)整所加酶量，使溫育結(jié)束時405nm處產(chǎn)生0.3～0.7的吸光率改變。
所得結(jié)果總結(jié)于圖9，A-D。為了研究抑制劑的作用，用S-2586作底物。抑肽酶作為SCCE和胰凝乳蛋白酶的抑制劑的效率較高，且對于兩種酶而言大約相等。另一方面，對組織蛋白酶G的影響非常之小(圖9A)。抑糜朊酶素導(dǎo)致對所有三種酶的抑制作用，但引起50％抑制作用的抑制劑濃度對于SCCE比對胰凝乳蛋白酶和組織蛋白酶G要高三個數(shù)置級(圖9B)。ZnSO4是SCCE的有效抑制劑，但不能有效抑制胰凝乳蛋白酶和組織蛋白酶G(圖9C)。圖9D比較了三種酶對底物MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA(S-2586)和Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA的活性。因為其目的是要找出所測酶之間的相似性和區(qū)別，所以這些實驗僅在針對每種底物的一種起始濃度下進行。對于胰凝乳蛋白酶和組織蛋白酶G而言，Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA似乎是比S-2586好得多的底物，而對SCCE卻正相反。實施例4純化角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶及測定其N-末端氨基酸序列4.1.通過于不溶性大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)上進行親和層析從角質(zhì)細胞KCl提取物中純化SCCE圖10顯示在SBTI上親和層析的結(jié)果。通過按照廠商的推薦將50mg SBTI(Boehringer，Mannbeim，Gernnany)連至12ml沉淀的Affigel 15(BioRad，Richmond，CA)以制備親和凝膠。凝膠上剩余的活性基團用乙醇胺封閉。將自100克(干重)足底角質(zhì)層的合并的KCl提取物(總體積700ml)通過鋪于玻璃柱中的0.8×2cm SBTIAffigel 15床，流速42ml/h，持續(xù)記錄洗出液在280nm處的吸光率。用0.1M Tris-HCl pH8、1M KCl沖洗該柱直至洗出液吸光率低于0.01，然后用10ml 0.1M Tris-HCl pH8沖洗。用1、10和100mMHCl逐步洗脫結(jié)合的物質(zhì)。當洗出液吸光率的變化降至0.01以下時更換洗脫液。在含有pH8，總體積0.4ml Tris-HCl的試管中收集3ml級分，直至使其量足以將洗出液的pH調(diào)整至7以上。立即檢查各級分的pH值，且如果必要可用小量1M Tris-HCl pH8調(diào)節(jié)其至7左右。如實施例2.1所述，用S-2586(SCCE的底物)和S-2288(胰蛋白酶樣酶的底物)分析肽水解活性。測定混合物中兩種底物的初始濃度為1.1mM。約90％的S-2586水解活性結(jié)合至凝膠上。在用10-100mM HCl逐步洗脫凝膠時，可以回收所應(yīng)用的KCl提取物中總S-2586水解活性的約60％。約20％的總S-2288水解活性結(jié)合至親和凝膠上，且在洗出液中可回收10％。
圖11顯示了在SDS(SDS-PAGE)存在下用聚丙烯酰胺凝膠電泳對SBTI親和層析的洗出液的分析結(jié)果及酶圖。在12.5％凝膠上對未還原的樣本進行電泳。并請參見Egelrud和Kundstrom 1991以及實施例2、2.2以了解實驗的細節(jié)。在制備樣本進行電泳前，通過用Ultrafree-MC-過濾器(截流分子量10KD；Millipore，Bedford，MA)進行離心過濾將樣本在A中濃縮20倍，并在B中稀釋10倍。
圖12中顯示了自SBTI親和層析的未還原及還原樣本SDS-PAGE的比較。如圖10和11所示，SBTI親和層析產(chǎn)生了純度大于90％(由考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠所判斷)、未還原形式時表觀分子量約25KD、以還原形式時表觀分子量約28KD的蛋白質(zhì)。另外，存在著表觀分子量比主要成分約大1KD的次要考馬斯藍陽性成分。酶圖凝膠上，未還原樣本存在著與在考馬斯藍染色凝膠上測出的兩條帶一樣，電泳遷移率的一主要條帶和一次要條帶。這兩種酪蛋白水解成分可被抑糜朊酶素抑制。另外，酶圖顯示了表觀分子量約30KD的次要成分，它可被亮肽素抑制?？梢缘贸鲋饕募兓鞍诪镾CCE。4.2.SCCE N末端氨基酸序列的分析制備200μl自SBTI-Affigel 15層析的、A280nm 0.2的級分以進行還原或未還原的SDS-PAGE，將其在12.5％聚丙烯酰胺凝膠(厚1mm，槽寬73mm)電泳。電泳后將分開的蛋白電轉(zhuǎn)移至Immobilon濾膜(Millipore)上，并用考馬斯藍按Natsuidaira(1987)的方法染色。切下主要蛋白帶，并將其在具有聯(lián)機PTH 120A分析儀(AppliedRiosystems Inc.，F(xiàn)oster City，CA，USA)的Apphied Biosystems477A脈沖液相氨基酸序列分析儀中進行處理。以常規(guī)循環(huán)程序和來自廠家的化學(xué)品進行測序。初始及重復(fù)的產(chǎn)率(從標準蛋白計算)分別為25％和97％。
氨基酸衍生物的產(chǎn)率只與被測序的一個肽相符。用未還原樣本，產(chǎn)率在步驟1-6中較好，但在第七步驟和第九步驟時則降至0。隨后的步驟中的產(chǎn)率顯著下降。同樣用還原樣本，在步驟7和9中未檢測到氨基酸衍生物，但在后續(xù)能檢測到衍生物的步驟中產(chǎn)率沒有急劇下降。這些結(jié)果表明在7位和9位存在胱氨酸。但是，在用碘乙酸(100mM)還原處理后不可能在第7步驟中檢測到羧甲基化的半胱氨酸。對于還原的和非還原的樣本而言，所獲序列是一致的(圖13，SEQ ID NO3)。實施例55.1.SCCE特異性單克隆抗體的制備將用實施例4.1中描述的方法純化的、溶于福氏完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，MI)中的約30μg天然SCCE皮下注射給BALB/C小鼠(Bomholtgaard，Denmark)。一個月后重復(fù)注射溶于福氏不完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，MI)中、含有相同置SCCE的注射液。于第一次注射后四個月，給一只小鼠連續(xù)3天每次靜脈加強注射30μg抗原。用SP2/0骨髓瘤細胞系(ATCC CRL 1581)的細胞按照Carlsson et al.，1985描述的方法制備雜交瘤。用ELISA技術(shù)鑒定與純化的SCCE制備物反應(yīng)的抗體。在SDS-PAGE后用免疫印跡法進一步分析陽性克隆的培養(yǎng)上清液。于小鼠腹水液中增殖與本試驗中SCCE產(chǎn)生反應(yīng)的抗體的克隆，且以蛋白A親和層析法純化抗體并以Carlsson et al.，1985描述的方法對抗體進行分類。獲得了兩種有用的抗體，moab TE4b和moab TE9b，兩種抗體均為IgG1-Kappa。
用免疫沉淀法和免疫印跡確定的moabs TE4b和TE9b的特征示于圖14中。圖14a(2泳道)顯示了含分離的足底角質(zhì)細胞的濃縮KCl提取物的考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠，所說細胞提取物按實施例3.1中的描述制備。將樣本用0.1M乙酸鈉pH4透析4小時，并在制備用于電泳前用超濾法將其濃縮約100倍。圖14a(3泳道)顯示了按實施例4.1中的描述純化的SCCE的制備物。
圖14b顯示了免疫沉淀實驗的結(jié)果，實驗中，抗體與角質(zhì)細胞KCl提取物溫育一段時間，然后與不溶性蛋白A一起回收。用實施例2中描述的酶譜法分析重新溶解并分離的抗原抗體復(fù)合物。
將250μl分離的足底角質(zhì)細胞KCl提取物與10μl抗體溶液或磷酸鹽緩沖液混勻并溫育(于4℃)15小時，所說提取物已被超濾濃縮5倍，且用磷酸鹽緩沖液進行了透析并向其中加入牛血清白蛋白(Sigma，St.Louis，MO)至終濃度為每毫升10mg。然后將25μl沉淀的蛋白A Sepharose(Pharmacia，Uppsala，Sweden)加至試管，于室溫下輕搖繼續(xù)溫育2小時。離心回收凝膠，用1ml溶于0.05MTris-HCl(pH7.5)、0.5M NaCl中的0.05％ Tween 20(Sigma，St.Louis，MO)洗5次。最后一次沖洗后，于室溫下用100μl不含還原劑的Laemmli’s樣本緩沖液對凝膠進行抽提1小時。離心澄清提取物并加至凝膠上。
Moabs TE4b和TE9b兩者均能沉淀與純化的SCCE具有相同分子量的酪蛋白水解酶以及KCl提取物中相應(yīng)的主要的酪蛋白水解酶。這些抗體不能沉淀提取物中分子量約30KDa的次要的酪蛋白水解酶，這些酶已表明可被亮肽素(胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的一種抑制劑)所抑制。除25KDa酪蛋白水解酶外，所說抗體似乎可與分子量約80KDa的次要的蛋白水解成分結(jié)合。該成分通常存在于從制備前已干燥的組織中制得的足底角質(zhì)細胞KCl提取物中，但在新鮮的組織制備物中未能發(fā)現(xiàn)(T.Egelrud，未發(fā)表的觀察結(jié)果)。它在通過親和層析純化的SCCE制備物中也不存在，且可能代表了一凝集的產(chǎn)物。已不可能在免疫印跡中檢測出與抗體反應(yīng)的相應(yīng)成分。
在于非還原條件下進行的SDS-PAGE凝膠的免疫印跡上(圖14c)，moabs TE4b和TE9b可與存在于足底角質(zhì)細胞KCl提取物中的成分反應(yīng)(圖14c泳道2和4)以及與純化的SCCE制備物中存在的成分反應(yīng)(圖14c泳道3和5)，兩者與酶譜上主要的純化蛋白以及主要的酪蛋自水解成分具有相同的分子量?？贵w與在SDS存在下已還原的樣本不反應(yīng)，這表明它們針對的是構(gòu)象依賴性抗原決定簇。
除分子量約25KDa的以非還原形式存在的主要的蛋白質(zhì)外，純化的SCCE制備物還含有分子量約26KD的次要的考馬斯陽性成分(非還原的；參見實施例3)。酶譜上存在一相應(yīng)的酪蛋白水解成分且能被抑糜朊酶素以相似于主要的25KD酪蛋白水解成分的方式抑制(參見實施例3)。在moabs TE4b和TE9b較高濃度(結(jié)果未顯示)時，也可見該次要成分與免疫印跡上的抗體反應(yīng)。用針對以制備性電泳純化的主要考馬斯陽性成分的多克隆兔抗體已獲得相似的結(jié)果(未顯示)。還不知道具有SCCE樣活性和表現(xiàn)免疫交叉反應(yīng)的兩種蛋白之間確切的關(guān)系。5.2.多克隆SCCE特異性抗體5.2.1.雞抗SCCE于60℃將溶于0.2ml 0.1M Tris-HCl中通過實施例4.1中描述的SBTI親和層析法純化的45μg SCCE加熱變性60分鐘，并在等體積的福氏完全佐劑(Difco Laboratories)中攪勻。將得到的乳劑給約20周齡的Derco雞進行皮下注射，注射前先從雞中抽血以制備免疫前血清。于3、5和7周后，給雞另外皮下注射按上述方法制備的乳劑，但該乳劑為含福氏不完全佐劑和30μg純化的熱變性的SCCE(各乳劑的總體積為250μl)。最后一次注射2周后取雞血。將血迅速與2體積的Alsever’s液(每100ml100ml 1.87克葡萄糖、0.8克檸檬酸鈉、0.62克氯化鈉，檸檬酸調(diào)整pH至pH 6.1)混和并離心。將經(jīng)1/2000稀釋的選為進一步研究用的雞抗SCCE用于免疫印跡的實驗中。參見圖17、實施例8說明該抗血清的特異性。5.2.2.兔抗SCCE根據(jù)Laemmli 1970的方法，將SBTI親和層析純化的SCCE如實施例4.1描述的、在厚15mm的凝膠上進行未還原的SDS-PAGE。按照Lee，et al，1987的氯化銅染色法看見了以前顯示為SCCE的主要蛋白質(zhì)條帶，將其切下。根據(jù)Lee et al，1987的方法，用EDTA去除氯化銅之后，在磷酸鹽緩沖液中將凝膠片均化。攪勻的凝膠片樣本懸于等體積的福氏佐劑中。將約30μg按此種方法制備的、溶于完全佐劑中的純SCCE皮下注射給兔。3、5和7周后以同量SCCE重復(fù)注射，但是是用不完全佐劑。最后一次注射后2周取兔血。
將所得兔抗SCCE(D-5)以1/500-1/1000的稀釋度用于以堿性磷酸酶連接的從抗兔免疫球蛋白作為第二抗體的免疫印跡實驗中。
在所有的免疫印跡實驗中，按照Blake et al.1984的方法檢測結(jié)合的第二抗體(參見實施例5、8和9)。
以同樣的方法制備兔抗SCCE Bo-1，但用在SDS-PAGE之前已被還原的SCCE作為抗原。5.3.用單克隆抗體進行免疫組化研究在用SCCE特異性單克隆抗體進行的免疫組化研究中，可在人角化鱗狀上皮的高基底上細胞(表皮、毛囊的內(nèi)根層(inner rootsheet)、硬腭)檢測出，但在非角化鱗狀上皮(毛囊的內(nèi)根層、嘴唇以及頰粘膜)中不能被檢測出。因此SCCE可在角化鱗狀上皮中特異性表達。而且，發(fā)現(xiàn)SCCE在體外重新構(gòu)建并在氣-水交界面生長的人表皮的高基底上細胞中表達。當向培養(yǎng)基中加入視黃酸使其濃度達到能刺激角化細胞增殖但抑制角質(zhì)層形成時，SCCE不再表達。這表明SCCE表達可能是表皮分化過程的一部分。
用SCCE特異性單克隆抗體進行的免疫電鏡實驗的結(jié)果與SCCE在橋粒降解以及脫屑中的作用相符?？贵w特異性地標記了向最上層囊泡細胞與最下層角質(zhì)層細胞內(nèi)空間進行分泌的層狀體(lamel larbodies)，而在角質(zhì)層中，抗體識別出細胞外空間中與橋粒密切相關(guān)的抗原決定簇。實施例6編碼人SCCE的cDNA的克隆與測序從Promega(Madison，MI)獲得限制性酶，從Perkin-Elmer-Cetus(Norwalk，CT)獲得TAQ-聚合酶。從Clontech Laboratories(Palo Alto，CA)獲得成人上皮來源的角質(zhì)細胞mRNA制備的λgt11人角質(zhì)細胞cDNA文庫。起初，用抗SCCE兔多克隆血清D-5和Bo-1(見實施例5.2.2)篩選該文庫。由于Bo-1多克隆抗SCCE血清產(chǎn)生高的背景信噪，所以早期即將其排除在更深入的篩選研究之外。正如對真正的陽性斑所估計的，用D-5抗血清富集了許多免疫反應(yīng)斑。對于任何噬菌斑，未觀察到與單克隆抗體moAb4和moAb9的反應(yīng)性。11個已分離的噬菌斑的廣泛的限制性酶特征以及PCR特征顯示在不同的噬菌斑間未測到相似性。這種部分相似性的存在表明噬菌斑含有來自同一cDNA序列的同源DNA插入片段?；诓荒軐商綔ySCCE cDNA序列的“指紋”作出定義，對策略進行了修改。
利用變性的合成寡核苷酸作為探針，借助噬菌斑雜交法在E.coli Y1090(Clontech)中篩選噬菌斑?；谌鐚嵤├?.2描述的、經(jīng)實驗確定的天然SCCE酶的氨基末端序列設(shè)計寡核苷酸探針。為構(gòu)建稱為SYM3067，SEQ ID N04的合成17-聚體寡核苷酸探針5’-ATHATHGAYGGNGCNCC-3’(H＝A或C或T；Y＝C或T；N＝A或C或G或T)，選擇了氨基酸序列最可靠的部分Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro(SEQ ID N03，aa1-aa6)。利用Beckman200A DNA合成儀，根據(jù)商家說明用亞氨基磷酸酯(phosphoramidite)合成寡核苷酸探針。
在含0.2％麥芽糖和10mM MgSO4的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)E.coliY1090菌(Sambrook et al.1989)。然后用稀釋的文庫噬菌體貯存液與0.4ml的培養(yǎng)物混和并于37℃吸附20分鐘。將受感染的培養(yǎng)物與6ml軟質(zhì)瓊脂糖(在LB和10m MgSO4中的0.75％瓊脂糖)混和。將軟質(zhì)瓊脂糖混和物傾至10個150mm LA平板上。于37℃將這些平板溫育5小時，放置4℃下過夜。這些平板含總數(shù)約為4×105的噬菌斑。
為使這些噬菌斑固定，將每個平板上覆蓋NEN DuPont Colony/噬菌斑篩選膜(DuPont，Wihnington，DE)2分鐘。將膜浸入0.5MNaOH中2分鐘2次，浸入Tris-HCl pH7.5中2分鐘2次，然后空氣干燥。然后將這些膜如下文所述用于雜交實驗中。將膜在10％硫酸葡聚糖、1M NaCl、含10mg/ml變性鯡魚精子DNA(Sigma，St.Louis，MO)的1％SDS溶液中于65℃預(yù)雜交5小時。將探針(SYM3067)用T4聚核苷酸激酶(Promega，Nedison，WI)標記上[λ-32P]dATP，然后加至預(yù)雜交混和物中。于42℃進行雜交12-18小時。
雜交后于室溫下在2×SSC中洗膜5分鐘，共四次，在2×SSC、1％SDS中于42℃洗膜30分鐘，共2次；最后于室溫下在0.1SSC中洗膜30分鐘。用X光片(Hyperfilm-MP，Amersham，UK)對膜進行放射自顯影。在初次篩選中鑒定出14個陽性噬菌斑。按上文描述的方法和用同樣的探針，對這些陽性噬菌斑再次篩選。再次篩選過程后鑒定出兩個陽性噬菌斑。再一次純化這兩個已篩出的噬菌斑，用SYM1600和SYM1601作為引物，用已分離的噬菌體作為模板，通過PCR測定插入片段的大小。這兩個引物分別與λgt11噬菌體的左臂和右臂互補。然后用EcoRI消化由噬菌體A6.2.2產(chǎn)生的約0.9kb的擴增DNA片段并克隆入EcoRI消化的pUC19(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，pS496中。用與pUC19互補的序列引物時該已克隆的片段進行部分序列分析。用T7測序盒(Pharmacia，Uppsala，Sweden或USB，Cleveland，Ohio)測定核苷酸序列。
所得DNA序列的翻譯產(chǎn)生了與實驗確定的蛋白序列同源的氨基酸序列。然而，該序列缺乏一翻譯起始密碼子。為分離全長cDNA，在瓊脂糖凝膠上分離所得的DNA片段，并在嚴格的條件下用其作為雜交的探針。按下述步驟用多引物(multiprinme)DNA標記系統(tǒng)(Amersham，UK)對該探針進行32P標記。以每克凝膠3ml的比例加入水，然后置入沸水浴中7分鐘以溶化凝膠并使DNA變性。然后將試管轉(zhuǎn)至37℃的水浴中放置至少10分鐘。按商家的說明將含約25ng DNA的一個體積DNA/瓊脂糖溶液加至標記反應(yīng)中。
為得到全長cDNA，用上文描述的同樣方法以該探針對cDNA文庫再篩選2次，除雜交是在65℃于嚴格條件下進行外。這些實驗導(dǎo)致了45個單個陽性噬菌斑的鑒定與分離，這些陽性斑起初是用SYM1600(5’-GTG GCG ACG ACT CCT GGA GCC-3’；SEQ ID NO5)或SYM1601(5’-ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG-3’；SEQ ID NO6)與SYM3208一起作為PCR引物(以鑒定含整個5’開放閱讀框的噬菌斑)，用PCR分析進行篩選的。根據(jù)從pS496獲得的DNA序列信息，設(shè)計了至少部分與SCCE cDNA5’部分互補的SYM3208，5’-TGGGTGGGAGCCTCTTGCACA-3’，SEQ ID NO7。此次篩選后，選出四株噬菌體進行進一步分析。為了序列分析，按上文所述，將源自這些噬菌體的所產(chǎn)生的PCR擴增片段克隆至pUC19中。所得結(jié)果表明其中的一株噬菌體205.2.1含有全長的插入片段。
根據(jù)Sambrook et al.(1989)制備噬菌體分離物205.2.1的DNA，用EcoRI消化該DNA制備物。用瓊脂糖電泳分離消化的DNA，分離出約1kb的片段并將其克隆至EcoRI消化的pUC19中。所產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pS500(圖15)。按上文所述測定該cDNA片段的完整核苷酸序列。作為測序反應(yīng)的引物，應(yīng)用了互補于pUC19或SCCE序列的特異的寡核苷酸。該核苷酸序列(SEQ ID NO1)包含了足以編碼由253個氨基酸(包括信號肽和前多聚肽(SEQ ID NO2))組成的SCCE前體蛋白的全部氨基酸序列。
發(fā)現(xiàn)另一株噬菌體106.1.2含有缺乏5’未翻譯序列和頭三個密碼子的SCCE cDNA序列。該插入片段分離為954bp的EcoRI片段并被克隆至EcoRI線性化的pUC19中，產(chǎn)生質(zhì)粒pS498。該質(zhì)粒被部分測序。
發(fā)現(xiàn)稱為108.1.2的第三株噬菌體含有也缺乏5’未翻譯序列和翻譯區(qū)七個核苷酸的SCCE cDNA序列。將cDNA插入片段具有3’未翻譯區(qū)較長的變異體，從終止密碼子下游延伸1057bp。分離該1884bp的EcoRI片段并將其克隆至EcoRI線性化pUC19中。對所產(chǎn)生的質(zhì)粒進行徹底測序并稱之為pS501。實施例7人表皮中SCCE mRNA的檢測從人表皮中制備總RNA按照Chomczynski和Sacchi，1987的方法進行此制備。從整形外科手術(shù)中得到無病的人腹部皮膚。切除后立即置冰上冷凍。在少于15分鐘的時間內(nèi)，通過用手術(shù)刀片有力的刮擦收取表皮，并將其浸入溶液D(Chomczynski和Sacchi，1987)中并用玻璃均漿器進行均化。然后進行由Chomczynski和Sacchi描述的實驗方案。于-20℃將顆粒狀的總RNA貯于70％乙醇中直至進一步分析。信使RNA的制備根據(jù)商家的說明，用Poly A Tracf盒(Promega)處理500μg總表皮RNA。RNA電泳和印跡用溶于1×MOPS緩沖液中的0.66M甲醛和0.6g/ml溴化乙啡啶(Sigma，St.Louis，MO)制備瓊脂糖凝膠(1.4％)。將相應(yīng)于100μg總RNA的mRNA溶于RNA樣本緩沖液(50％甲酰胺，2.2M甲醛，3％Ficoll，1×MOPS)中并在應(yīng)用前于60℃加熱5分鐘。用同樣方法處理RNA標準物(BRL，Gaithersburg，MD)。電泳后，將凝膠浸入蒸餾水中5分鐘，然后浸在50mM NaOH中30分鐘和0.1MTris-HCl pH7.5中30分鐘。在10×SSC中用Vacu-Gene設(shè)備(Pharmacia，Uppsala，Sweden)進行至GeneScreen Plus膜(NENDuPont，Wilmington，DE)的印跡1小時。然后在3×SCC中洗膜，過夜干燥，于80℃烘焙2小時。于UV光下可在膜上看到RNA。cDNA探針將按實施例6的描述制備的質(zhì)粒pS501用HincII和BglII消化。該cDNA在bp No 1060處含一個HincII位點，在bp No1715處含一個BglII位點。1070bp片段(pUC19多克隆位點中HincII位點-內(nèi)源性HincII位點)含有除5’端7個bp外的SCCE編碼區(qū)以及包括于bp944-951的多聚腺苷酸化位點的未翻譯區(qū)，該區(qū)對已分離的所有SCCE-cDNAs均是普遍的。不含Poly A-尾的655bp HincII-BglII片段對SCCE cDNA108-1-2是獨特的。用瓊脂糖電泳純化這些片段，且用多引物DNA標記盒(Amersham，Buckinghamshire，UK)將其用于32P dCTP標記的探針的制備。雜交在溶于1×TE的1％SDS中將膜煮沸30分鐘并于60℃在1％SDS、1M NaCl、10％硫酸葡聚糖和含鯡魚精子DNA 0.1mg/ml的溶液中預(yù)雜交3小時。于60℃在同樣的溶液中雜交過夜。在溶于2×SCC的1％SDS中于60℃洗膜2×30分鐘，于室溫下在0.1×SCC中洗膜3小時。然后將膜進行放射自顯影。結(jié)果可以顯示出人表皮中存在大小分別為大約1.2kb和2.0kb的兩種mRNA(圖16)。這與自發(fā)現(xiàn)了兩種類型cDNA的克隆實驗所得到的證據(jù)相符得很好。實施例8在E.coli中表達重組SCCEpGEX-2T/SCCE質(zhì)粒的構(gòu)建1.有義PCR引物1.a CGTGGATCCATCGAAGGTCGTATTATTGATGGCGCCCCATGT(SYM3367；SEQ ID NO8，下劃線的3’部分編碼活性天然SCCE的N端氨基酸IIDGAPC，帶BamHI位點和一另外序列的5’部分編碼因子Xa位點IEGR)。1.b CGTGGATCCATCGAAGGTCGTTTGGAAACTGCAGGAGAAGAA(SYM3368；SEQ ID NO9，下劃線的3’部分相應(yīng)于完整SCCE-cDNA序列中編碼氨基酸序列LETAGEE的堿基對76-96，5’部分如1a)。2.反義PCR引物TGATCCTCTGAGCTCTCCTG(SYM3371，互補于具有于pb294處SacI位點的完整SCCE-cDNA序列SEQ ID NO1中的堿基對285-304)。
用引物1a/2和1b/2 PCR擴增pS498(實施例6)的序列。借助酸抽提和乙醇沉淀純化所得產(chǎn)物，并用BamHI/SacI消化和用瓊脂糖電泳純化。然后將其與用SacI和EcoRI消化pS498得到的SCCE106-1-2的3’673個堿基對一起，在TG 2細胞中克隆至用BamHI/EcoRI消化的pGEX-2T(Pharmacia)中。從用于表達研究的細菌克隆中分離到質(zhì)粒(編碼緊鄰于因子Xa位點的天然N末端的pS510，和編碼緊鄰于因子Xa位點的所預(yù)計的前肽的pS511)。借助T7測序盒(Pharmacia，Uppsala，Sweden)用雙脫氧鏈終止法檢查相應(yīng)于PCR產(chǎn)物插入片段的核苷酸序列。表達研究用新鮮培養(yǎng)基，將生長于含50ng/ml羧芐青霉素(Sigma，St.Louis，MO)LB培養(yǎng)基中的含pS510和pS511的TG2細胞過夜培養(yǎng)物稀釋10倍，并于37℃培養(yǎng)3小時。加入IPTG(Sigma，St.Louis，MO)至終濃度為0.1mM，將培養(yǎng)物在37℃再培養(yǎng)3小時。于PBS1％Triton X-100(Sigma St.Louis，MO)中超聲處理細菌沉淀物。以10,000×g離心15分鐘后，用SDS-PAGE分析上清液及沉淀物，且與多克隆SCCE特異性雞抗血清進行免疫印跡。
在不溶于PBS-Triton X-100的沉淀物中發(fā)現(xiàn)了大量的分子量約50KD(pS5100和52KD(pS511)具有SCCE樣免疫反應(yīng)性的IPTG可誘導(dǎo)蛋白(參見圖17)。
經(jīng)在PBS-Triton X-100中超聲處理后，上清液含有與在不溶沉淀物中相同大小的GST/SCCE融合蛋白，但其量與不溶沉淀物相比較低。
這些結(jié)果表明表達SCCE作為具有GST的融合蛋白是可能的，并且相應(yīng)于前SCCE原氨基酸序列中特異蛋白酶裂解位點的序列將使重復(fù)進行目的為在細菌中產(chǎn)生重組SCCE的這一實驗成為可能。產(chǎn)生的蛋白可溶于尿素或鹽酸胍中，然后由于SCCE的高等電點，用陽離子交換層析進行純化。通過將純化的蛋白質(zhì)對含較低濃度變性劑的緩沖液進行透析使之變性，然后用因子Xa裂解以從SCCE或SCCE原中釋放GST多肽。也可將GST/SCCE融合蛋白用作免疫原以生產(chǎn)SCCE特異性抗體，且也可用作抗體純化中的免疫吸附劑。實施例9哺乳動物細胞中重組人SCCE的表達為了產(chǎn)生生產(chǎn)重組SCCE的表達載體，從質(zhì)粒pS500中分離出897bp EcoRI/DraI片段的人cDNA序列。將該片段亞克隆至EcoRI和SmaI消化的pUC19中，產(chǎn)生pS502。然后用EcoRI和SalI消化質(zhì)粒pS502以分離出0.9kb片段的SCCE cDNA序列，然后將其再亞克隆至缺失HindIII位點的pUC19變異體中，形成質(zhì)粒pS503。該pUC19變異體是通過用HindIII消化pUC19、用Klenow酶填平并再連接而產(chǎn)生的。為了便于克隆至表達載體，在SCCE cDNA 5’端導(dǎo)入HindIII位點。這一步驟通過用EcoRI消化pS503并插入將該位點轉(zhuǎn)變?yōu)镠indIII的接頭，SYM3603 5’-AATTGTGGAAGCTTCCAC-3’，SEQ ID NO10。將所產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pS505，該質(zhì)粒編碼于5’末端具有HindIII位點且在3’端具有SalI位點的部分SCCE cDNA的蛋白。
通過將三個不同的DNA片段連接獲得最終的表達載體。首先，用HindIII和SalI消化pS505，并分離出0.9kb片段。
其次，為提供調(diào)控元件上游的鼠源金屬硫因的遠端部分、牛乳頭瘤病毒序列、提供mRNA加工信號的兔β球蛋白基因組片段以及質(zhì)粒序列，pML2d，以便可以在E.coli中進行篩選和復(fù)制(Waldenstrom et al，1992)，用SacI和SalI消化載體pS14)，分離出約12kb的片段。
第三，為分離鼠源硫因啟動子近端，用SacI和HindIII消化質(zhì)粒pS42，該質(zhì)粒中位于前導(dǎo)序列中的天然BglII已轉(zhuǎn)變成HindIII位點，分離出約220bp片段。
這三個片段的連接產(chǎn)生了SCCE表達載體pS507(參見圖18)。
將表達載體pS507與含有由Harvey肉瘤病毒5’長末端重復(fù)序列啟動的新霉素抗性基因并帶有SV40多聚腺苷酸化信號序列的載體(Lusky and Botchan，1984)共轉(zhuǎn)染至鼠C127細胞(ATCC CRL1616)中。按照磷酸鈣沉淀法(Graham and Van der Eb，1973)進行轉(zhuǎn)染實驗。于補充有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的Ham’s F12/Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM；Gibco BRL，Gaithersburg，MD)(1∶1)中培養(yǎng)細胞。以1.5mg/ml的G418(Gibco-BRL)篩選新霉素抗性細胞克隆，在10-15天篩選后，鑒定出抗性細胞克隆并從主盤中分離用于以后進一步分析。
為分析重組SCCE基因的表達，從已分離的細胞系中制備總RNA。從C127細胞中制備總RNA并將其在1％甲醛瓊脂糖凝膠上分離，轉(zhuǎn)至硝化纖維素膜并與32P標記的SCCE探針雜交。探針為由HincII消化pS500及瓊脂糖電泳分離得到的SCCE cDNA1070pb HincII片段。實驗過程按Ausubel et al.，1992的方法進行。Northern印跡實驗以及以32P標記的SCCE cDNA進行的雜交表明在含有SCCE載休pS507的幾個細胞系中可檢測到重組SCCE mRNA。在含有同樣載體但除SCCEcDNA外的C127細胞系的對照樣本中，未發(fā)現(xiàn)雜交(圖19)。1.4kb的大小對應(yīng)于所預(yù)期的大小。
收獲條件細胞培養(yǎng)基樣本并用免疫印跡分析。根據(jù)Laemmli(1970)進行SDS-PAGE，且為了進行免疫印跡，用雞抗天然SCCE作為檢測抗體。用堿性磷酸酶標記的抗雞IgG(Sigmc，St.Louis，MO)進行酶標。結(jié)果示于圖20中。
為分析重組SCCE的表達，從以表達載體pS507轉(zhuǎn)染的C127細胞中制備總RNA。從非轉(zhuǎn)染的C127細胞和用表達載體pS147轉(zhuǎn)染的C127細胞中制備作為對照樣本的總RNA。載體pS147與pS507相似，只是它含有人膽汁鹽激發(fā)的脂酶的cDNA(Nilsson et al.，1990)而不是含有人SCCE cDNA。按照Ausubel et al.(1992)的方法制備RNA。Northern印跡實驗以及用32P標記的SCCE cDNA進行的雜交表明在含有SCCE載體pS507的C127細胞中可檢測出約1.4kb的重組SCCEmRNA(圖19)。在來自C127細胞系含pS147的或非轉(zhuǎn)染的C127細胞的對照樣本中未發(fā)現(xiàn)雜交。重組SCCE mRNA的長度正如預(yù)先所料。
收獲條件細胞培養(yǎng)基樣本并用SDS-PAGE和免疫印跡進行分析。如Blake et al.1984所述對印跡顯影。所得結(jié)果(見圖20)表明含pS507的C127細胞產(chǎn)生三種蛋白，這三種蛋白顯示了可與所有商售可得多克隆兔和雞SCCE抗體以及如實施例5所述制備的抗SCCE單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)。重組SCCE反應(yīng)性蛋白顯示了比純化的天然的人SCCE大約大1KDa的表觀分子量。重組蛋白未顯示出任何蛋白水解活性。通過將推斷的SCCE氨基酸序列與實驗測定的天然的人SCCENH-2末端以及與其它胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶的序列進行比較，可以得出C127細胞中產(chǎn)生的重組SCCE是以其酶原形式存在的結(jié)論。序列數(shù)據(jù)表明該酶原可通過序列…AQGDKIIDGAP…中賴氨酸的C末端側(cè)的蛋白水解裂解被激活，下劃線的序列為活性天然人SCCE的NH-2序列(SEQ ID NO2，aa5-aa6)。實施例10重組SCCE的純化及特征確定純化將1.3mg抗天然SCCE的單克隆抗體TE4b按照生產(chǎn)商描述的方法與1.5ml CNBr活化的Sepharose(Phormacia-LKB Biotech.，Uppsala，Sweden)偶聯(lián)。將40ml含SCCE的培養(yǎng)基通過0.45μm濾器過濾，然后上柱。用10mM磷酸鈉、150mM NaCl、pH7.2，沖洗該柱幾次，然后用0.1M甘氨酸鹽酸洗脫。立即向洗脫的蛋白中加入0.1體積1M Tris-HCl(pH8.0)使之中和?；罨?7℃將以單克隆抗體偶聯(lián)的凝膠(見上文)純化的重組SCCE(200μl中含4.6μg)用0.1mg/ml胰蛋白酶4.6μl(質(zhì)量比10∶1)消化。于20分鐘、1小時、3小時和20小時時取樣(50μl)，并加入5μl 10μM(4-脒苯基)磺酰甲烷(APMSF；BoehringerMambeim，Germany)終止反應(yīng)。如實施例2.2描述的在酪蛋白凝膠上進行非還原SDS-PAGE測定裂解的SCCE的活性。通過還原的SDS-PAGE，然后用雞抗天然SCCE，接著用抗雞IgG標記了的堿性磷酸酶以及氮藍四唑和作為堿性磷酸酶底物的5-溴代-4-氯代-3-吲哚磷酸鹽所進行的免疫印跡測定所得SCCE裂解形式的一致性。N末端測序用Bio-Dot SF裝置(Bio-Rad，Richmond，CA)將親和純化(如上文所述)的SCCE約35μg狹縫印跡(slot-bloued)至Immobilon膜(Millipore，Bedfore，MA)上。然后用蒸餾水洗脫幾次以除去所有的Tris和甘氨酸。切下結(jié)合有蛋白的那部分膜并用具有聯(lián)機的PTH120A分析儀的Applied Biosyslems(Foster City，CA)477A脈沖液相測序儀測序。用常規(guī)循環(huán)程序及來自廠家的化學(xué)品進行測序。獲得的序列的頭六個位置為glu-glu-ala-gln-gly-asp，它相應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸-7--2。從這一結(jié)果可以得出結(jié)論，信號肽含有22個氨基酸并基于天然活性SCCE的N末端氨基酸序列，前肽含七個氨基酸。去糖基化在20μl 0.5％SDS和0.1M β-巰基乙醇中將純化的重組SCCE(5μg)和天然SCCE(20μg)煮沸3分鐘。用磷酸鈉緩沖液(pH8.6)和Nonidet P-40稀釋樣本至終濃度分別為0.2M和1.25％。加入N-糖苷酶F(Boehringer，Mannbeim)(對重組蛋白加0.6單位酶，對天然蛋白加1.2單位酶)，并于37℃將反應(yīng)混合物溫育過夜。測定樣本中SDS終濃度為0.17％。在8-18％SDS-PAGE上分析N-糖苷酶F處理的SCCE，然后如上文所述進行免疫印跡。所得結(jié)果表明靠上方的兩條帶的表觀分子量降低而最下方的條帶的表觀分子量未變(圖23)。這表明C127細胞中產(chǎn)生的重組SCCE以兩種糖苷化形式以及一種非糖苷化形式存在。這一結(jié)果與用活性天然SCCE所見結(jié)果類似(圖23)。實施例11包含SCCE的組合物可按照常規(guī)藥劑技術(shù)制備該類組合物，它包括將活性成分徹底與其它成分混和。所有百分含量均以重量計。
包含超過一種活性成分的組合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此下述實施例也被解釋為包括不只一種活性物質(zhì)。以相似的方法，名詞“SCCE”可被“前SCCE(Pro-SCCE)”替代。包含SCCE以及前SCCE的組合物因而也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
SCCE＝天然或重組角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶，選擇性地與其它活性化合物結(jié)合。
q.s.＝總量足至霜劑O/W ％SCCE 0.01-20多乙氧基醚 0.5乳化蠟 5礦物油 4二甲基硅油 1硬脂酸甘油酯 6抗氧化劑 q.s.EDTA 0.1防腐劑q.s.甘由85％ 4丙二醇 7pH調(diào)節(jié)劑 0.01-10水 65-76可變因素的例子抗氧化劑、螯合劑、防腐劑、乳化系統(tǒng)(油相與水相間的比例以及乳化劑的含量和其它相關(guān)賦形劑)。霜劑W/O ％SCCE0.01-20鯨蠟醇 0.5羊毛脂5白礦脂 10礦物油 45抗氧化劑 q.s.EDTA 1pH調(diào)節(jié)劑0.01-10防腐劑 q.s.水15-25可變因素的例子抗氧化劑、螯合劑、防腐劑、乳化系統(tǒng)(油相與水相間的比例以及乳化劑的含量和其它相關(guān)賦形劑)。軟膏 ％SCCE0.01-20羊毛脂 15礦脂 58-68礦物油 15二甲基硅油2抗氧化劑 q.s.可變因素的例子抗氧化劑。搽劑 ％SCCE 0.01-20乳化蠟 4硬脂酸甘油酯 3礦物油15多乙氧基醚 0.6甘油85％ 3丙二醇 5抗氧化劑q.s.EDTA 0.1防腐劑 q.s.水 59-69可變因素的例子抗氧化劑、螯合劑、防腐劑、乳化系統(tǒng)(油相與水相間的比例以及乳化劑的含量和其它相關(guān)賦形劑)。凝膠 ％SCCE 0.01-20三乙醇胺 1-5乙醇 10鯨蠟醇10纖維素膠 5EDTA 0.1防腐劑 q.s.水 59-74可變因素的例子凝膠形成劑、抗氧化劑、螯合劑、防腐劑。溶液，水 ％SCCE0.01-20pH調(diào)節(jié)劑0.01-10鯨蠟醇4丙二醇5防腐劑 q.s.抗氧化劑 q.s.EDTA0.1水37-89可變因素的例子抗氧化劑、螯合劑、防腐劑、refattening劑、濕潤劑。溶液，乙醇 ％SCCE0.01-20pH調(diào)節(jié)劑0.01-10丙二醇5鯨蠟醇3抗氧化劑 q.s.EDTA0.1乙醇 50-95可變因素的例子抗氧化劑、螯合劑、濕潤劑。懸液 ％SCCE 0.01-20Carbomer 0.5纖維素膠 0.5多乙氧基醚 0.1丙二醇 5抗壞血酸0.05鯨蠟醇 4聚山梨醇酯(商品名) q.s.EDTA 0.1pH調(diào)節(jié)劑 0.01-10水 72-80可變因素的例子抗氧化劑、螯合劑、防腐劑、懸浮劑。糊劑 ％SCCE 0.01-20礦脂 45-55氧化鋅40礦物油 5抗氧化劑q.s.可變因素的例子抗氧化劑、糊劑基質(zhì)。帖劑 ％SCCE 0.01-20Cutina LM 70-80肉豆蔻醇 5蓖麻油 2蜂蠟，白色10礦脂，白色 3抗氧化劑q.s.可變因素的例子抗氧化劑、帖劑基質(zhì)。噴霧劑-手動 ％SCCE 0.01-20pH調(diào)節(jié)劑 0.01-10乙醇 30甘油85％ 5丙二醇 5鯨蠟醇 3抗氧化劑q.s.EDTA 0.1防腐劑 q.s.水 22-57可變因素的例子抗氧化劑、螯合劑、防腐劑、refattenig劑、濕潤劑。噴霧劑氣溶膠溶液 ％SCCE0.01-20pH調(diào)節(jié)劑0.01-10異丙基肉豆蔻酸酯 3丙二醇5乙醇 48-92推進劑 q.s.可變因素的例子refattenig劑、濕潤劑。噴霧劑-氣溶膠泡沫％SCCE0.01-20蠟3乙醇 50-55抗氧化劑 q.s.EDTA0.1水20-35推進劑 q.s.可變因素的例子推進劑、抗氧化劑、螯合劑。噴霧劑氣溶膠乳化劑 ％SCCE 0.01-20纖維素衍生物 1-3吐溫60 1.0硬脂酸甘油酯 2.5山梨酸鉀 0.2抗氧化劑 q.s.EDTA 0.1防腐劑q.s.pH調(diào)節(jié)劑 0.01-10水 50-95推進劑q.s.可變因素的例子抗氧化劑、螯合劑、防腐劑、乳化系統(tǒng)(油相與水相間的比例以及乳化劑的含量和相關(guān)的賦形劑)。洗發(fā)香波％SCCE 0.01-20月桂基硫酸鈉40鯨蠟醇 3發(fā)泡劑或調(diào)理素 3氯化鈉 2抗氧化劑 q.s.EDTA 0.1防腐劑q.s.水 43-53可變因素的例子香波基質(zhì)、抗氧化劑、螯合劑、防腐劑、濕潤劑、調(diào)理素。浴用香波 ％SCCE 0.01-20月桂基硫酸鈉 40鯨蠟醇 4發(fā)泡劑或調(diào)理素 3珠光劑10防腐劑 q.s.抗氧化劑q.s.EDTA 0.1水 40-50可變因素的例子香波基質(zhì)、抗氧化劑、螯合劑、防腐劑、添加劑、調(diào)理素。藥皂 ％SCCE 0.01-201-羥乙烷-1，1-二磷酸 0.2甘油 0.8椰油及牛脂鈉皂 88-98添加劑 0.7可變因素的例子濕潤劑、皂基質(zhì)。粉劑％SCCE 0.01-20滑石 85-70高嶺土 6二氧化鈦 2碳酸鈣 8硬脂酸鎂 3玉米或燕麥淀粉5-10可變因素的例子粉劑基質(zhì)、防腐劑、質(zhì)量比。護發(fā)素 ％SCCE 0.01-20鯨蠟醇 2.2烷基三甲基氯化銨 1.25辛基十二烷醇 1檸檬酸 1EDTA 0.1防腐劑q.s.抗氧化劑 q.s.水 ad100可變因素的例子調(diào)理素、防腐劑、螯合劑、抗氧化劑。
以類似的方式制備含有能夠抑制或增強SCCE活性之化合物的局部用組合物。實施例12重組SCCE的橋粒消化活性通過帶狀剝離(tape stripping)至角質(zhì)層的深層而從皮膚取出了含完整橋粒的角質(zhì)細胞，用己烷去掉其鱗屑并分成等分試樣徹底干燥。取角質(zhì)細胞等分試樣(3mg)用1M NaCl于4℃抽提以溶解固有的蛋白酶，然后用溫育緩沖液(0.1M Tris/HCl pH8.0)充分洗滌以從制備物中除去內(nèi)源性蛋白水解活性。溫育過程在有或無10μg重組SCCE的0.1M Tris pH8.0中于37℃進行24小時。通過檢測橋粒標記蛋白質(zhì)desmoglein I(DG I)的濃度來證明橋粒被酶消化的事實。這是通過在8M尿素/2％SDS/β-巰基乙醇緩沖液中抽提而從鱗屑中分離DG I，繼而用伴刀豆球蛋白A親和層析純化所說的DG I糖蛋白。所得的伴刀豆球蛋白A洗脫物用SDS-PAGE進行分級分離，并經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移至PDVF膜上用于免疫印跡。用特異性抗血清鑒定DG I，并用增強的化學(xué)發(fā)光進行檢測。所得結(jié)果如表4所示。
表4對照+rSCCE，10μgDG I(任意單位(arbitrary7950±49924059±2360Units)/mg鱗屑)表4的結(jié)果表明重組rSCCE能在體外測定中降解角質(zhì)層的細胞內(nèi)粘性結(jié)構(gòu)。實施例13抑制劑對重組SCCE活性的影響本實施例研究了抑制劑抑肽酶、抑糜朊酶素和硫酸鋅對rSCCE的S-2586水解活性的影響。實施設(shè)計概要已在實施例3.2.中描述。所得結(jié)果如表5所示。
表5抑制劑 濃度(μM) 活性(％)抑肽酶0 1000.35 51.61.421.25.77.4抑糜朊酶素0 1000.64 74.92.56 3341 1.9ZnSO40 10015.6 50.762.5 19.42505.1如表5所示，抑肽酶、抑糜朊酶素和Zn2+以類似于天然酶的方式抑制重組SCCE的S-2586水解活性。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名SYMBICOM AB(B)街道PO BOX1451(C)城市UMEA(E)國家SWEDEN(F)郵編(ZIP)S-90124(ii)發(fā)明名稱重組角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(iii)序列數(shù)10(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy disk(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOC/MS-DOS(D)軟件patentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度986bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iii)反義無(vi)來源
(A)生物體人類(Homo sapiens)(ix)FEATURE(A)NAME/KEYCDS(B)LOCATION25..786(ix)EFATURE(A)NAME/KEYsig_peptide(B)LOCATION25..90(ix)EFATURE(A)NAME/KEYmat_peptide(B)LOCATION112..783(xi)序列描述SEQ ID NO1GAATTCCGCG GATTTCCGGG CTCC ATG GCA AGA TCC CTT CTC CTG CCC CTG 51Met Ala Arg Ser Leu Leu Leu Pro Leu-29 -25CAG ATC CTA CTG CTA TCC TTA GCC TTG GAA ACT GCA GGA GAA GAA GCC 99Gln Ile Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Glu Thr Ala Gly Glu Glu Ala-20 -15 -10 -5CAG GGT GAC AAG ATT ATT GAT GGC GCC CCA TGT GCA AGA GGC TCC CAC 147Gln Gly Asp Lys Ile Ile Asp Gly Ala Pro Cys Ala Arg Gly Ser His1 5 10CCA TGG CAG GTG GCC CTG CTC AGT GGC AAT CAG CTC CAC TGC GGA GGC 195Pro Trp Gln Val Ala Leu Leu Ser Gly Asn Gln Leu His Cys Gly Gly15 25GTC CTG GTC AAT GAG CGC TGG GTG CTC ACT GCC GCC CAC TGC AAG ATG 243Val Leu Val Asn Glu Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Met30 35 40AAT GAG TAC ACC GTG CAC CTG GGC AGT GAT ACG CTG GGC GAC AGG AGA 291Asn Glu Tyr Thr Val His Leu Gly Ser Asp Thr Leu Gly Asp Arg Arg45 50 55 60GCT CAG AGG ATC AAG GCC TCG AAG TCA TTC CGC CAC CCC GGC TAC TCC 339Ala Gln Arg Ile Lys Ala Ser Lys Ser Phe Arg His Pro Gly Tyr Ser65 70 75ACA CAG ACC CAT GTT AAT GAC CTC ATG CTC GTG AAG CTC AAT AGC CAG387Thr Gln Thr His Val Asn Asp Leu Met Leu Val Lys Leu Asn Ser Gln80 85 90GCC AGG CTG TCA TCC ATG GTG AAG AAA GTC AGG CTG CCC TCC CGC TGC435Ala Arg Leu Ser Ser Met Val Lys Lys Val Arg Leu Pro Ser Arg Cys95 100 105GAA CCC CCT GGA ACC ACC TGT ACT GTC TCC GGC TGG GGC ACT ACC ACG483Glu Pro Pro Gly Thr Thr Cys Thr Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr Thr110 115 120AGC CCA GAT GTG ACC TTT CCC TCT GAC CTC ATG TGC GTG GAT GTC AAG531Ser Pro Asp Val Thr Phe Pro Ser Asp Leu Met Cys Val Asp Val Lys125 130 135 140CTC ATC TCC CCC CAG GAC TGC ACG AAG GTT TAC AAG GAC TTA CTG GAA579Leu Ile Ser Pro Gln Asp Cys Thr Lys Val Tyr Lys Asp Leu Leu Glu145 150 155AAT TCC ATG CTG TGC GCT GGC ATC CCC GAC TCC AAG AAA AAC GCC TGC627Asn Ser Met Leu Cys Ala Gly Ile Pro Asp Ser Lys Lys Asn Ala Cys160 165 170AAT GGT GAC TCA GGG GGA CCG TTG GTG TGC AGA GGT ACC CTG CAA GGT675Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Arg Gly Thr Leu Gln Gly175 180 185CTG GTG TCC TCC GGA ACT TTC CCT TGC GGC CAA CCC AAT GAC CCA GGA723Leu Val Ser Trp Gly Thr Phe Pro Cys Gly Gln Pro Asn Asp Pro Gly190 195 200GTC TAC ACT CAA GTG TGC AAG TTC ACC AAG TGG ATA AAT GAC ACC ATG771Val Tyr Thr Gln Val Cys Lys Phe Thr Lys Trp Ile Asn Asp Thr Met205 210 215 220AAA AAG CAT CGC TAACGCCACA CTGAGTTAAT TAACTGTTGG CTTCCAACAG823Lys Lys His Arg225AAAATGCACA GGAGTGAGGA CGCCGATGAC CTATGAAGTC AAATTTGACT TTACCTTTCC 883TCAAAGATAT ATTTAAACCT CATGCCCTGT TGATAAACCA ATCAAATTGG TAAAGACCTA 943AAACCAAAAC AAATAAAGAA ACACAAAACC CTCAACGGAA TTC986(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度253個氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Arg Ser Leu Leu Leu Pro Leu Gln Ile Leu Leu Leu Ser Leu-29 -25 -20 -15Ala Leu Glu Thr Ala Gly Glu Glu Ala Gln Gly Asp Lys Ile Ile Asp-10 -5 1Gly Ala Pro Cys Ala Arg Gly Ser His pro Trp Gln Val Ala Leu Leu5 10 15Ser Gly Asn Gln Leu His Cys Gly Gly Val Leu Val Asn Glu Arg Trp20 25 30 35Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Met Asn Glu Tyr Thr Val His Leu40 45 50Gly Ser Asp Thr Leu Gly Asp Arg Arg Ala Gln Arg Ile Lys Ala Ser55 60 65Lys Ser Phe Arg His Pro Gly Tyr Ser Thr Gln Thr His Val Asn Asn70 75 80Leu Met Leu Val Lys Leu Asn Ser Gln Ala Arg Leu Ser Ser Met Val85 90 95Lys Lys Val Arg Leu Pro Ser Arg Cys Glu Pro Pro Gly Thr Thr Cys100 105 110 115Thr Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr Thr Ser Pro Asp Val Thr Phe Pro120 125 130Ser Asp Leu Met Cys Val Asp Val Lys Leu Ile Ser Pro Gln Asp Cys135 140 145Thr Lys Val Tyr Lys Asp Leu Leu Glu Asn Ser Met Leu Cys Ala Gly150 155 160Ile Pro Asp Ser Lys Lys Asn Ala Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro165 170 175Leu Val Cys Arg Gly Thr Leu Gln Gly Leu Val Ser Trp Gly Thr Phe180 185 190 195Pro Cys Gly Gln Pro Asn Asp Pro Gly Val Tyr Thr Gln Val Cys Lys200 205 210Phe Thr Lys Trp Ile Asn Asp Thr Met Lys Lys His Arg215 220(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(v)片段類型N末端(vi)來源(A)生物體人類(Homo sapiens)(xi)序列描述SEQ ID NO3Ile Ile Asp Gly Ala Pro Cys Ala Cys Gly Ser Xaa Pro Xaa Gln Val1 5 10 15Ala Leu Leu Ser Gly Asn Gln Leu20(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度17bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4ATHATHGAYG GNGCNCC 17(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GTGGCGACGA CTCCTGGAGC C21(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO6ACACCAGACC AACTGGTAAT G21(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度21bp
(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO7TGGGTGGGAG CCTCTTGCAC A 21(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度42bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO8CGTGGATCCA TCGAAGGTCG TATTATTGAT GGCGCCCCAT GT 42(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度42bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9CGTGGATCCA TCGAAGGTCG TTTGGAAACT GCAGGAGAAG AA 42(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10AATTGTGGAA GCTTCCAC18
權(quán)利要求
1.編碼具有SCCE活性之多肽的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列，編碼具有SEQ ID NO2所示之氨基酸序列的多肽或其類似物或變異體，例如，基本上含有SEQID NO1所示之序列的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的核苷酸序列，編碼含有氨基酸序列SEQ ID NO2之亞序列的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核苷酸序列，編碼含有SEQ ID NO2之氨基酸序列-7-224或1-224的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列，在嚴格雜交條件下，與核苷酸序列SEQ ID NO1或其部分雜交。
6.含有SEQ ID NO1所示之氨基酸序列或其類似物或亞序列的核苷酸序列(1)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有至少90％的同源性，和/或(2)編碼多肽，該多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列有至少80％的同源性，和/或(3)編碼由通過雜交瘤細胞系TE4b或雜交瘤細胞系TE9b生產(chǎn)的單克隆抗體結(jié)合的多肽，所述的細胞系均根據(jù)布達佩斯條約于1993年6月18日保藏于ECACC，保藏號分別為ECACC 93061817和ECACC93061816和/或(4)編碼由抗天然SCCE產(chǎn)生的多克隆抗血清結(jié)合的多肽，所述的天然SCCE已從分離的足底角層細胞的提取物中純化出。
7.含有權(quán)利要求1-6任一核苷酸序列的表達系統(tǒng)，例如攜帶并能夠介導(dǎo)權(quán)利要求1-6中任一中之核苷酸序列表達的可復(fù)制表達載體。
8.命名為pS507的可復(fù)制表達載體，已根據(jù)布達佩斯條約將其于1993年5月11日保藏于the collection of Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH(DSM)，保藏號為DSM8282，和表達核苷酸序列的表達載體，所述的核苷酸序列不同于所述的保藏表達載體中的核苷酸序列，但編碼具有SCCE活性的相同多肽或其類似物或變異體。
9.命名為pS500的質(zhì)粒，該質(zhì)粒已根據(jù)布達佩斯條約于1993年5月11日保藏于the collection of Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkuturen GmbH(DSM)，保藏號為DSM8281，和含有核苷酸序列的質(zhì)粒，所述核苷酸序列不同于SEQ IDNO1中所示的核苷酸序列，但編碼SEQ ID NO2所示的多肽或其類似物或變異體，或在嚴格條件下，與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或其部分雜交。
10.攜帶權(quán)利要求7之表達系統(tǒng)的非人生物體例如微生物，如細菌，如E.coli.，酵母，原生動物或得自多細胞生物例如真菌的細胞，昆蟲細胞，植物細胞，哺乳動物細胞或細胞系。
11.含有氨基酸序列SEQ ID NO2或具有SCCE活性的其類似物或變異體的多肽，例如含有氨基酸序列SEQ ID NO2之亞序列的重組多肽。
12.含有SEQ ID NO2中氨基酸序列-7-224或SEQ IDNO2中氨基酸序列1-224的多肽。
13.含有氨基酸序列的多肽，其中連續(xù)排列的20個氨基酸與選自SEQ ID NO2所示氨基酸序列的相同長度的氨基酸排列有至少80％的同源性。
14.基本上為純化形式的權(quán)利要求11-13的任一多肽。
15.生產(chǎn)權(quán)利要求11-13任一多肽的方法，含有下列步驟(a)將權(quán)利要求1-6的任一核苷酸序列插入表達載體，含有下列步驟(b)用步驟(a)中產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化適宜的宿主生物體，(c)在適宜表達多肽的條件下培養(yǎng)步驟(b)中產(chǎn)生的宿主生物，(d)收集多肽，和(e)可選擇的使多肽進行翻譯后修飾。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中通過包括一個或多個親和層析的步驟和/或其它層析和電泳方法分離所生產(chǎn)的多肽，所述的親和層析使用固定的天然或重組SCCE多肽或與所述多肽有反應(yīng)性的抗體。
17.含有權(quán)利要求11-14任一多肽的藥物組合物。
18.含有權(quán)利要求11-14任一多肽的化妝品或皮膚護理組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求17-18的組合物是適于局部施用的形式，例如，乳液，軟膏，洗劑，擦劑，凝膠，溶液，懸浮液，糊劑，帖劑，噴霧劑，香波，皂，頭發(fā)護理劑或粉末。
20.權(quán)利要求11-14的多肽在治療預(yù)防痤瘡，干皮病或其它角化過度病例如胼胝和毛發(fā)角化病中的用途。
21.權(quán)利要求11-14的多肽制備藥物組合物的用途，所述的藥物組合物用于治療或預(yù)防各種鱗癬，痤瘡，牛皮癬或其它炎性皮膚病例如濕疹。
22.治療和/或預(yù)防各種鱗癬，痤瘡，牛皮癬或其它炎性皮膚病例如濕疹的方法，該方法包括給需要的患者施用治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求11-14的任一多肽。
23.對天然SCCE的酶活性有抑制作用的化合物的用途，所述的化合物用于制備治療或預(yù)防自身免疫性皰瘡病或皮膚棘層松解病例如，家族性天皰瘡和毛囊角化病的藥物組合物。
24.治療和/或預(yù)防自身免疫性天皰瘡病或皮膚棘層松解病例如，家族性天皰瘡和毛囊角化病的方法，該方法包括給需要的患者施用治療或預(yù)防有效量的化合物，所述化合物對天然SCCE的酶活性有抑制作用。
25.鑒別對天然SCCE酶活性有作用的化合物的方法，包括使用權(quán)利要求11-14的任一多肽。
26.根據(jù)權(quán)利要求25鑒別化合物的方法，所述化合物對天然SCCE的酶活性有抑制作用。
27.根據(jù)權(quán)利要求26鑒別化合物的方法，所述化合物能夠增強天然或重組SCCE的酶活性。
28.鑒別化合物的方法，包括使用權(quán)利要求11-14的任一多肽，所述化合物能夠?qū)CCE的酶原形式轉(zhuǎn)化成活性SCCE。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO2或者具有如本申請所定義之SCCE活性的其類似物或變異體的多肽，例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO2之亞序列的多肽。此外，本發(fā)明涉及編碼具有SCCE活性之多肽的核苷酸序列以及含有所述核苷酸序列的表達系統(tǒng)，表達載體，質(zhì)粒和非人生物體。本發(fā)明的重要方面涉及含有其SCCE活性之多肽的藥物、化妝品和皮膚護理成分，以及該多肽的用途，所述多肽用于治療或預(yù)防各種疾病如痤瘡、干皮病或其它角化過度性疾病，如胼胝和毛發(fā)角化病以及各種鱗癬、牛皮癬、和其他炎性皮膚病如濕疹。此外，本發(fā)明涉及對天然SCCE之酶活性有抑制作用的化合物的用途，該化合物用于制備治療或預(yù)防自身免疫性天皰瘡疾病或皮膚棘層松解性疾病如家族性天皰瘡和毛囊角化病的藥物成分。
文檔編號A61K8/00GK1128047SQ94192960
公開日1996年7月31日 申請日期1994年6月20日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月18日
發(fā)明者T·艾格魯, L·漢森 申請人:阿斯特拉公司