專(zhuān)利名稱(chēng)：一種產(chǎn)乳酸工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)乳酸工程菌及其構(gòu)建方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及 一種產(chǎn)乳酸工程菌的應(yīng)用，特別是發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
作為一種重要的平臺(tái)化合物，L-乳酸的需求隨著石油資源的枯竭而不斷增加。 在L-乳酸合成工藝中，以生物質(zhì)為原料采用微生物發(fā)酵(乳酸菌和霉菌)的工藝具有廣 泛的應(yīng)用。然而由于乳酸菌營(yíng)養(yǎng)需求高和難以耐受惡劣環(huán)境脅迫，以及霉菌易形成菌絲 團(tuán)和副產(chǎn)物較多等原因，限制了 L-乳酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。Saccharomy cescerevisiae作 為模式微生物具有(1)作為單細(xì)胞微生物，易利用簡(jiǎn)單培養(yǎng)基快速生長(zhǎng)；(2)存在單倍體 與雙倍體兩種形式而易于基因工程改造和篩選；(3)可通過(guò)多種代謝工程策略進(jìn)行生長(zhǎng)或 代謝表型改造；(4)具有豐富的單倍體和二倍體單基因缺失菌株；(5)具有豐富的生理功 能信息(SGD)和組學(xué)分析技術(shù)等優(yōu)點(diǎn)，為L(zhǎng)-乳酸的微生物制造提供了菌株平臺(tái)。但由于 S. cerevisiae自身的基因特性決定其不能過(guò)量合成L-乳酸，為此需要借助代謝工程策略， 引入外源乳酸脫氫酶(LDH)基因，同時(shí)沉默PDC1，使丙酮酸節(jié)點(diǎn)的代謝流流向L-乳酸途徑， 同時(shí)降低副產(chǎn)物乙醇的積累以提高乳酸的轉(zhuǎn)化率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種產(chǎn)乳酸工程菌。所述產(chǎn)乳酸工程菌基因組中攜帶外源乳酸脫氫酶(LDH)基因且沉默了丙酮酸脫 羧酶(PDCl)基因。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種上述產(chǎn)乳酸工程菌的構(gòu)建方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案為1)克降 Bovine LDH 基因；2)克隆PDCl基因上下游序列；3)融合PCR構(gòu)建兩端為PDCl基因的上下游序列，中間為L(zhǎng)DH基因的同源重組片 段；4)將步驟3)得到的同源重組片段導(dǎo)入受體菌；5)驗(yàn)證所述工程菌。步驟4)中所述受體菌為酵母菌。 所述酵母菌為低產(chǎn)乳酸，高產(chǎn)乙醇酵母菌。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種所述產(chǎn)乳酸工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳酸 中的應(yīng)用。發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的工藝為30°C、200r/min搖瓶培養(yǎng)所述工程菌至對(duì)數(shù)中期，以8% 接種量接種入發(fā)酵罐；發(fā)酵參數(shù)為PH 5. 5，通氣量1. 5L/min，溶氧50%。本發(fā)明利用同源重組的方法，獲得一株高產(chǎn)乳酸工程菌。用本發(fā)明提供的工程菌生產(chǎn)乳酸，可以突破乳酸菌及霉菌生產(chǎn)的瓶頸，簡(jiǎn)單易行，發(fā)酵IOOh后乳酸產(chǎn)量達(dá)15g/L。


圖lpY13TEFl_LDH物理圖譜及其菌落PCR驗(yàn)證A :pY13TEFl_LDH 物理圖譜B :pY13TEFI-LDH 菌落 PCR 驗(yàn)證M :Market 1-7 :pY13TEFl_LDH陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子 8 陰性對(duì)照 9 陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D2同源重組片段PDCl啟動(dòng)子-LDH-CYCl-HiS3-PDC1下游序列的構(gòu)建(A)融合PCR示意圖；(B) =PDCl啟動(dòng)子、LDH-CYCl_His3及PDCl下游序列的獨(dú)立 擴(kuò)增電泳圖· M =DNA marker ；1 =PDCl 下游序列；2 =LDH-CYCI-His3 ；3 =PDCl 啟動(dòng)子· ； (C) LDH整合表達(dá)片段電泳圖.M =DNA marker ；1 =LDH整合表達(dá)片段圖3同源重組表達(dá)示意4產(chǎn)乳酸工程菌驗(yàn)證㈧PCR驗(yàn)證引物示意圖；(B) CEN. PK2-1C 和工程菌 CENPK2_1C[LDH]的 PCR 驗(yàn)證電泳圖.Ml :lkb markers ； 1 引物 YZ5 和 YZ6 以 CEN. PK2-1C 為模板；2 引物 YZ5 和 YZ6 以 CENPK2_1C[LDH]為模板；3 引物YZ4和YZ7以CEN. PK2-1C為模板；4 引物YZ4和YZ7以工程菌為模板；5 引物YZ3和 YZ7以CEN. PK2-1C為模板；6 引物YZ3和YZ7以工程菌為模板；7 引物YZl和YZ2以CEN. PK2-1C為模板；8 引物YZl和YZ2以工程菌為模板。圖5乳酸產(chǎn)量對(duì)比圖6乙醇產(chǎn)量對(duì)比
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下列實(shí)施例用于說(shuō)明目的而非用于限制本 發(fā)明范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照常見(jiàn)的分子克降手冊(cè) 所述的條件進(jìn)行操作。實(shí)施例1產(chǎn)乳酸工程菌的構(gòu)建1、克隆 Bovine LDH 基因L^l M 14 ρLAZ 10(Bianchi,2010. Efficient Homolactic Fermentation by Kluyveromyces IactisStrains Defective in Pyruvate Utilization and Transformed with the Heterologous LDH Gene. ApplEnviron Microbiol, 67 (12) :5621_5625.)為模 板，PCR擴(kuò)增得到LDH片段。采用帶有XbaI和ClaI酶切位點(diǎn)的LDH-F和LDH-R為引物，用 相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)LDH片段和質(zhì)粒pY13TEFl (購(gòu)自德?tīng)枌毶锟萍加邢薰?進(jìn)行雙酶切、 純化、連接構(gòu)建質(zhì)粒pY13TEFl-LDH(圖1A)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞中后，涂布 帶有氨芐抗性的LB平板，經(jīng)37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證，如圖1B。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子 接種液體LB培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒、酶切、驗(yàn)證并測(cè)序確認(rèn)質(zhì)粒PY13TEF1-LDH已構(gòu)建成功。2、克隆PDCl基因上下游序列如圖2A 所述，采用試劑盒 G-biosciences(St Louis,Mo, USA)提取 S. cerevisiae CEN. PK2-lC(MATa ura3-52 leu2_3，112trpl_289 his3 Δ MAL2_8cSUC2，購(gòu)于 EUR0SCARF 菌種保藏中心)基因組并以其為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到PDCl Promoter片段，引物為PDCl Promote-F和PDClPromoter-R。同樣方法獲得PDCl 3'末端片段，引物為PDCl 3' End-F 和 PDCl 3' End-R(圖 2B)。3、構(gòu)建同源重組片段PDCl啟動(dòng)子-LDH-CYC1-His3-PDC1下游序列以質(zhì)粒pY13TEFl-LDH 為模板，PCR 擴(kuò)增得到 LDH-CYC1 terminator-His3 片段， 引物為L(zhǎng)-C-H-F和L-C-H-R。將上述三種片段進(jìn)行純化并用1 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行 驗(yàn)證，結(jié)果如圖2B所示。按等摩爾的比例將3種片段進(jìn)行混合(總濃度> 800ng)，加入 由Pyrobest DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2組成的混合液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?4°C， 30Sec ；56°C, Imin ；72°C,4min ；進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后以該輪PCR產(chǎn)物為模板，引物為PDCl Promoter-F, PDC13' End-R,按照相同程序進(jìn)行28個(gè)循環(huán)后得到整合表達(dá)片段，如圖2C所示。表ILDH整合表達(dá)片段構(gòu)建所需引物及其序列 4、構(gòu)建產(chǎn)乳酸工程菌采用LiAc轉(zhuǎn)化法將經(jīng)過(guò)凝膠回收試劑盒純化的整合片段轉(zhuǎn)化S. cerevisiae CEN. PK2-1C，按照雙交換的原理，整合片段中與S. cerevisiae基因組同源的片段在PDCl位 點(diǎn)發(fā)生整合，達(dá)到沉默PDCl并整合表達(dá)LDH的目的，其中LDH受PDCl啟動(dòng)子的調(diào)控(圖 3)。以質(zhì)粒和水做陰陽(yáng)性對(duì)照，轉(zhuǎn)化液經(jīng)后培養(yǎng)后，涂布SC組氨酸缺陷篩選培養(yǎng)基平板，放 置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3至5d后長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，對(duì)照則無(wú)轉(zhuǎn)化子。挑取其中較大的轉(zhuǎn) 化子劃線于新的組氨酸篩選平板中以進(jìn)行傳代培養(yǎng)，重復(fù)同樣操作3次。篩選培養(yǎng)基組成為(g/L)葡萄糖20，YNB (without NH4SO4) 1. 7，硫酸銨4，所需氨 基酸適量。5、驗(yàn)證產(chǎn)乳酸工程菌針對(duì)融合表達(dá)片段的特點(diǎn)，采用表2的序列構(gòu)建如圖4A所示的驗(yàn)證引物。針對(duì)整合后的基因組設(shè)計(jì)引物YZ1、YZ2和YZ5、YZ6，采用原菌基因組和轉(zhuǎn)化子的基因組為模 板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在轉(zhuǎn)化子基因組中獲得大小分別為897bp和1179bp的條帶。類(lèi)似地，以 原菌基因組為模板設(shè)計(jì)引物YZ3、YZ7，擴(kuò)增得到544bp的條帶。若控制延伸時(shí)間為lmin， 僅以原菌基因組為模板設(shè)計(jì)引物YZ4、YZ7擴(kuò)增得到1152bp的條帶，而以整合基因組為 模板則無(wú)法獲得類(lèi)似片段。電泳結(jié)果如圖4B所示。驗(yàn)證正確的產(chǎn)乳酸工程菌命名為 S. cerevisiaeCENPK2-lC[LDH]。表2整合表達(dá)驗(yàn)證引物 實(shí)施例2發(fā)酵生產(chǎn)乳酸從新鮮斜面接一環(huán)所述產(chǎn)乳酸工程菌到種子培養(yǎng)基(80mL SC/250mL錐形瓶)，于 30°C、200r/min搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(24h)后，以8%接種量(ν/ν)接入裝有700mL YNB發(fā) 酵培養(yǎng)基的1. 3L發(fā)酵罐中。發(fā)酵過(guò)程中以4mol/L的NaOH維持pH保持5. 5，通氣量為1. 5L/ min，溶氧控制為50%。發(fā)酵IOOh后，乳酸產(chǎn)量達(dá)15g/L。種子培養(yǎng)基成分為(g/L)葡萄糖20，YNB (WithoutNH4SO4) 1. 7，硫酸銨4，所需氨基
酸適量。YNB 發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L) :CaC034. 5, YNB (without NH4SO4) 1. 7，尿素 1，乙醇 5， 葡萄糖70，所需氨基酸適量。實(shí)施例3L-乳酸、乙醇及葡萄糖的檢測(cè)L-乳酸和乙醇濃度的測(cè)定采用Agilent A1200高效液相色譜(HPLC)儀測(cè)定。色譜條件色譜柱AminexHPX-87H (Bio-Rad)流動(dòng)相0·OOSmoVr1H2SO4流速0· 6mL/min_1柱溫35°C進(jìn)樣量5yL檢測(cè)器示差折光樣品制備5mL發(fā)酵液在IOOOOrpm下離心lOmin，取上清液移入試管中以備測(cè) L-乳酸、乙醇和殘余葡糖糖時(shí)用。測(cè)L-乳酸時(shí)，取ImL上清液移入IOmL容量瓶中，去離子
6水定容至刻線，經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后，濾液供液相色譜分析用。結(jié)果表明(1)本發(fā)明構(gòu)建的工程菌積累15g/L的L-乳酸，而出發(fā)菌株CENPK2-1C 的發(fā)酵液中未檢測(cè)出L-乳酸(圖5)。表明，經(jīng)外源LDH的導(dǎo)入使S. cerevisiae具有積 累L-乳酸的代謝功能；(2)與出發(fā)菌株比較，本發(fā)明構(gòu)建的工程菌乙醇產(chǎn)量下降了 46% (16. 2g/L)(圖6)，這是PDCl缺失和LDH競(jìng)爭(zhēng)的雙重結(jié)果。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種產(chǎn)乳酸工程菌，其特征在于基因組中攜帶外源乳酸脫氫酶(LDH)基因且沉默了丙酮酸脫羧酶(PDC1)基因。
2.權(quán)利要求1所述產(chǎn)乳酸工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟1)克隆Bovine的LDH基因；2)克降PDCl基因的上下游序列；3)融合PCR構(gòu)建兩端為PDCl基因的上下游序列，中間為L(zhǎng)DH基因的同源重組片段；4)將步驟3)得到的同源重組片段導(dǎo)入受體菌；5)驗(yàn)證所述工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟4)中所述受體菌為酵母菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述酵母菌為低產(chǎn)乳酸、高產(chǎn)乙醇的 釀酒酵母。
5.權(quán)利要求1所述產(chǎn)乳酸工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳酸中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵生產(chǎn)的工藝為30°C、200r/min搖瓶 培養(yǎng)所述工程菌至對(duì)數(shù)中期，以8%接種量接種入發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)100小時(shí)；發(fā)酵參數(shù)為 pH5. 5，通氣量 1. 5L/min，溶氧 50%。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種產(chǎn)乳酸工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供的基因工程菌株通過(guò)同源重組的方法將來(lái)源于Bovine的乳酸脫氫酶(LDH)基因片段整合入S.cerevisiae基因組中，同沉默了菌株自身丙酮酸脫羧酶(PDC1)基因。將構(gòu)建得到的工程株用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，發(fā)酵100h后，乳酸產(chǎn)量達(dá)15g/L，乙醇產(chǎn)量比出發(fā)菌株下降了45％，為16.2g/L，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P7/56GK101886048SQ201010232730
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月21日
發(fā)明者劉立明, 趙亮亮, 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)