專利名稱：禾谷鐮孢菌對多菌靈的中等抗性水平菌株的分子檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種禾谷鐮孢菌對多菌靈的中等抗藥性水平菌株的分子檢測方法，可 用于監(jiān)測苯并咪唑類殺菌劑(多菌靈)抗性禾谷鐮孢菌群體發(fā)展動態(tài)，進行抗藥性小麥赤 霉病的流行預(yù)測。
背景技術(shù)：
小麥赤霉病是由禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum Schwabe引起的一種世界性 病害，嚴重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。長期以來采用苯并咪唑類殺菌劑或以這類藥劑為主的 復(fù)配劑進行化學(xué)防治。苯并咪唑類殺菌劑包括多菌靈、苯菌靈、噻菌靈、硫菌靈等。作為 一類高效、廣譜內(nèi)吸性殺菌劑在生產(chǎn)上應(yīng)用，解決了保護性殺菌劑的環(huán)境毒性問題，提高 了人類控制該病害的能力。苯并咪唑類殺菌劑具有相同的抗菌譜和抗菌機制，他們也具 有相同的抗藥性機制，相互之間存在正交互抗藥性。由于這類藥劑的高度?；裕饔梦?點單一，加上施用頻率高，多年使用后許多植物病原真菌群體中出現(xiàn)了抗藥性優(yōu)勢生理小 種，使藥劑防治效果下降或完全失去效果。經(jīng)過10多年的研究，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)殺菌劑實 驗室發(fā)現(xiàn)小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性菌株主要是由于禾谷鐮孢菌3 2_微管蛋白基因 (FGSG_06611. 3)突變造成，該基因編碼第167位和第200位氨基酸密碼子的突變分別為 TTT(Phe) — TAT (Tyr)和TTC(Phe) — TAC(Tyr)。第167位或者第200位氨基酸密碼子的 突變均可引起禾谷鐮孢菌對多菌靈中等抗藥性的產(chǎn)生，其中第167位突變占所有抗藥性突 變類型總量的97%以上。成為病原菌產(chǎn)生田間抗藥性的主要原因。由于病原菌在自然界的數(shù)量巨大，抗藥性個體在群體中的比例達到3% 5%時， 即可引起抗藥性病害流行，使藥劑防治失敗。傳統(tǒng)的檢測方法需要分離培養(yǎng)病原菌，然后在 含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再根據(jù)藥劑對菌絲生長的效應(yīng)鑒別抗藥性。本發(fā)明在抗藥性機制研究 基礎(chǔ)上，根據(jù)基因點突變類型應(yīng)用PIRA-PCR技術(shù)檢測病原真菌對多菌靈等苯并咪唑類殺 菌劑的抗藥性，則能快速、準確檢測樣本。PIRA-PCR技術(shù)較等位基因特異性PCR(ASO-PCR) 更為準確，不會有假陽性結(jié)果。它具有(1)快速、準確檢測出禾谷鐮孢菌群體中的中等抗性 菌株；(2)準確鑒定菌株的抗藥性基因型；(3)耗時短，僅需5 8小時。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供禾谷鐮孢菌對多菌靈產(chǎn)生中抗水平菌株一種快 速診斷和檢測方法?，F(xiàn)有技術(shù)首次利用PIRA-PCR，根據(jù)抗性菌株發(fā)生突變的特點，結(jié)合了巢 式PCR技術(shù)成功實現(xiàn)了快速、準確地對小麥赤霉病菌抗多菌靈中抗群體的分子檢測，檢測 準確率達到95%以上，對及時采取有效措施控制當(dāng)季抗藥性病害流行，具有實用價值。技術(shù)方案禾谷鐮孢菌抗多菌靈的中抗菌株微管蛋白基因(reSG_06611.3)， 其第167位氨基酸密碼子發(fā)生點突變TTT (Phe) — TAT (Tyr)或第200位氨基酸密碼子發(fā)生 點突變 TTC(Phe) — TAC(Tyr)。一種禾谷鐮孢菌對多菌靈產(chǎn)生中抗水平菌株檢測方法，共分三步
第一步采用常規(guī)的苯酚 氯仿 異戊醇法，分別提取待測樣品的核基因組DNA。第二步運用內(nèi)外引物對，進行巢式PCR反應(yīng)，獲得164bp的目標片段。用于PIRA-PCR技術(shù)引物具有特異性，該引物對能為-微管蛋白167位未突 變菌株人為引入Hindlll酶切識別位點；巢式PCR技術(shù)的設(shè)計用于提高反應(yīng)效率。設(shè) 計的依據(jù)是抗藥性菌株在0 2-微管蛋白第167位由Phe (TTT) — Tyr (TAT)，200位由 Phe (TTC) — Tyr (TAC)。①擴增禾谷鐮孢菌日2-微管蛋白基因片斷的外引物對上游引物NoF 5' -AAGCCATTGATGTTGTTCG-3‘下游引物NoR 5' -CATGACGGTAGAAATCAGGTAG-3‘②擴增含人為引入錯配堿基日2-微管蛋白基因片段的內(nèi)引物對上游引物Hind3F 5' -CGATCGCATAATGGC 因 A @ CT-3‘下游引物Hind3R 5' -GGGTCCTCTCGTAGATATCGTACA-3‘巢式PCR反應(yīng)體系及其擴增程序(1)外引物擴增反應(yīng)體系PCR buffer (10 X)2. 5 u LdNTP (2. 5mM each)2 u LMgCl2(25mM)1. 5u LNoF(lOuM)0. 5 u LNoR(lOuM)0. 5 u LdH20 (滅菌蒸餾水)16. 8 ii LTaq (5U/ u L)0. 2 u LDNA 模板l.OiiL_總體積25 UL擴增條件預(yù)變性94°C5min|變性94°C15s退火58°C30s延伸72°C30s35個循環(huán)|延伸72°C5min(2)內(nèi)引物擴增反應(yīng)體系PCR buffer (10 X)2. 5 u LdNTP (2. 5mM each)2 u LMgCl2(25mM)1. 5u L
NoF(10 tl M)0．5 tl L
NoR(10 tl M)0．5 tl L
dH，0(滅菌蒸餾水)16．8 u L
Taq(5u／tl L)0．2 tl L
DNA模板*1．0 u L
總體積25 u L
*DNA模版為外引物擴增產(chǎn)物稀釋50一100倍量濃度
擴增條件
預(yù)變性94℃5min
J
變性94℃15s
退火56℃30s
延伸72℃30s
35個循環(huán)
J
延伸72℃5min
第三步將巢式PCR獲得的目的條帶(164bp)限制性內(nèi)切酶HindIII和／aaI(／sp4CI)分別酶切，根據(jù)PIRA—PCR原理示意圖，從酶切產(chǎn)物電泳圖譜(3％瓊脂糖凝膠)可以準確鑒定中等抗性菌株基因型，并以此判斷菌株抗性水平。
(1)HindIII酶切體系
10×Buffer R2 tl L
HindIII(10unit／tl L)l u L
PCR產(chǎn)彩08 u L
dH，0(滅菌蒸餾水)9 u L
總體積20 u L
37℃孵育l一3小時完全酶切
(2)／aaI酶切體系
10×Buffer／ango2 tl L
／aaI(10unit／tl L)l u L
PCR產(chǎn)彩08 u L
dH，0(滅菌蒸餾水)9 u L
總體積20 u L
65℃孵育l一3小時完全酶切C0077] 有益效果本發(fā)明禾谷鐮孢菌抗多菌靈的中抗菌株分子檢測方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點。
1．目前國內(nèi)外研究單位均采用菌絲生長抑制法檢測禾谷鐮孢菌抗藥性，它涉及采樣、分離培養(yǎng)和室內(nèi)大量的藥劑敏感性測定實驗，至少兩周，周期較長。目前尚無成熟的抗 多菌靈小麥赤霉病菌分子檢測技術(shù)，因此，PIRA-PCR技術(shù)的研究應(yīng)用填補了這一空白，能夠 在發(fā)病前期進行檢測，對及時、合理地指導(dǎo)科學(xué)用藥，有效治理抗藥性，以及降低成本和減 少環(huán)境污染具有現(xiàn)實意義。2.在所測定的50株小麥赤霉病菌田間菌株中，PIRA-PCR技術(shù)抗性檢測結(jié)果與傳 統(tǒng)的菌落直徑法測定結(jié)果完全一致(表2)，且能夠100%準確鑒定出所測樣品的抗藥性基 因型(表3)。
四

圖1PCR巢式擴增電泳結(jié)果
圖2PIRA-PCR技術(shù)示意3限制性內(nèi)切酶酶切片段電泳結(jié)果
五具體實施例方式實施例1、適用于PIRA-PCR技術(shù)中的退火溫度PCR反應(yīng)過程中，退火溫度Tm值是反應(yīng)正常進行與特異性的重要保證。如果退火 溫度過低就會產(chǎn)生非特異性擴增。我們參考內(nèi)外引物的Tm值，從50°C到65°C進行梯度PCR， 分別確定了外引物最佳退火溫度為58°C，內(nèi)引物最佳退火溫度為56°C。實施例2、檢測已知抗性水平和基因型菌株提取菌株ZF43，ZF52，NT_7(表1)基因組DNA，用內(nèi)外引物擴增，得到擴增圖譜(圖
1)。擴增產(chǎn)物分別用Hindlll和Taal酶切，酶切圖譜見圖3，檢測結(jié)果與理論結(jié)果一致(圖2)。實施例3、江蘇田間菌株檢測從江蘇省小麥田間隨機采取50個小麥赤霉菌株，用傳統(tǒng)菌落直徑法和PIRA-PCR 分別檢測對多菌靈抗藥性，并根據(jù)PIRA-PCR檢測結(jié)果，從各種基因型菌株分別隨機抽取3 個進行測序驗證。結(jié)果由表2所示，兩種檢測抗藥性方法的結(jié)果完全一致。同傳統(tǒng)的菌落直徑法比 較，引物引入限制性內(nèi)切酶分析聚合酶鏈式反應(yīng)(PIRA-PCR)只需要幾個小時就可完成檢 測，操作簡便、快捷，準確性高；還能對突變位點SNP分析，準確分型。而傳統(tǒng)的菌落直徑法 從分離培養(yǎng)到檢測需要兩周左右的時間。PIRA-PCR分型結(jié)果如表3所示，從各基因型菌株 中分別隨機抽取三個菌株測序，測序結(jié)果與酶切片段電泳分型結(jié)果完全一致。表1本研究中小麥赤霉病菌來源、對多菌靈抗藥性表型及抗藥性表型與0 2-微管 蛋白基因突變的關(guān)系
權(quán)利要求
禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)對多菌靈的中等抗性水平菌株的分子檢測方法，其特征在于采用PIRA PCR(Primer introduced restriction analysis PCR)技術(shù)檢測禾谷鐮孢菌群體中存在的對苯并咪唑類殺菌劑(多菌靈)的中等抗性菌株，并以此計算抗性比例。一種禾谷鐮孢菌對多菌靈產(chǎn)生中等抗性水平菌株的分子檢測方法，共分三步第一步采用常規(guī)的苯酚·氯仿·異戊醇法，分別提取待測樣品的核基因組DNA。第二步運用內(nèi)外引物對，進行巢式PCR反應(yīng)，獲得164bp的目標片段。巢式PCR反應(yīng)體系及其擴增程序(1)外引物擴增反應(yīng)體系PCR buffer(10×) 2.5μLdNTP(2.5mM each) 2μLMgCl2(25mM) 1.5μLNoF(10μM) 0.5μLNoR(10μM) 0.5μLdH2O(滅菌蒸餾水) 16.8μLTaq(5U/μL) 0.2μLDNA模板 1.0μL總體積 25μL擴增條件預(yù)變性94℃ 5min↓變性94℃ 15s退火58℃ 30s延伸72℃ 30s35個循環(huán)↓延伸72℃ 5min(2)內(nèi)引物擴增反應(yīng)體系PCR buffer(10×) 2.5μLdNTP(2.5mM each) 2μLMgCl2(25mM) 1.5μLNoF(10μM)0.5μLNoR(10μM)0.5μLdH2O(滅菌蒸餾水) 16.8μLTaq(5U/μL) 0.2μLDNA模板* 1.0μL 總體積25μL*DNA模版為外引物擴增產(chǎn)物稀釋50～100倍量濃度擴增條件預(yù)變性94℃ 5min ↓變性94℃15s退火56℃30s延伸72℃30s35個循環(huán) ↓延伸72℃5min第三步將巢式PCR獲得的目的條帶(164bp)限制性內(nèi)切酶HindIII和TaaI(Tsp4CI)分別酶切，從酶切產(chǎn)物電泳圖譜(3％瓊脂糖凝膠)可以準確鑒定中等抗性菌株基因型，并以此判斷菌株抗性水平。(1)HindIII酶切體系10×Buffer R 2μLHindIII(10unit/μL) 1μLPCR產(chǎn)物 8μLdH2O(滅菌蒸餾水) 9μL 總體積20μL37℃孵育1～3小時完全酶切(2)TaaI酶切體系10×Buffer Tango 2μLTaaI(10unit/μL) 1μLPCR產(chǎn)物 8μLdH2O(滅菌蒸餾水) 9μL 總體積20μL65℃孵育1～3小時完全酶切。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，禾谷鐮孢菌對多菌靈產(chǎn)生中抗水平菌株的檢測技術(shù)其特征在 于用于PIRA-PCR反應(yīng)的引物引入了 Hindlll酶切識別位點特異性地識別抗藥性菌株在 3 2-微管蛋白基因編碼第167位氨基酸的密碼子由TTT(Phe) — TAT(Tyr)，和第200位密 碼子由TTC(Phe) — TAC(Tyr)的突變；巢式PCR技術(shù)的設(shè)計用于提高反應(yīng)效率。①擴增禾谷鐮孢菌日2-微管蛋白基因片斷的外引物對 上游引物 NoF 5' -AAGCCATTGATGTTGTTCG-3‘下游引物 NoR 5' -CATGACGGTAGAAATCAGGTAG-3‘②擴增含人為引入錯配堿基日2-微管蛋白基因片段的內(nèi)引物對上游引物 Hind3F 5' -CGATCGCATAATGGC 囚 A § CT-3‘ 下游引物 Hind3R 5' -GGGTCCTCTCGTAGATATCG-3‘
全文摘要
本發(fā)明屬于禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)對多菌靈產(chǎn)生中等抗性水平菌株的分子檢測方法，可用于引起小麥赤霉病的禾谷鐮孢菌對多菌靈的抗藥性監(jiān)測和流行預(yù)警。該檢測方法共分3個主要步驟，(1)分別提取待測菌株的核基因組DNA；(2)運用內(nèi)外引物對進行巢式PCR反應(yīng)，獲得目標片段；(3)將目標片段用限制性內(nèi)切酶HindIII和TaaI(Tsp4CI)分別酶切，從酶切產(chǎn)物電泳圖譜可以準確鑒定中等抗性菌株基因型。采用PIRA-PCR(Primer-introduced restriction analysis PCR)技術(shù)可以快速、準確地檢測出田間中等抗藥性禾谷鐮孢菌的數(shù)量及其在群體中的比例。檢測準確率達95％以上。
文檔編號C12Q1/04GK101985653SQ20101024702
公開日2011年3月16日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者周明國, 王建新, 羅卿權(quán), 陳長軍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)