專利名稱：一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞公共庫(kù)的建庫(kù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞公共庫(kù)的建庫(kù)方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于 發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和 促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。如間充質(zhì)干細(xì)胞在 體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、 內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種 子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用于解決多種血液系統(tǒng)疾病，心血管疾病，肝硬化，神經(jīng)系統(tǒng) 疾病，膝關(guān)節(jié)半月板部分切除損傷修復(fù)，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了很 多病患的生命。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞還用于糖尿病及其并發(fā)癥、下肢缺血病變、心腦血管疾 病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、腦和脊髓神經(jīng)損傷、老年癡呆及紅斑狼瘡和硬皮病等自 身免疫性疾病的治療研究，已經(jīng)取得的臨床試驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞。間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛分布于胎兒和成體的骨髓、骨膜、松骨質(zhì)、脂肪、滑膜、骨骼肌、 胎肝、乳牙、臍帶、臍帶血中，其中臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量高、純凈、數(shù)量多。臍帶來(lái) 源的間充質(zhì)干細(xì)胞不但能夠成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代物，而且具有更大的應(yīng)用潛 能。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)多種胚胎干細(xì)胞的特有分子標(biāo)志，具有分化潛力大、增殖能力 強(qiáng)、免疫原性低、取材方便、無(wú)道德倫理問(wèn)題的限制、易于工業(yè)化制備等特征，因此有可能成 為最具臨床應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞。干細(xì)胞庫(kù)是在約為_(kāi)196°C液氮中儲(chǔ)存干細(xì)胞或相關(guān)資料的場(chǎng)所。骨髓和外周血干 細(xì)胞庫(kù)可分為資料庫(kù)和實(shí)物庫(kù)。資料庫(kù)所做的工作是將健康者提供的骨髓或外周血干細(xì)胞 進(jìn)行HLA配型和資料登記，待需要時(shí)再采集其骨髓。實(shí)物庫(kù)則是在進(jìn)行細(xì)胞配型和資料登 記的同時(shí)，采集和儲(chǔ)存健康提供者可供移植用的干細(xì)胞。干細(xì)胞庫(kù)按提供方式又分為公共 庫(kù)和自體庫(kù)。公共庫(kù)所儲(chǔ)存的干細(xì)胞是他人的干細(xì)胞，以滿足需要移植但自體干細(xì)胞沒(méi)有 保存的病人的需求?，F(xiàn)有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，由下述步驟組成(1)取人臍帶進(jìn)行檢測(cè)， 用緩沖液沖洗去除殘留血液，剪碎，獲得人臍帶組織；(2)加入膠原酶消化；(3)加入緩沖液 稀釋消化后組織，混勻、離心；(4)棄上清，加入緩沖液重懸沉淀，過(guò)篩，收集濾液，離心，重 復(fù)兩次，即得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；(5)將獲得的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞置液氮保存，按ABO/ Rh分型和HLA分型進(jìn)行保存，建立可供檢索的細(xì)胞信息檔案，即構(gòu)建出人臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞庫(kù)?，F(xiàn)有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法有以下不足。一是耗時(shí)長(zhǎng)。公共庫(kù)將干細(xì)胞制 備出后凍存，每份干細(xì)胞入庫(kù)周期長(zhǎng)，步驟繁瑣。二是成本高。供者臍帶捐出后，存在公共 庫(kù)，等待需要的受者使用，在使用前每份臍帶都制備出干細(xì)胞再凍存，所耗用試劑、材料、人工等較多，不是每一份干細(xì)胞都會(huì)用上，這就使得公共庫(kù)的成本增高。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，克服耗時(shí)長(zhǎng)、成本高的缺陷，簡(jiǎn)化操作步驟，減少人工 操作的干預(yù)錯(cuò)誤，提高效率。本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，包括以下步驟1.取臍帶用含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液，輕輕沖洗臍帶；2.取6-8cm長(zhǎng)臍帶，加入2ml含體積比10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在4°C下盡 快剪切臍帶，大小至0. 5-lmm3 ；3.收集臍帶組織塊，在850g條件下4°C離心IOmin ；4.棄上清，沉淀的組織塊用二甲基亞砜與胎牛血清按體積比2 8的比例混合的 凍存液重懸；5.分裝入凍存管中，降溫至_196°C，轉(zhuǎn)入液氮保存；6.按供者ABO/Rh血型和性別進(jìn)行保存，建立可供檢索的細(xì)胞信息檔案；7.使用時(shí)再進(jìn)行臍帶組織塊復(fù)蘇和原代培養(yǎng)、干細(xì)胞傳代培養(yǎng)、干細(xì)胞凍存操作。上述臍帶組織塊復(fù)蘇、原代培養(yǎng)可采用以下操作1.從液氮中取出需要復(fù)蘇的組織塊，立即放入42°C無(wú)菌水浴箱中勻速反復(fù)搖晃， 使其在2min中內(nèi)融化；2.取出其中的組織塊加入到含體積比10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，充分混 勻；3.在4°C，850g條件下，離心lOmin，棄上清液，用含體積比10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸組織塊，接種，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4.至24小時(shí)，補(bǔ)加培養(yǎng)基，以后每3天換一次培養(yǎng)基；5.至12-17天，可以選擇干細(xì)胞傳代培養(yǎng)或者凍存。上述凍存臍帶組織塊源MSC傳代培養(yǎng)可采用以下操作1.棄盡培養(yǎng)皿中殘留培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗兩遍；2.培養(yǎng)皿加入2ml含體積比0. 25%胰蛋白酶的PBS緩沖液消化，待細(xì)胞間隙增 大，細(xì)胞變短則將胰蛋白酶棄掉；倒置顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞變圓則每個(gè)培養(yǎng)皿各加入6ml含體 積比10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，終止消化并吹打細(xì)胞；3.將漂浮的細(xì)胞收集到離心管中，混勻細(xì)胞；4.細(xì)胞懸液按照8000-10000/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。上述凍存臍帶組織塊源MSC凍存可采取以下操作1.棄每個(gè)培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗兩遍；2.加入2ml含體積比0. 25%胰蛋白酶的PBS緩沖液消化，待細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞 變短則將胰蛋白酶棄掉；倒置顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞變圓則每個(gè)培養(yǎng)皿各加入6ml含體積比10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，終止消化并吹打細(xì)胞；3.將漂浮的細(xì)胞收集到離心管中，混勻細(xì)胞；4.取部分細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合50-80%時(shí)在4°C、600g條件下離心lOmin，棄上清液，將細(xì)胞彈起，加入提前預(yù)冷的凍存液凍存。


圖1 臍帶組織塊源間充質(zhì)干細(xì)胞原代(IOX)圖2 臍帶組織塊源間充質(zhì)干細(xì)胞P1、P2代(IOX)圖3 臍帶組織塊源間充質(zhì)干細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果技術(shù)效果本發(fā)明的構(gòu)建臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)的方法，簡(jiǎn)化操作步驟，減少人工操作的干預(yù) 錯(cuò)誤，提高效率，節(jié)約成本。
具體實(shí)施例方式一、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建步驟1.取臍帶進(jìn)行血型檢測(cè)(包括ABO/Rh血型檢測(cè))、微生物免疫檢測(cè)，臍帶用含 100kU/L青霉素及100mg/L鏈霉素的PBS緩沖液，輕輕沖洗臍帶。所述的青霉素/鏈霉素溶 液購(gòu)自美國(guó) ScienCell 公司，P/S (Penicillin/Str 印 tomycin Solution)。2.選臍帶樣本光亮度好，無(wú)破損，無(wú)水腫區(qū)域，取6_8cm長(zhǎng)。3.加入2ml含體積比10% FBS (胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基，在4°C下盡快剪切臍 帶，大小至0. 5-lmm3。4.收集臍帶組織塊，在850g條件下4°C離心lOmin。5.棄上清，沉淀的組織塊用DMSO( 二甲基亞砜)與FBS按體積比2 8的比例混 合的凍存液重懸。6.分裝入5ml凍存管中，(程控)降溫至_196°C，轉(zhuǎn)入液氮保存。7.按供者ΑΒΟ/Rh血型和性別進(jìn)行保存，建立可供檢索的細(xì)胞信息檔案。8.使用時(shí)再進(jìn)行臍帶組織塊復(fù)蘇和原代培養(yǎng)、干細(xì)胞傳代培養(yǎng)、干細(xì)胞凍存等操作。二、臍帶組織塊復(fù)蘇、原代培養(yǎng)操作(見(jiàn)圖1)1.從液氮中取出需要復(fù)蘇的組織塊，立即放入42°C無(wú)菌水浴箱中勻速反復(fù)搖晃， 使其在2min中內(nèi)融化。2.取出其中的組織塊加入到含體積比10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自Hyclone公 司)中，充分混勻。3.在4°C，850g條件下，離心lOmin，棄上清液，用含體積比10% FBS的DMEM培養(yǎng) 基重懸組織塊(3-4ml組織塊沉淀加Iml培養(yǎng)基重懸)，接種，在37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.至24h (小時(shí))，補(bǔ)加培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿補(bǔ)加2ml新鮮含體積比10 % FBS的 DMEM培養(yǎng)基(不棄原來(lái)的培養(yǎng)基，只是添加新鮮的培養(yǎng)基)，以后每3天換一次培養(yǎng)基(棄 去舊的培養(yǎng)基加入等量新鮮培養(yǎng)基)。5.至15天左右，細(xì)胞克隆數(shù)量增多，克隆內(nèi)細(xì)胞融合60-90%，可以選擇細(xì)胞傳代 或者凍存。三、凍存臍帶組織塊源MSC傳代培養(yǎng)操作(圖2)
1.棄盡培養(yǎng)皿中殘留培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗兩遍。2.培養(yǎng)皿加入2ml含體積比0. 25%胰蛋白酶的PBS緩沖液消化，待細(xì)胞間隙增 大，細(xì)胞變短則將胰蛋白酶棄掉(在細(xì)胞沒(méi)有漂浮前棄掉胰蛋白酶)；倒置顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞 變圓則每個(gè)培養(yǎng)皿各加入6ml含體積比10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，終止消化并吹打細(xì)胞。3.將漂浮的細(xì)胞收集到50ml離心管中，混勻細(xì)胞，計(jì)細(xì)胞數(shù)量及活力。4.細(xì)胞懸液按照8000-10000/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，置于37°C，5%C02的培養(yǎng) 才苜培養(yǎng)。四、凍存臍帶組織塊源MSC凍存操作(圖3)1.每個(gè)培養(yǎng)皿留取2ml培養(yǎng)基，以備需氧菌及真菌檢測(cè)之用，棄余下培養(yǎng)基，用 PBS緩沖液沖洗兩遍。2.加入2ml含體積比0. 25%胰蛋白酶的PBS緩沖液消化，待細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞 變短則將胰蛋白酶棄掉(在細(xì)胞沒(méi)有漂浮前棄掉胰蛋白酶)；倒置顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞變圓則 每個(gè)培養(yǎng)皿各加入6ml含體積比10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，終止消化并吹打細(xì)胞。3.將漂浮的細(xì)胞收集到50ml離心管中，混勻細(xì)胞，計(jì)細(xì)胞數(shù)量及活力。4.將上述每個(gè)培養(yǎng)皿中留取的培養(yǎng)基用無(wú)菌注射器打入需氧菌檢測(cè)瓶中，置細(xì)菌 培養(yǎng)儀中培養(yǎng)15天，檢測(cè)需氧菌及真菌。5.取部分細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，置于37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合 50-80%時(shí)用于支原體檢測(cè)；留取5X IO5-IX IO6細(xì)胞，以用于流式細(xì)胞儀鑒定，鑒定指標(biāo)為 CD34, CD45, CD44, CD105, CD146, HLA-DR06.剩余細(xì)胞懸液，在4°C、600g條件下離心lOmin，棄上清液，將細(xì)胞彈起，加入提 前預(yù)冷的凍存液(用DMSO(二甲基亞砜)與FBS按體積比2 8的比例混合的凍存液)，凍存。
權(quán)利要求
一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟1)取臍帶用含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液，輕輕沖洗臍帶；2)取6 8cm長(zhǎng)臍帶，加入含體積比10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在4℃下盡快剪切臍帶，大小至0.5 1mm3；3)收集臍帶組織塊，在850g條件下4℃離心10min；4)棄上清，沉淀的組織塊用二甲基亞砜與胎牛血清按體積比2∶8的比例混合的凍存液重懸；5)分裝入凍存管中，降溫至 196℃，轉(zhuǎn)入液氮保存；6)按供者ABO/Rh血型和性別進(jìn)行保存，建立可供檢索的細(xì)胞信息檔案；7)使用時(shí)再進(jìn)行臍帶組織塊復(fù)蘇和原代培養(yǎng)、干細(xì)胞傳代培養(yǎng)、干細(xì)胞凍存操作。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的臍帶組織塊復(fù)蘇和原代培養(yǎng)包括以下 步驟1)從液氮中取出需要復(fù)蘇的組織塊，立即放入42°C浴箱中勻速反復(fù)搖晃，使其在2min 中內(nèi)融化；2)取出其中的組織塊加入到含體積比10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，充分混勻；3)在4°C，850g條件下，離心lOmin，棄上清液，用含體積比10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng) 基重懸組織塊，接種，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4)至24小時(shí)，補(bǔ)加培養(yǎng)基，以后每3天換一次培養(yǎng)基；5)至12-17天，可以選擇干細(xì)胞傳代培養(yǎng)或者凍存。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的干細(xì)胞傳代培養(yǎng)包括以下步驟1)棄盡培養(yǎng)皿中殘留培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗兩遍；2)培養(yǎng)皿加入含體積比0.25%胰蛋白酶的PBS緩沖液消化，待細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變 短則將胰蛋白酶棄掉；倒置顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞變圓則每個(gè)培養(yǎng)皿各加入含體積比10%胎牛 血清的DMEM培養(yǎng)基，終止消化并吹打細(xì)胞；3)將漂浮的細(xì)胞收集到離心管中，混勻細(xì)胞；4)細(xì)胞懸液按照8000-10000/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的干細(xì)胞凍存包括以下步驟1)棄每個(gè)培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗兩遍；2)加入含體積比0.25%胰蛋白酶的PBS緩沖液消化，待細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變短則將 胰蛋白酶棄掉；倒置顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞變圓則每個(gè)培養(yǎng)皿各加入含體積比10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基，終止消化并吹打細(xì)胞；3)將漂浮的細(xì)胞收集到離心管中，混勻細(xì)胞；4)取細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合50-80%時(shí)在4°C、600g條件 下離心lOmin，棄上清液，將細(xì)胞彈起，加入提前預(yù)冷的凍存液凍存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞公共庫(kù)的建庫(kù)方法，克服耗時(shí)長(zhǎng)、成本高的缺陷，簡(jiǎn)化操作步驟，減少人工操作的干預(yù)錯(cuò)誤，提高效率。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK101922048SQ201010246400
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者張學(xué)峰, 張美榮, 王麗, 胡建霞, 高宏, 魏斯溧 申請(qǐng)人:青島奧克生物開(kāi)發(fā)有限公司