專利名稱：蛭弧菌混合體在防控生魚片制作過程中的細(xì)菌的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的是一種利用該蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體制成的蛭 弧菌液，在防控生魚片制作關(guān)鍵環(huán)節(jié)菌落總數(shù)和致病菌的應(yīng)用，特別是應(yīng)用于制作生魚片 的生鮮原料加工初洗時(shí)生魚片減菌，操作臺、加工車間、操作工具的消毒殺菌。
背景技術(shù)：
生食魚片近年來倍受到消費(fèi)者的喜愛，特別在日本料理中它堪稱是日本菜的代 表，食用生魚片在日本已有較長的歷史，近年來，在我國尤其是沿海地區(qū)，餐飲業(yè)也相繼盛 行食用生魚片。生魚片的加工工藝流程大概包括選料，暫養(yǎng)，放血，初洗，開片，去皮，磨皮， 修整，分級，清潔，裝盤，如果是立即食用，加配飾料，再加上佐料就可以馬上食用；非立即食 用，裝盤后可以急凍，稱重包裝，冷凍貯藏。由于生魚片是以鮮活(鮮凍)的魚類為原料，經(jīng) 過處理后直接食用，這些產(chǎn)品本身可能帶菌或者在制作加工過程中污染上病原微生物，引 起食物中毒。造成生魚片食源性中毒的微生物主要包括原料自身攜帶，海產(chǎn)魚帶有弧菌屬、 假單胞菌屬、無色桿菌屬及黃桿菌屬等細(xì)菌，淡水魚常常有假單胞菌屬、氣單胞菌屬等。如 受生活用水污染，則魚體可能帶有腸道致病菌，如沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、致病性大腸埃 希氏菌屬等。這些細(xì)菌多分布在魚的體表、腸腔等處。另外在整個(gè)生魚片的制作過程中，操 作工具和操作臺也可能使生魚片染菌。蛭弧菌是寄生于其他細(xì)菌，并能導(dǎo)致宿主細(xì)菌裂解的一類細(xì)菌。我們的最新研究 表明，有些蛭弧菌可以裂解包括大腸桿菌埃希氏菌屬、沙門氏菌、惡臭假單胞菌、弧菌等一 些常見生魚片攜帶致病或潛在致病性細(xì)菌。如能應(yīng)用蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體制成的蛭弧菌 液于生魚片產(chǎn)品的生鮮原料加工時(shí)生魚片減菌，操作臺、加工車間、操作工具的消毒殺菌。 則能有效地控制生魚片產(chǎn)品的菌落總數(shù)和致病菌含量，預(yù)防中毒事件的發(fā)生。蛭弧菌的生活史一般分兩個(gè)階段在宿主細(xì)菌外，可以自由游動，不進(jìn)行增殖的 游泳體階段和在特定宿主細(xì)菌的周質(zhì)空間內(nèi)進(jìn)行生長繁殖的蛭質(zhì)體階段。蛭弧菌游泳體 是指蛭弧菌侵入宿主細(xì)菌前的生長形式。蛭弧菌在游泳體階段，可以識別并與宿主發(fā)生不 可逆結(jié)合，然后侵入宿主，蛭弧菌游泳體侵入宿主細(xì)菌的過程非?？欤话銕酌腌妰?nèi)即可完 成。蛭弧菌蛭質(zhì)體是蛭弧菌在特定宿主細(xì)菌的周質(zhì)空間內(nèi)進(jìn)行生長繁殖的形式。蛭弧菌進(jìn) 入宿主菌細(xì)胞周質(zhì)空間后，主要通過降解宿主細(xì)胞的大分子營養(yǎng)物質(zhì)成為單體，然后攝入 用于提供自身生物大分子的合成。隨著細(xì)胞增殖和水解酶作用，使宿主細(xì)胞壁膜被破壞，從 而裂解釋放出蛭弧菌。已有的研究表明，作為一種有益微生物制劑，無論是在食品工業(yè)還是在(海洋) 水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域，蛭弧菌的應(yīng)用均是安全的。例如在國外，Lenz and Hespell (1978) 研究發(fā)現(xiàn)，蛭弧菌及對動物及人的細(xì)胞不具侵染性[Lenz R. W.，HespellR. B. Attempts to grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells. Archives of Microbiology, 1978,119(3) =245-248] 在國內(nèi)，林茂等(2006)研究了蛭弧菌對魚類細(xì) 胞的作用，發(fā)現(xiàn)它對魚類細(xì)菌沒有侵染作用[林茂，楊先樂，薛暉，曹海鵬，邱軍強(qiáng)。蛭弧菌BDH21 02對魚類細(xì)胞及病原菌的作用。微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(1) :7_11]。目前對生魚片 的食用前的消菌，主要用到自來水清洗，但此方法存在保質(zhì)期短，清洗不徹底，易殘留細(xì)菌 易染菌的缺陷；利用蛭弧菌液對生魚片進(jìn)行食用前的消菌，是一種無公害、無毒無副作用的 新生物方法，國內(nèi)外尚未見過有相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在保質(zhì)期短、菌數(shù)多、有潛在危害的缺陷，提供 一種蛭弧菌混合體在防控生魚片制作過程中的細(xì)菌的應(yīng)用。特別是應(yīng)用于制作生魚片關(guān)鍵 環(huán)節(jié)中的生鮮原料加工初洗時(shí)生魚片減菌，操作臺、加工車間、操作工具的消毒殺菌。能有 效地控制生魚片產(chǎn)品的菌落總數(shù)和致病菌含量，預(yù)防中毒事件的發(fā)生。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種蛭弧菌混合體在防控生魚片制作過程中的細(xì)菌的應(yīng)用，所述蛭弧菌菌株為蛭 弧菌(Bdellovibrio sp. Strain)BDMO1,由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其簡稱為CCTCC， 保藏編號為CCTCC NO =M 208066，上述保藏單位的保藏地址為湖北省武漢市珞珈山武 漢大學(xué)內(nèi)，保藏時(shí)間為2008年4月28日；所述蛭弧菌BDMOl (CCTCC M208066)由蛭弧菌 BDJOl (CCTCC M208011)進(jìn)行紫外誘變得到，對其進(jìn)行負(fù)染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察該 蛭弧菌呈單細(xì)胞，弧形，大小為1. 7 X 1. 0 μ m，端生鞭毛，鞭毛長度為3. 5 μ m ；將其以雙層平 板法于28°C培養(yǎng)三天可形成直徑3-4mm的透明圓形噬菌斑。將上述菌株制成蛭弧菌蛭質(zhì)體 和游泳體的混合體菌液作為殺菌劑用于生魚片制作過程中，以防控生魚片上的菌落總數(shù)和 致病菌，其中菌落總數(shù)指的是生魚片上所有的細(xì)菌總數(shù)，致病菌指的是沙門氏菌屬、大腸桿 菌埃希氏菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬等對人體有害的細(xì)菌。優(yōu)選地，所述蛭弧菌混合體菌液是由蛭弧菌游泳體和蛭弧菌蛭質(zhì)體按細(xì)菌數(shù) 1 1混合而成。優(yōu)選地，所述蛭弧菌混合體菌液的濃度為IO1 109pfu/mL。優(yōu)選地，所述蛭弧菌混合體菌液采用擦涂、噴灑或浸泡的方式作用于生魚片生鮮 原料或操作工具，或者采用擦涂、噴灑的方式作用于操作臺或加工車間。優(yōu)選地，所述浸泡時(shí)間為15 45秒。優(yōu)選地，所述浸泡時(shí)間為30秒。優(yōu)選地，對生魚片生鮮原料殺菌時(shí)，蛭弧菌混合體菌液的濃度為IO2 109pfu/mL。優(yōu)選地，對生魚片操作工具殺菌時(shí)，蛭弧菌混合體菌液的濃度為IO1 109pfu/mL。優(yōu)選地，所述擦涂、噴灑時(shí)，蛭弧菌混合體菌液的使用量為10 100mL/m2。優(yōu)選地，所述蛭弧菌混合體菌液的制備方法如下在含有乳鏈球菌(Sti^ptococcus lactis)的 DNB(dilute nutrient broth)的 DNB液體培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，溶于IOOOml蒸 餾水中，PH值為7. 2 7. 6)中接入蛭弧菌，于25 35 °C、150 300rpm培養(yǎng)36 48h，培 養(yǎng)液經(jīng)4°C 6000 8000rpm離心15 20min后，去除含蛭弧菌游泳體的上清，得到的沉淀 即是蛭弧菌蛭質(zhì)體；將所述含蛭弧菌游泳體的上清經(jīng)16000 18000rpm離心15 20min 后，得到的沉淀即是所述的蛭弧菌游泳體；將上述得到的蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體用DNB液體培養(yǎng)基、無菌水、生理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液中的一種進(jìn)行分別懸浮，得到兩種菌液，混合 后，即得到蛭弧菌混合體菌液。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果1、本發(fā)明所述蛭弧菌液在防控生魚片產(chǎn)品菌落總數(shù)和致病菌含量效果顯著。所述蛭弧菌液在防控生魚片中的菌落總數(shù)和致病菌效果，如圖3、圖4、圖5、圖8所 示。所述的蛭弧菌液對生魚片菌落總數(shù)和致病菌消除作用，使得菌落總數(shù)含量能夠得到很 好的控制，致病菌在優(yōu)選范圍內(nèi)不存在。本應(yīng)用方法特別適用于生魚片生產(chǎn)加工過程中的 消菌處理，為日本料理提供優(yōu)質(zhì)原材料和加工上的便利，確保生魚片制作過程中產(chǎn)品的優(yōu) 質(zhì)，有效地解決了食品安全問題。2、采用本發(fā)明防控生魚片生鮮原料加工初洗時(shí)的減菌安全性好，操作方便。利用由蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體混合液制成的蛭弧菌液防控生魚片生鮮原料加工 初洗時(shí)菌落總數(shù)和致病菌的方法是生物方法。該蛭弧菌液具有游泳體起效快、活力強(qiáng)，蛭質(zhì) 體制備、保存容易，殺菌作用時(shí)間持久和環(huán)境耐受力強(qiáng)的優(yōu)勢，使得蛭弧菌混合體適合作為 抑止或清除生物體及其環(huán)境中有害菌的生物凈化因子，且其在裂解完宿主細(xì)菌后，會因饑 餓而自動消亡，因此對人和動物無毒副作用。不僅可提高消費(fèi)者生食生魚片的安全系數(shù)，保 護(hù)消費(fèi)者的健康，也為生魚片的綠色加工生產(chǎn)提供保障。操作采用浸泡、噴灑或者擦涂的方 法，過程簡單。3、將本發(fā)明應(yīng)用于生產(chǎn)生魚片的操作臺、加工車間、操作工具的消毒殺菌，方便、 安全且效果好。把上述蛭弧菌液應(yīng)用于生產(chǎn)生魚片的操作臺、加工車間、操作工具的消毒殺菌， 有利于減少菌落總數(shù)的含量，控制致病菌的殘留，確保生魚片的優(yōu)質(zhì)。應(yīng)用于生魚片產(chǎn)品 加工操作臺和加工車間中菌落總數(shù)和致病菌的防控時(shí)，檢測結(jié)果顯示，在蛭弧菌液濃度 ≥IO1PfuAil,擦涂使用量≥ IOmVm2菌落總數(shù)在Ih后殘留率不到0. 1%，致病菌沒有檢測 出。應(yīng)用于生魚片產(chǎn)品加工操作工具中菌落總數(shù)和致病菌的防控時(shí)，檢測結(jié)果顯示，采用浸 泡方法在蛭弧菌液濃度≥IO1PfuAil時(shí)，Ih后菌落總數(shù)殘留率不到0. 2%，致病菌沒有檢測 出?？梢娫摷夹g(shù)能有效地延長生魚片產(chǎn)品在常溫或者低溫下的保藏時(shí)間，防止或延緩腐敗 變質(zhì)，使用方便、安全且效果好，直接提高了產(chǎn)品品質(zhì)。4、本發(fā)明所述蛭弧菌液適用于生魚片制作全過程中，有效地減少菌落總數(shù)含量， 控制致病菌的殘留；同時(shí)也克服了之前生魚片產(chǎn)品保質(zhì)期短、菌數(shù)多、有潛在危害的缺陷。 而且所述的蛭弧菌液作用時(shí)間長，從而可以確保生魚片產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)，從根本上避免生魚片 食物中毒事件的發(fā)生，保護(hù)了消費(fèi)者的安全。


圖1為自來水用浸漬的方法在防控金槍魚制成生魚片生鮮原料加工初洗時(shí)菌落 總數(shù)殘留率-時(shí)間圖；圖2為自來水用浸漬的方法在防控金槍魚制成生魚片生鮮原料加工初洗時(shí)致病 菌殘留率-時(shí)間圖；圖3為蛭弧菌液用浸漬的方法在防控金槍魚制成生魚片生鮮原料加工初洗時(shí)菌 落總數(shù)殘留率_濃度圖4為蛭弧菌液用浸漬的方法在防控金槍魚制成生魚片生鮮原料加工初洗時(shí)，時(shí) 間2h時(shí)制得致病菌殘留率-濃度圖；圖5為蛭弧菌液用擦涂的方法應(yīng)用于生魚片制作操作臺和車間的消毒殺菌時(shí)，采 用最低蛭弧菌液濃度IO1PfuAil,時(shí)間Ih時(shí)制得的菌落總數(shù)殘留率-擦涂量圖；圖6為自來水用擦涂的方法應(yīng)用于生魚片制作操作臺和車間的減菌時(shí)，菌落總數(shù) 殘留率-時(shí)間圖；圖7為自來水用擦涂的方法應(yīng)用于生魚片制作操作臺和車間的減菌時(shí)，致病菌殘 留率-時(shí)間圖；圖8為蛭弧菌液用浸漬的方法應(yīng)用于制作生魚片操作工具中的消毒殺菌，時(shí)間Ih 時(shí)制得的菌落總數(shù)殘留率-濃度圖；圖9為自來水用浸漬的方法應(yīng)用于制作生魚片操作工具中的消毒殺菌，菌落總數(shù) 殘留率-時(shí)間圖；圖10為自來水用浸漬的方法應(yīng)用于制作生魚片操作工具中的消毒殺菌，致病菌 殘留率-時(shí)間圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。所述沙門氏菌屬、大腸桿菌埃希氏菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬等致病菌同時(shí)出 現(xiàn)均有效，但為實(shí)驗(yàn)結(jié)果及圖表數(shù)據(jù)表達(dá)清晰，致病菌以鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium，購自廣東省微生物菌種保藏中心，編號GIM1. 237)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，購自廣東省微生物菌種保藏中心，編號GIM1. 172)和大腸桿菌(Escherichia coli，購自廣東省微生物菌種保藏中心，編號GIM 1.137)為例。實(shí)施例1蛭弧菌液在防控生魚片生鮮原料加工初洗時(shí)的菌落總數(shù)和致病菌的應(yīng)用。下面生 魚片以金槍魚為例。應(yīng)用方法包括以下具體步驟及其條件步驟一蛭弧菌液的制備蛭弧菌蛭質(zhì)體的制備在裝有IOOmL MRS液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉8g， 酵母膏粉4g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三氨2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0. 2g，硫酸錳 0. 05g，Ig吐溫80，pH值6. 0 6. 4)的錐形瓶中接種2mL濃度為1010cfu/ml的乳鏈球菌 (Streptococcus lactis,購自廣東省微生物菌種保藏中心，編號GIM1. 156)，200rpm、28°C 搖床培養(yǎng)18小時(shí)，培養(yǎng)液于4°C、5000rpm離心15min，棄上清。沉淀菌體用5mL無菌水重 新懸浮，之后加入到裝有IOOmLDNB液體培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵 母精提物0. lg，溶于1000ml蒸餾水中，pH值為7. 2 7. 6)的錐形瓶中，再加入2mL濃度為 IO3Pfu/ml 的蛭弧菌 BDM01 (CCTCC M208066)。恒溫?fù)u床 250rpm、28°C 培養(yǎng) 36h。培養(yǎng)液于 40C 6000rpm離心20min，去除含蛭弧菌游泳體的上清，保留沉淀(即蛭弧菌蛭質(zhì)體)，加入 生理鹽水懸浮蛭弧菌蛭質(zhì)體，制成濃度為IO9 liTpfu/ml的蛭弧菌蛭質(zhì)體濃縮液，待用；蛭弧菌游泳體的制備將蛭弧菌蛭質(zhì)體制備方法中的含蛭弧菌游泳體的上清經(jīng)16000rpm離心20min后，得到的沉淀即是蛭弧菌游泳體，加入DNB液體培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯
0.8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，溶于IOOOml蒸餾水中，pH值為7. 2 7. 6) 懸浮蛭弧菌游泳體，制成濃度為IO9 liTpfu/ml的蛭弧菌游泳體濃縮液，待用；蛭弧菌液由相同濃度的蛭弧菌BDMOl游泳體菌液和蛭弧菌BDMOl蛭質(zhì)體菌液按細(xì) 菌數(shù)1 1混合組成。步驟二 蛭弧菌液在防控金槍魚生魚片生鮮原料加工初洗時(shí)菌落總數(shù)和致病菌的 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)(1)鼠傷寒沙門氏菌、嗜水氣單胞菌和大腸桿菌的制備于3個(gè)含IOOmL普通營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基的錐形瓶，分別接入ImL xl03cfu/ mL的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium，購自廣東省微生物菌種保藏中心，編號 GIM1. 237)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，購自廣東省微生物菌種保藏中心，編 號GIM1. 172)和大腸桿菌(Escherichiacoli，購自廣東省微生物菌種保藏中心，編號GIM
1.137)，搖床培養(yǎng)，160rpm28°C培養(yǎng)12-16。增殖培養(yǎng)液經(jīng)5000rpm、4°C離心20min，棄上清 液，沉淀菌體用無菌水重新懸浮，使其濃度為109cfu/mL，最后制備上述三種菌的混合液，每 種菌的終濃度為105cfu/mL。(2)蛭弧菌液對金槍魚生魚片生鮮原料加工初洗時(shí)菌落總數(shù)和致病菌的防控實(shí)驗(yàn)用浸漬的方法具體過程如下用無菌刀把金槍魚的肉片切割成每塊重量相近的實(shí)驗(yàn)樣品生魚塊，每塊重約
0.25kg。試驗(yàn)設(shè)對照組和試驗(yàn)組，其中對照組三塊，為三個(gè)平行樣，剩下魚片為試驗(yàn)組，每小 組三塊，為三個(gè)平行樣。先將它們浸漬于75%的酒精中殺菌，在無菌操作臺放置至酒精發(fā) 揮干，后將它們浸漬于步驟二(1)的致病菌混合液中，致病菌混合液是指鼠傷寒沙門氏菌、 嗜水氣單胞菌和大腸桿菌的終濃度分別達(dá)到IX 105CfU/ml，30秒后取出，在無菌操作臺放 置15min使菌體自然吸附。分別測試驗(yàn)組和對照組的菌落總數(shù)和致病菌含量，然后對試驗(yàn) 組每個(gè)小組的魚片再直接浸漬在不同濃度的蛭弧菌液。將試驗(yàn)組浸漬于濃度為lObfii/ml、 102pfu/ml、103pfu/ml、105pfu/ml、107pfu/ml 或 109pfu ml 的蛭弧菌液中，每濃度均有三個(gè)平 行樣，30秒后取出；對照組的生魚片用自來水(常規(guī)方法)浸泡，30秒后取出；試驗(yàn)組和對 照組的樣品，在無菌操作臺，室溫下放置，分別于2小時(shí)和4小時(shí)檢測菌落總數(shù)和致病菌的 含量。菌落總數(shù)和致病菌具體檢測方法是每次檢測從每組試樣中取出魚片放入無菌絞肉 機(jī)中同時(shí)加入50ml的無菌蒸餾水?dāng)囁?，震蕩均勻后取原液依次用無菌蒸餾水進(jìn)行10倍稀 釋后，每個(gè)梯度取0. Iml平板涂布，培養(yǎng)24h后采用MPNOnostprobable number)方法(單 位為cfu/kg)，對細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。其中菌落總數(shù)采用營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基；致病菌檢測其 中鼠傷寒沙門氏菌的檢測采用XLDUylose-lysine-deoxycholate)選擇性培養(yǎng)基，嗜水氣 單胞菌的檢測采用RimLer-shotts (R-S培養(yǎng)基)選擇性培養(yǎng)基，大腸桿菌的檢測采用TBX (Tryptone Bile X-glucuronide)選擇性瓊脂培養(yǎng)基。檢測結(jié)果如圖1、圖2、圖3、圖4、所示，所有數(shù)據(jù)均為三個(gè)平行樣的平均值。從圖
1、圖2和圖3、圖4的比較可以看出，用蛭弧菌液浸泡的菌落總數(shù)和致病菌的殘留率低于傳 統(tǒng)用自來水浸泡的方法。從圖4和圖3可以看出，蛭弧菌液的濃度越高，菌落總數(shù)和致病菌 的殘留率越小，防控菌落總數(shù)和致病菌的能力越強(qiáng)。作用時(shí)間越久，防控效果越好。由圖3，可知在2h時(shí)各個(gè)濃度菌落總數(shù)的殘留率可以控制在以下，優(yōu)于自來水浸泡，使菌落 總數(shù)含量能夠很好的控制。而致病菌的殘留率僅在濃度為103pfu/mL，時(shí)間2h時(shí)檢測到致 病菌，其它濃度和時(shí)間為零，如圖4所示。因此，在防控金槍魚生魚片加工初洗攜帶的菌落 總數(shù)和致病菌，蛭弧菌液應(yīng)用于控制菌落總數(shù)的濃度> IO1PfuAiL,最佳使用濃度在IO2 109pfu/mL。蛭弧菌液控制致病菌的濃度彡102pfu/mL，最佳使用濃度在IO2 109pfu/mL。關(guān)于對生魚片品質(zhì)的評價(jià)，除了從上述生魚片的微生物衛(wèi)生安全方面做出檢測 外，持水力、嫩度、PH、肉色以及硬度及濕度也是考查的內(nèi)容。對持水力的考察方法采用目前通用的48小時(shí)滴水法，將肉制品懸掛在0 4°C 懸掛貯存48小時(shí)后計(jì)算失重率，結(jié)果使用蛭弧菌液的試驗(yàn)組的魚片在懸掛48h持水率均較 高，失重率平均為2.0%，而對照組的失重率平均為則為11%。由此明顯看出對照組魚片品 質(zhì)的下降。魚片顏色評價(jià)，結(jié)果是使用蛭弧菌液的試驗(yàn)組金槍魚呈現(xiàn)鮮紅色，稍有光澤；而未 使用蛭弧菌液的對照組肉色光澤暗淡，且不斷有水外滲。主觀評價(jià)可以看出未加蛭弧菌液 的(對照組)肉色明顯的劣于試驗(yàn)組。pH值測定，結(jié)果顯示未加蛭弧菌液的魚片(對照組)的PH值都接近5，這是肌肉 的持水力下降的標(biāo)志，此時(shí)的PH值對魚片的風(fēng)味產(chǎn)生較大影響，而使用蛭弧菌液的試驗(yàn)組 PH值維持在6. 0 6. 5，這說明肉的品質(zhì)保持的比對照組的好。從嫩度方面的考察，是通過嫩度儀來評估的，評估的結(jié)果兩者之間沒有很明顯的 區(qū)別，但實(shí)驗(yàn)組嫩度略微的優(yōu)于對照組。對硬度主觀評價(jià)是通過切面是否容易變形來確定的，而對濕度評價(jià)是通過切面液 體滲出的多少來確定的，結(jié)果是4h時(shí)對照組的魚片切面很容易變形，而且還有水滲出，可 以鑒定等級為滲出。試驗(yàn)組的魚片切面不容易變形，也沒有水滲出，可以鑒定等級為潮濕。從以上肉品質(zhì)的綜合鑒定來看，試驗(yàn)組的魚片品質(zhì)明顯的優(yōu)于對照組。這說明蛭 弧菌液在防控生魚片生鮮原料加工初洗時(shí)的菌落總數(shù)和致病菌方面效果顯著，產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)， 可以推廣應(yīng)用于日本料理等生魚片為材料的產(chǎn)品制作過程菌落總數(shù)和致病菌的防控。實(shí)施例2蛭弧菌液在生魚片加工操作臺和車間消毒殺菌的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)包括以下具體步驟及其條件步驟一同實(shí)施例1的步驟一步驟二 應(yīng)用蛭弧菌液于生魚片生制作操作臺和車間的消毒殺菌實(shí)驗(yàn)。采用本發(fā)明的應(yīng)用方法，選用大小規(guī)格一樣的操作臺和車間，分成多個(gè)不同試驗(yàn) 組和對照組，其中對照組三個(gè)，為三個(gè)平行樣，剩下為試驗(yàn)組，每小組三個(gè)，為三個(gè)平行樣。 分別測試驗(yàn)組和對照組的菌落總數(shù)和致病菌含量，然后在試驗(yàn)組加工生魚片操作臺和車 間的表面，均勻擦涂濃度為IO1PfuAiL的蛭弧菌液，擦涂使用量則按試驗(yàn)組的不同分別為 10mL/m2、25mL/m2、50mL/m2、70mL/m2、或100mL/m2，每個(gè)試驗(yàn)組擦涂一遍；對照組(常規(guī)方法) 用自來水擦涂，每個(gè)組擦涂一遍；室溫下放置，分別于Ih和2h檢測菌落總數(shù)和致病菌。檢 測方法同上述。操作臺和車間菌落總數(shù)的檢測結(jié)果，顯示試驗(yàn)組僅在噴灑量為10ml/m2中1小時(shí) 后檢測到菌落總數(shù)的殘留率如圖5所示，沒有檢測到致病菌，其他噴灑量的試驗(yàn)組沒有檢測到菌落總數(shù)和致病菌。對照組檢測到菌落總數(shù)的殘留率如圖6所示，致病菌的檢測結(jié)果 如圖7所示；比較圖5和圖6、圖7，可知該蛭弧菌液應(yīng)用于生魚片加工操作臺和車間的消毒 殺菌方面效果顯著，可確保生魚片產(chǎn)品品質(zhì)。由此可見，該蛭弧菌液可以廣泛地推廣應(yīng)用于 生魚片產(chǎn)品的操作環(huán)境中的消毒殺菌。實(shí)施例3蛭弧菌液應(yīng)用于生魚片加工操作工具的消毒殺菌。試驗(yàn)包括以下具體步驟及其條件步驟一同實(shí)施例1的步驟一步驟二應(yīng)用蛭弧菌液于生魚片操作工具的消毒殺菌實(shí)驗(yàn)。采用本發(fā)明的應(yīng)用方法，分成多個(gè)不同試驗(yàn)組和對照組，選規(guī)格大小一樣的刀具， 其中對照組三個(gè)，為三個(gè)平行樣，剩下為試驗(yàn)組，每小組三個(gè)，為三個(gè)平行樣。分別測試驗(yàn) 組和對照組的菌落總數(shù)和致病菌含量。然后把刀具、砧板直接浸漬在不同濃度的蛭弧菌液。 將試驗(yàn)組分別漬于濃度為 lObfu/mL、102pfu/mL、103pfu/mL、105pfu/mL、107pfu/mL 或 109pfu mL的蛭弧菌液中，每濃度均有三個(gè)平行樣，浸泡30秒取出晾干，對照組(常規(guī)方法)用自來 水浸泡30秒取出晾干，在無菌操作室，室溫下放置，分別于Ih和2h檢測菌落總數(shù)和致病菌 的含量。檢測方法同上述。菌落總數(shù)和致病菌殘留率的檢測結(jié)果，顯示僅在濃度為IO1PfuAil的試驗(yàn)組Ih檢 測到菌落總數(shù)，結(jié)果如圖8所示，沒有檢測到致病菌。其他濃度的試驗(yàn)組沒有檢測到菌落總 數(shù)和致病菌。對照組菌落總數(shù)殘留率結(jié)果如圖9所示，致病菌的檢測結(jié)果如圖10所示。比 較圖8和圖9、圖10，可知使用蛭弧菌液優(yōu)于常規(guī)的方法。本試驗(yàn)研究的結(jié)果表明該蛭弧菌 液應(yīng)用于生魚片操作工具的消毒殺菌方面效果顯著，可確保生魚片產(chǎn)品品質(zhì)。由此可見，該 蛭弧菌液可以廣泛地推廣應(yīng)用于生魚片產(chǎn)品的操作工具中的消毒殺菌。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于上述實(shí)施 例子，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
蛭弧菌混合體在防控生魚片制作過程中的細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于，所述蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.Strain)BDM01，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCC NOM208066，保藏時(shí)間為2008年4月28日；將上述菌株制成蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體的混合體菌液作為殺菌劑用于生魚片制作過程中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛭弧菌混合體菌液是由蛭弧菌游泳 體和蛭弧菌蛭質(zhì)體按細(xì)菌數(shù)11混合而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛭弧菌混合體菌液的濃度為IO1 109pfu/mLo
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛭弧菌混合體菌液采用擦 涂、噴灑或浸泡的方式作用于生魚片生鮮原料或操作工具，或者采用擦涂、噴灑的方式作用 于操作臺或加工車間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述浸泡時(shí)間為15 45秒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述浸泡時(shí)間優(yōu)選為30秒。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，對生魚片生鮮原料初洗殺菌時(shí)，蛭弧菌混 合體菌液的濃度為IO2 109pfu/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，對生魚片操作工具殺菌時(shí)，蛭弧菌混合體 菌液的濃度為IO1 109pfu/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述擦涂、噴灑時(shí)，蛭弧菌混合體菌液的 使用量為10 100mL/m2。
10.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛭弧菌混合體菌液的制備方法 如下在含有乳鏈球菌的DNB液體培養(yǎng)基中接入蛭弧菌，于25 35°C、150 300rpm培養(yǎng) 36 48h，培養(yǎng)液經(jīng)4°C 6000 8000rpm離心15 20min后，去除含蛭弧菌游泳體的上清， 得到的沉淀即是蛭弧菌蛭質(zhì)體；將所述含蛭弧菌游泳體的上清經(jīng)16000 ISOOOrpm離心 15 20min后，得到的沉淀即是所述的蛭弧菌游泳體；將上述得到的蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳 體用DNB液體培養(yǎng)基、無菌水、生理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液懸 中的一種分別進(jìn)行懸浮，得到兩種菌液，混合后，即得到蛭弧菌混合體菌液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛭弧菌在防控生魚片生產(chǎn)過程中的細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于，所述蛭弧菌菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.Strain)BDM01，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCC NOM208066，保藏時(shí)間為2008年4月28日；將上述菌株制成蛭弧菌蛭質(zhì)體和游泳體的混合體菌液作為殺菌劑用于生魚片制作過程中，特別是應(yīng)用于生產(chǎn)生魚片產(chǎn)品的生鮮原料加工時(shí)生魚片減菌，操作臺、加工車間、操作工具的消毒殺菌。本發(fā)明將蛭弧菌混合體菌液用于防治生魚片生產(chǎn)過程中可能染菌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)菌落總數(shù)和致病菌的防控，對生魚片上的常見食物中毒細(xì)菌防控效果良好，且具有無毒、對食品無副作用等特點(diǎn)，應(yīng)用前景良好。
文檔編號C12R1/01GK101991029SQ201010270889
公開日2011年3月30日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者李冬梅, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學(xué)