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      一種納米非病毒基因輸送體系及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:442569閱讀:307來源:國知局
      專利名稱:一種納米非病毒基因輸送體系及其應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域;更具體地,本發(fā)明涉及一種納米非病毒基因輸送體系及其應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨組織工程中具有十分重要的地位,是骨組織工程中種子細(xì)胞的主要來源。而滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞則在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進(jìn)程中扮演著十分重要的角色,它們也常常被作為基因治療的靶細(xì)胞。然而,這些骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞目前存在著基因轉(zhuǎn)染效率低下的問題,這成為了技術(shù)進(jìn)步的瓶頸,大大限制了臨床基因治療的開展。基因治療是指運用基因工程技術(shù)將外源基因?qū)牖颊呒?xì)胞內(nèi),以糾正或補償致病基因引起的疾病。將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)必須借助一定的技術(shù)方法。目前基因轉(zhuǎn)染的方法主要可以分為三大類,一類是生物學(xué)方法,一類是物理方法,還有一類是化學(xué)方法。生物學(xué)方法主要是指運用病毒作為載體將外源基因?qū)爰?xì)胞的技術(shù)。目前研究最多的病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,慢病毒載體,腺病毒載體,腺病毒相關(guān)病毒載體,單純皰疹病毒載體等。物理方法主要是指運用物理手段將外源基因?qū)爰?xì)胞的技術(shù)。目前常用的方法有顯微注射, 電擊穿膜,壓力滲透,超聲噴霧,粒子轟擊等方法?;瘜W(xué)方法則是指利用化學(xué)試劑將外源基因?qū)爰?xì)胞的技術(shù)。目前較常用的轉(zhuǎn)染試劑是以陽離子脂質(zhì)體為母體材料的一系列衍生物。另外利用聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)和殼聚糖(Chitosan)為母體材料的一系列衍生物也有很多的報導(dǎo)。化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑種類繁多,考慮到轉(zhuǎn)染效率、毒性等問題,不同的細(xì)胞所使用的化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑是不同的。因此,對于特定的細(xì)胞,需要找到最為合適的化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑。上述三類方法,彼此各有優(yōu)缺點,實驗者往往會根據(jù)不同的需求而使用不同的方法將外源基因?qū)爰?xì)胞。在使用不同的導(dǎo)入方法時,主要需要考慮到以下這些因素安全性,有效性,可操作性以及成本因素。比如在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的時候,往往會通過顯微注射的方法將外源基因?qū)胧芫鸭?xì)胞,或者精子和卵母細(xì)胞。但是這種方法需要實驗操作人員有很強的操作經(jīng)驗和熟練的操作技術(shù),另外顯微注射方法對儀器的要求也比較高,這對于一般的細(xì)胞轉(zhuǎn)染是不適合的?;蜉d體是攜帶外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的載體系統(tǒng),一般可以分為病毒載體和非病毒載體兩大類。這兩類載體有各自的優(yōu)缺點。病毒載體往往具有一定的免疫原性,細(xì)胞毒性,隨機整合到宿主細(xì)胞基因組所引起的致癌作用,制備較為復(fù)雜等缺點,同時其具有較為廣譜的宿主細(xì)胞,對于原代細(xì)胞有著較高的轉(zhuǎn)染效率,這是非病毒載體所難以企及的。而非病毒載體有著較好的生物相容性和較低的細(xì)胞毒性,免疫原性也幾乎沒有。但它在不同靶細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效率有著巨大的差異。這種差異主要體現(xiàn)為在原代細(xì)胞上相對較低的轉(zhuǎn)染效率,這在一定程度上制約了其在臨床上的運用。理想的基因載體應(yīng)該是低毒、高效、低成本又可操作。非病毒基因載體的低細(xì)胞毒性、低免疫原性和較好的生物相容性一直被認(rèn)為有望取代病毒載體。但是較之病毒基因載體,較低的轉(zhuǎn)染效率一直是困擾其應(yīng)用的巨大障礙。需要通過化學(xué)修飾等方法來提高非病毒基因載體的轉(zhuǎn)染效率。非病毒基因載體根據(jù)母體材料的不同可分為兩個大類,一類是陽離子脂質(zhì)體及其衍生物,另一類是陽離子聚合物及其衍生物。陽離子脂質(zhì)體主要有Lipo2000,F(xiàn)ugenee等, 它們在體外對于一些細(xì)胞系往往具有穩(wěn)定而且較高的轉(zhuǎn)染效率,這也是它們其中一些能夠成為商品化轉(zhuǎn)染試劑的一大原因。但是,陽離子脂質(zhì)體對于一些原代細(xì)胞較低的轉(zhuǎn)染效率確實制約了其在某些領(lǐng)域的運用。另外,在體內(nèi)運用陽離子脂質(zhì)體進(jìn)行基因治療時,陽離子脂質(zhì)體往往會被血液中的血清白蛋白凝聚并且沉淀下來,從而大大降低了其轉(zhuǎn)染效率。影響非病毒基因載體轉(zhuǎn)染效率的因素有很多,可以從材料學(xué)角度和生物學(xué)角度分別進(jìn)行討論和分析。理想的非病毒基因載體首先要能夠在生理pH和生理離子濃度條件下有較好的溶解性。其次它與質(zhì)粒應(yīng)有較好的復(fù)合能力,形成的復(fù)合物應(yīng)具有較為合適的粒徑和表面電位。有文獻(xiàn)報導(dǎo)認(rèn)為,粒徑小于200μπι的粒子一般通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,而粒徑介于200 μ m-500 μ m的粒子一般通過細(xì)胞質(zhì)囊微膜介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。 這兩種不同的內(nèi)吞方式會直接導(dǎo)致復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后的不同命運。前者,通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用,復(fù)合物必須經(jīng)過溶酶體才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),而后者則可以不通過溶酶體而直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。對于復(fù)合物的表面電位,目前認(rèn)為帶有少量的表面電荷(IOmV左右)是比較理想的。因為過高的表面電荷很容易在體內(nèi)的血液循環(huán)過程中與血清白蛋白發(fā)生凝聚, 而過低的表面電荷則不利于細(xì)胞表面的帶有負(fù)電荷的膜蛋白吸附這些復(fù)合物。復(fù)合物的粒徑和表面電位在很大程度上又與非病毒載體材料與外源基因的比例,即氮磷比(N/P)有關(guān)。有些情況下,復(fù)合物的形狀也會影響到轉(zhuǎn)染效率。在很多研究中發(fā)現(xiàn),相同的非病毒基因載體在不同種類的細(xì)胞中往往會有顯著不同的轉(zhuǎn)染效率。這些不同,首先體現(xiàn)在非病毒基因載體對于各種細(xì)胞的細(xì)胞毒性是不同的, 其次每一種細(xì)胞自身的生理特性也各有差異。綜上,對于不同的細(xì)胞,選擇的非病毒載體往往是不同的,本領(lǐng)域需要針對骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行研究,以開發(fā)出合適它們的轉(zhuǎn)染試劑。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的在于提供一種納米非病毒基因輸送體系及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面,提供一種將外源基因轉(zhuǎn)染入骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞中的方法,包括(1)將表達(dá)所述外源基因的表達(dá)體系與基因輸送體系混合,獲得轉(zhuǎn)染液;(2)將轉(zhuǎn)染液加入到骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞中,從而外源基因被轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中;所述的基因輸送體系是低分子量(分子量小于2000Da;較佳地分子量在 400-1500Da之間;更佳地在500_1000Da之間;更佳地在500-800之間;最佳地分子量為 600Da)的聚乙烯亞胺與環(huán)糊精的復(fù)合物。在一個優(yōu)選例中,所述的表達(dá)所述外源基因的表達(dá)體系與基因輸送體系形成復(fù)合物,培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基,得到轉(zhuǎn)染液。在另一優(yōu)選例中,所述的基因輸送體系具有式I結(jié)構(gòu)的復(fù)合物,
      權(quán)利要求
      1.一種將外源基因轉(zhuǎn)染入骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞中的方法,包括(1)將表達(dá)所述外源基因的表達(dá)體系與基因輸送體系混合,獲得轉(zhuǎn)染液;(2)將轉(zhuǎn)染液加入到骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞中,從而外源基因被轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中; 所述的基因輸送體系是低分子量的聚乙烯亞胺與環(huán)糊精的復(fù)合物。
      2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的基因輸送體系具有式I結(jié)構(gòu)的復(fù)合物,
      3.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞選自滑膜細(xì)胞,軟 骨細(xì)胞,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
      4.如權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,所述的骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
      5.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述外源基因的表達(dá)體系與基因輸送體系 混合的方法為將含有基因輸送體系的水溶液與含有表達(dá)所述外源基因的表達(dá)體系的水溶 液混合,使得基因輸送體系中的有效氮與外源基因中的有效磷的比例為20-35。
      6.如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,相對于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或滑膜細(xì)胞,基因 輸送體系中的有效氮與外源基因中的有效磷的比例為25-35。
      7.如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,相對于軟骨細(xì)胞,基因輸送體系中的有效氮 與外源基因中的有效磷的比例為20-30。
      8.式I結(jié)構(gòu)的復(fù)合物的用途,用于制備將外源基因轉(zhuǎn)染入骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞中的試劑。
      9.如權(quán)利要求8所述的用途,其特征在于,所述的骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞選自滑膜細(xì)胞,軟骨細(xì)胞,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
      10.如權(quán)利要求9所述的用途,其特征在于,所述的骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種納米非病毒基因輸送體系及其應(yīng)用。本發(fā)明首次針對骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞的特點,找到了合適的基因轉(zhuǎn)染試劑。所述的轉(zhuǎn)染試劑是低分子量聚乙烯亞胺與環(huán)糊精的復(fù)合物,將其用于將外源基因轉(zhuǎn)染入骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞中,具有很高的轉(zhuǎn)染效率,且毒性低。
      文檔編號C12N5/10GK102417914SQ201010292778
      公開日2012年4月18日 申請日期2010年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月27日
      發(fā)明者張曉玲, 戴尅戎, 湯谷平, 童海駿 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
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